Abstract
Akkumulerende data antydet at funksjonelt uttrykk for Toll-lignende reseptorer (TLRs ) i tumorceller var involvert i tumorprogresjon. Vår tidligere studie viste at TLR9 aliserte kunne øke tumorprogresjon av humane lungekreftceller in vitro og in vivo. Vi viste videre at Mir-574-5p var det stort sett oppregulert miRNA i humane lungekreftceller under TLR9 signalering av miRNA rekke analyse. Her preges vi den potensielle rolle miRNA-574-5p i forbedret tumorprogresjon indusert av TLR9 signalering i menneskelig lungekreft. Vi bekreftet at TLR9 signale effektivt forhøyet uttrykk av MIR-574-5p i humane lungekreftceller. Spesielt, fant vi at nedregulering av miRNA-574-5p hjelp MIR-574-5p hemmer in vitro eller MIR-574-5p svamp in vivo betydelig avskaffet forbedret tumorprogresjon indusert av TLR9 signalering. Videre studier viste at Mir-574-5p var en viktig aktør i forbindelse med økt tumorprogresjon av humane lungekreftceller. Spesielt, identifiserte vi sjekkpunkt suppressor 1 (Ches1) som den dominerende direkte mål for miRNA-574-5p å gi den TLR9 signaliserer økt tumorprogresjon. Vi har vist at overekspresjon av Ches1 vesentlig hemmet cellesyklusen oppføring av humane lungekreftceller. Til slutt, vi viste at uttrykket av MIR-574-5p var positivt korrelert med TLR9 og omvendt korrelert med Ches1 i lungekreftpasienter. Våre funn ikke bare muliggjort ytterligere forståelse av krysstale mellom mirnas og TLR’ene i tumorbiologi, men også tilveiebrakt nye potensielle kandidater for behandling av kreft
relasjon:. Li Q, Li X, Z Guo, Xu F, Xia J, Liu Z, et al. (2012) mikroRNA-574-5p Var Pivotal for TLR9 Signa Forbedret tumorprogresjon via nedregulere Checkpoint lyddemper 1 i Human lungekreft. PLoS ONE 7 (11): e48278. doi: 10,1371 /journal.pone.0048278
Redaktør: Dean G. Tang, The University of Texas M.D Anderson Cancer Center, USA
mottatt: 17 juli 2012; Godkjent: 21 september 2012; Publisert: 02.11.2012
Copyright: © 2012 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Fond for naturvitenskap og teknologi Institutt for Pudong New Area (PKJ2011-Y33), National Natural Science Foundation of China (81071744), Shanghai Pudong New Area Faglig Leder i Health System (PWRd2010-01), Basic Research Program støttes av Shanghai Committee of Science and Technology (11JC1410900), og Qianjiang talent-prosjektet for naturvitenskap og teknologi Institutt for Zhejiang-provinsen (2010R10080). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
oppdagelsen av en rekke medfødte immun-spesifikke reseptorer aktiveres av patogen-forbundet molekylære mønstre ført til en ny forståelse av medfødt immunitet mekanismer. Blant de medfødte immunspesifikke reseptorer, de beste kjennetegnet er de Toll-lignende reseptorer (TLR), som anerkjenner en rekke patogen-assosiert molekylære mønstre, er i hovedsak uttrykt på immunceller og spiller en viktig rolle i medfødt og adaptiv immunitet [ ,,,0],1] – [3]. Interessant nok en økende mengde litteratur viser at funksjonelle TLR’ene ble også vidt uttrykt på en rekke tumorceller, inkludert bryst, hjerne, mage og lunge kreftceller [4]. Akkumulerende data viste at TLR’ene agonist kunne fremme invasjon og forsterke metastatisk potensial av tumorceller, noe som indikerer at aktivering av TLR’ene signalering i tumorceller var involvert i tumoren progress [5] – [8]. Vår tidligere studien viste at CpG-oligodeoksynukleotider (CpG ODNs), som var under undersøkelse som adjuvant i terapi mot infeksjoner og kreft, effektivt kunne aktivere TLR9 signalveien i humane lungekreftceller og således fremmet tumorprogresjon både in vitro og in vivo [ ,,,0],3], [4], [9] – [11]. Vi viste videre at oppregulering av cyclin-avhengige kinase 2 (CDK2) var kritisk for TLR9 signalering for å stimulere proliferasjon og cellesyklus oppføring av humane lungekreftceller [4]. Men de nøyaktige mekanismene for hvordan TLR9 signale var involvert i tumorprogresjon av menneskelig lungekreft var fortsatt langt mindre klart.
microRNAs (mirnas) har dukket opp som en stor klasse av genekspresjon regulatorer, post-transcriptionally regulerer gen uttrykket gjennom baseparing til delvis komplementære områder for å forhindre akkumulering av proteiner ved å undertrykke oversettelse eller ved å fremkalle mRNA degradering, som er knyttet til de fleste biologiske funksjoner, inkludert tumorbiologi [12], [13]. Samler data antydet at mirnas var effektive og nye biomarkører for lungekreft diagnose, prognose og behandling [14], [15]. I mellomtiden mirnas ble også implisert i regulering av de biologiske effektene av TLR’ene signalering [16] – [18]. For å undersøke den potensielle rolle miRNAs i økt tumorprogresjon av humane lungekreftceller på TLR9 agonist stimulering, utførte vi miRNA microarray analyse for å påvise uttrykk profilen til miRNA i 95D celler med eller uten behandling av CpG ODNs, og funnet ut at CpG ODNs stimulering vekslet miRNA ekspresjonsprofilen i 95D-celler, og forskjellen i uttrykkene for 23 mirnas mellom CpG ODNs gruppen behandlet og ubehandlet gruppe var minst to ganger, blant hvilke miRNA-574-5p var det meste oppregulert miRNA i CpG ODNs stimulerte 95D-celler sammenlignet med den ubehandlede gruppe [19]. Men fortsatt gjenstår det mulig effekt av miRNA-574-5p på forbedret tumorprogresjon indusert av TLR9 signalering som skal belyses.
For å løse dette problemet, her preget vi effekten av miRNA-574-5p som var oppregulert etter TLR9 signalisering i humane lungekreftceller. Vi fant ut at miRNA-574-5p var avgjørende for TLR9 signalering for å øke tumorprogresjon av humane lungekreftceller. Videre studier viste at sjekkpunkt Lyddemper 1 (Ches1) var en dominerende direkte mål for miRNA-574-5p å gi den TLR9 signaliserer økt tumorprogresjon. Disse funnene utvidet tidligere studier og gitt en ny innsikt i forståelsen av mirnas i den funksjonelle ekspresjon av TLR9 i tumorceller.
(a) 95D-celler ble behandlet med 10 ug /ml CpG ODNs eller kontroll CpG ODNs for den angitte tiden og oppdaget for deres spredning. (B) Grupper av åtte nakne mus ble utfordret med 2 × 10
6 av 95D celler. Fem dager senere, ble tumorbærende mus injisert in situ med 100 ug CpG ODNs 7 dagers mellomrom. Kontrollgruppen fikk lik dose av styre CpG ODNs eller lik volumet av mediet. Den tumorstørrelse ble bestemt. Hver søyle representerer midlene (± SD) fra åtte hårløse mus i hver gruppe. (C) 95D-celler ble behandlet med den angitte dosen av CpG ODNs i 72 timer og deretter analysert for deres ekspresjon av MIR-574-5p. (D) 95D-celler ble behandlet med 10 ug /ml CpG ODNs for den angitte tid og analysert for deres ekspresjon av MIR-574-5p. (E) 95D-celler ble behandlet med 10 ug /ml CpG ODNs i nærvær av den angitte dose av klorokin i 72 timer og deretter analysert for deres ekspresjon av MIR-574-5p. (F) 95D-celler ble behandlet med 10 ug /ml CpG ODNs i nærvær av den angitte dosen av MyD88 inhiberende peptid (Pepinh-MyD88) eller kontroll peptid (Pepinh-kontroll) i 72 timer og deretter analysert for deres ekspresjon av mir -574-5p. Feilfelt angitt standardavvik tredoble målinger fra tre uavhengige eksperimenter.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle pasientene i denne studien fikk skriftlig informert samtykke, og den menneskelige studien ble godkjent av etikkomiteen av Tongji University (Permit nummer~~POS=HEADCOMP: 20090128). Alle dyreforsøk ble utført i henhold til Guide for omsorg og bruk av medisinske forsøksdyr og med etisk godkjenning av Shanghai Medical Laboratory Animal Care og bruk komité samt Etisk komité Tongji University (Permit Nummer: 20110016).
(A) 95D celler ble transfektert med MIR-574-5p inhibitor i 48 timer og deretter analysert for deres uttrykk for MIR-574-5p. (B) 95D-celler ble transfektert med MIR-574-5p-inhibitor eller kontroll henholdsvis, og deretter stimulert med 10 ug /ml CpG ODNs for den angitte tid. Feilstolper indikerte standardavvik av triplikat-målinger danne tre uavhengige eksperimenter. (C) Forbedret aktivitet av MIR-574-5p-regulert reporter ble oppnådd ved infeksjon av 95D celler med MIR-574-5p svamp. (D og E) Grupper av åtte nakne mus ble utfordret med 2 × 10
6 av 95D celler som ble stabilt transfektert med MIR-574-5p svamp vektor eller kontroll vektor. Fem dager senere, ble tumorbærende mus injisert in situ med 100 ug CpG ODNs 7 dagers mellomrom. Den tumorstørrelse og overlevelsestiden av tumorbærende mus ble bestemt. Hver søyle representerer midlene (± SD) fra åtte hårløse mus i hver gruppe. * P. 0,05
Pasienter
Mellom juni 2009 og mars 2012, samlet vi tumorprøver fra pasienter med lungekreft i East Hospital, Shanghai, Kina. Studiegruppen (n = 23) består kjemoterapi og strålebehandling naive pasienter med lungekreft. Gjennomgang av patologi rapporter bekreftet diagnosen. Individer med autoimmune sykdommer (f.eks revmatoid artritt, systemisk lupus erythematosus), kroniske infeksjoner (f.eks humant immunsviktvirus infeksjon, tuberkulose), benmarg engasjement, antikoagulerende og antitrombotiske narkotika bruker, eller de som hadde fått immunsuppressiv behandling ble ekskludert. Informasjon angående klinisk patologiske karakteristika for pasienter ble sammenfattet i tabell 1.
(a) 95D-celler ble transfektert med MIR-574-5p etterligner eller kontroll henholdsvis, og deretter analysert for deres proliferasjon ved den angitte tid. (B) 95D-celler ble transfektert med MIR-574-5p-inhibitor eller kontroll henholdsvis, og deretter analysert for deres proliferasjon ved den angitte tid. Feilstolper indikerte standardavvik av triplikat-målinger danne tre uavhengige eksperimenter. (C-F) Grupper av åtte nakne mus ble utfordret med 2 × 10
6 av 95D celler som ble stabilt transfektert med MIR-574-5p ekspresjonsvektor eller MIR-574-5p svamp vektor henholdsvis, og deretter analysert for deres tumorprogresjon hos nakne mus ved den angitte tid. Overlevelsestiden av tumorbærende mus ble også bestemt. Hver søyle representerer midler (± SD) fra åtte hårløse mus i hver gruppe.
Mus
Kvinne BALB /c naken mus mellom 6 og 8 ukers alder ble kjøpt fra center of forsøksdyr av Tongji University. Alle mus ble plassert i et patogen-frie mus koloni ved vår institusjon.
(A) 95D celler ble transfektert med MIR-574-5p inhibitor i 48 timer og deretter analysert for deres uttrykk for de angitte gener ved hjelp av real time PCR. (B) 95D-celler ble transfektert med MIR-574-5p inhibitor i 48 timer og deretter analysert for deres ekspresjon av Ches1 ved hjelp av western blot. Den relative intensiteten til Ches1 proteinnivå fra tre uavhengige eksperimenter ble vist. (C) 95D-celler ble ko-transfektert med MIR-574-5p etterligner og et luciferase reporter som inneholder den brede typen Ches1 3 «UTR eller mutert Ches1 3» UTR. (D) 95D-celler ble trasnfected med Ches1 ekspresjonsvektor i 48 timer og deretter analysert for deres ekspresjon av Ches1 proteinnivå. (E) 95D-celler ble ko-transfektert med MIR-574-5p etterligner og Ches1 ekspresjonsvektor, og deretter analysert for deres proliferasjon. (F) Grupper av åtte nakne mus ble utfordret med 2 × 10
6 av 95D celler som ble stabilt transfektert med MIR-574-5p ekspresjonsvektor pluss Ches1 uttrykk vektor eller dens kontroll, og deretter analysert for deres tumorprogresjon på angitt tid. (G) 95D-celler ble transfektert med Ches1 ekspresjonsvektor, og deretter stimulert med 10 ug /ml CpG ODNs for den angitte tid. (H) Grupper av åtte nakne mus ble utfordret med 2 × 10
6 av 95D celler som ble stabilt transfektert med Ches1 ekspresjonsvektor eller kontroll vektor. Fem dager senere, ble tumorbærende mus injisert in situ med 100 ug CpG ODNs 7 dagers mellomrom. Svulsten ble bestemt ved den angitte tiden. Hver søyle representerer midler (± SD) fra åtte hårløse mus i hver gruppe.
Reagenser og cellelinje
CpG ODN2216, kontrollere CpG ODN, klorokin og hemmende peptid mot MyD88 ble kjøpt fra InvivoGen. MiR-574-5p ligner og MIR-574-5p inhibitor ble kjøpt fra Ribobio (Guangzhou, Kina). Annexin V-FITC apoptose deteksjon kit ble kjøpt fra eBioscience. Cellesyklus fase besluttsomhet kit ble kjøpt fra Cayman. Den Nucleofector kit ble kjøpt fra Amaxa. Den humane lungekreft-cellelinje 95D-celler ble oppnådd fra ATCC og holdt ved 37 ° C under 5% CO
2 i fullstendig RPMI 1640 medium (GIBCO) inneholdende 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum supplert med 2 mM glutamin, 100 IU /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin-sulfat.
(A) 95D-celler ble transfektert med Ches1 ekspresjonsvektor og analysert for deres proliferasjon ved den angitte tid. (B) Grupper av åtte nakne mus ble utfordret med 2 × 10
6 av 95D celler som ble stabilt transfektert med Ches1 ekspresjonsvektor eller kontroll vektor. Svulsten ble bestemt ved den angitte tiden. Hver søyle representerer midlene (± SD) fra åtte hårløse mus i hver gruppe. (C og D) 95D-celler som var stabilt transfektert med Ches1 ekspresjonsvektor ble først synkronisert ved G0 fase ved å erstatte kulturmedium med serum-fritt medium i 24 timer, og detektert for deres apoptose ved hjelp av Annexin V-farging og cellesyklus ved å bruke cellesyklus fase bestemmelse kit ved strømningscytometri. (E) 95D-celler ble transfektert med Ches1 ekspresjonsvektor og analysert for deres CDK2 proteinnivå 48 timer senere. Feilfelt angitt standardavvik tredoble målinger fra tre uavhengige eksperimenter * p .. 0.05
MTT analysen
95D celler ble sådd på 3 × 10
3 celler hver brønn og inkubert i nærvær eller fravær av CpG-ODN (10 ug /ml) i 96-brønners plater i 72 timer. Vurderingen av celleproliferasjon ble målt ved anvendelse av kommersielt MTT-celleformering sett (Cayman) i henhold til produsentens instruksjoner.
(A) Relativ TLR9, MIR-574-5p og Ches1 ekspresjon ble bestemt ved sanntids-PCR i 23 NSCLC lungekreft prøver. Hver søyle representerer den relative forholdet mellom disse genene i kreftvevet i forhold til tilstøtende lungevevet. Feilstolper indikerte standardavvik av triplikat-målinger danne tre uavhengige eksperimenter. (B-D) Korrelasjonsanalysen mellom ekspresjonen av TLR9 og MIR-574-5p, MIR-574 og Ches1, samt TLR9 og Ches1, ble utført. Hver prikk representerte resultatene fra en pasient.
Real-time PCR
Kvantitativ Real-time RT-PCR ble utført som tidligere beskrevet [20]. Alle primere og prober ble oppnådd fra Applied Biosystems. Total RNA ble ekstrahert ved bruk av TRIzol reagens. cDNA ble syntetisert med PrimeScript RT reagent Kit (Takara). Kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) ble utført for å detektere mRNA-ekspresjon ved hjelp av SYBR Premiks Ex Taq (Takara), og β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. TaqMan mikro-RNA-analyser (Applied Biosystems) ble anvendt til kvantitativ uttrykket nivåer moden MIR-574-5p, og U6 small nuclear RNA ble anvendt som en intern kontroll.
Western blotting
celler ble lysert med M-PER Protein Extraction Reagent (Pierce) supplert med protease inhibitor cocktail. Cytoplasmatiske og atom ekstrakter ble utarbeidet etter NE-PER Kjerne- og cytoplasmatiske Utvinning reagenser (Pierce). Etter sentrifugering ved 13 000 g i henhold til 4 ° C i 15 minutter, ble supernatantene oppsamlet, og proteinkonsentrasjonen av ekstraktene ble målt ved BCA proteinanalyse (Pierce) i henhold til produsentens instruksjoner. Tyve mikrogram av proteinet ble påsatt på 10% SDS-polyakrylamidgeler og overført i 90 minutter ved 100 V på polyvinyliden-fluorid-membraner ved hjelp av en våt overføringssystem. Membranene ble vasket i 5% skummet melk i fosfat-bufret saltvann pluss 0,05% Tween 20 (PBST) i 2 timer for å blokkere ikke-spesifikke proteinbindingsseter på membranen. Immunoblotting ble utført ved anvendelse av monoklonale antistoffer mot Ches1 og CDK2 (Sigma and Cell Signaling Technology) ved en fortynning på 1:1000 i fettfri melk Tris-buffer. Membranen ble deretter vasket i PBST, probet med et sekundært anti-kanin antistoff konjugert til pepperrotperoksidase (Amersham Life Sciences) ved en fortynning på 1:5000, utviklet ved hjelp av en ECL western blotting KIT (Pierce), og eksponert for X-ray film (Kodak)
Plasmid Construction
Retrovirus-mediert overekspresjon eller hemming av MIR-MIR-574-5p ble generert basert på pMX vektor (Invitrogen) som tidligere beskrevet [21] -. [ ,,,0],23]. I korte trekk ble det MIR-574-5p ekspresjonsvektor konstruert ved ligering av EcoRI /XhoI polymerase kjedereaksjon (PCR) fragmenter med pMX-puro retroviral vektor. Retroviral MIR-574-5p «svamp» vektor ble konstruert ved hjelp av ligering av to eksemplarer av MIR-574-5p utfyllende oligonukleotidene og PMX-puro vektor. Sekvensen som koder for mutant MIR-574-5p ble klonet inn i den samme vektor og anvendt som kontrollvektor. Virus ble produsert og målceller ble smittet i henhold til brukerhåndboken. Generering av Ches1 full-lengde plasmid ble utført som tidligere beskrevet [24].
luciferase reporter og Mutagenese-analysen
luciferase reporter og mutagenese-analyse ble utført som tidligere beskrevet [20]. MiR-574-5p etterligner eller dens kontroll ble co-transfektert inn 95D celler med en enkelt rapport plasmid (pMIR-Rapport plasmid; Ambion) som inneholder enten villtype eller muterte 3 «UTR av Ches1 som ble generert ved hjelp av Quickchange Site-Directed mutagenese Kit (Stratagene). Etter 48 timers transfeksjon, ildflue luciferase og Renilla aktiviteter ble målt ved anvendelse av dual-luciferase reporter analysesystem (Promega).
Evaluering av tumorvekst in vivo
Evaluering av tumorvekst ble utført som tidligere beskrevet med mindre modifikasjoner [3]. I korte trekk ble BALB /c-nu /nu-mus (6-8 uker gamle) injiseres subkutant med 0,2 ml av en enkeltcelle-suspensjon inneholdende 2 x 10
6 tumorceller og fortsatte i laminær strømning skap under spesifikke patogenfrie betingelser . Svulster ble målt hver 5 dager etter tumor utfordring å bruke Vernier calipers. Tumorvolumer ble oppnådd ved å multiplisere den målte lengden av den målte bredden av den beregnede gjennomsnittet av disse målte verdier og ble presentert som gjennomsnitt ± SEM.
Statistiske analyser
statistiske analyser av dataene var utføres ved hjelp av analyseprogrammer i SPSS12.0 programvare. Statistiske Evalueringen ble utført ved hjelp av toveis variansanalyse (ANOVA, p 0,05). Bruker programmet PRISM 4,0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)
Resultater
TLR9 Signa oppregulert Expression of MIR-574-5p i human lungekreft celler
Vi først bekreftet forbedret tumorprogresjon av menneskelig lungekreft indusert av TLR9 signalering, og funnet ut at CpG ODNs behandling av 95D celler betydelig forbedret deres proliferasjon in vitro og tumorprogresjon in vivo (figur 1A og B, p 0,05). Å belyse potensielle rolle MIR-574-5p i effekten av TLR9 signalering på utviklingen av humane lungekreftceller, validert vi vår forrige microarray plattform og vurderes uttrykk for MIR-574-5p i 95D celler med eller uten CpG ODNs behandling av sanntids-PCR-analyse. Vi avslørte at ekspresjonen av MIR-574-5p var faktisk signifikant forhøyet i 95D celler etter CpG ODNs behandling i en dose- og tidsavhengig måte (figur 1C og D, p 0,05). For ytterligere å bekrefte at det var TLR9 /MyD88 signale som overdro Det oppregulert uttrykk for MIR-574-5p, ble det TLR9 signale inhibitor klorokin og MyD88 hemmende peptid brukes til å blokkere deres signalveien. Vi har funnet at både klorokin og MyD88-inhiberende peptid kan i betydelig grad oppheve forhøyet ekspresjon av MIR-574-5p indusert av CpG ODNs i 95D-celler på en doseavhengig måte (figur 1E og F, p 0,05). Våre funn sterkt demonstrert at TLR9 signaliserer effektivt forhøyet uttrykk av MIR-574-5p i humane lungekreftceller.
nedregulering av MiR-574-5p avskaffet Forbedret tumorprogresjon indusert av TLR9 signale i Human Lung kreft
for å belyse den potensielle rolle MIR-574-5p i den forbedrede tumor progresjon av menneskelig lungekreft indusert av TLR9 signalering, ble 95D celler transfektert med MIR-574-5p hemmer og deretter stimulert med CpG ODNs. Som vist i figur 2A, fant vi at transfeksjon med MIR-574-5p hemmer effektivt redusert sitt uttrykk i 95D celler (p 0,05). Spesielt, viste vi at transfeksjon med MIR-574-5p inhibitor vesentlig hemmet spredning av 95D celler indusert av CpG ODNs (figur 2B, p 0,5). For ytterligere å bekrefte dette fenomenet in vivo, ble Mir-574-5p svamp konstruert for å nedregulere uttrykket av MIR-574-5p. Nivået av funksjonelt knockdown av MIR-574-5p ble analysert ved en reporter-analyse, hvor den forutsagte MIR-574-5p-bindingssete ble innført i 3 «UTR av et luciferase reporter. Vi fant at transfeksjon av 95D-celler med den MIR-574-5p svamp forårsaket vesentlig økning i luciferase-aktivitet sammenlignet med kontrollgruppen svamp (figur 2C, p 0,05), noe som tyder på at effektiv inhibering av MIR-574-5p aktivitet ble oppnådd. Dermed ble grupper av nakne mus utfordret med 95D celler som stabilt uttrykte MIR-574-5p svamp, og deretter stimulert med CpG ODNs. Av notatet, viste vi at nedregulering av MIR-574-5p i 95D celler betydelig hemmet deres forbedret progresjon indusert av TLR9 signalering in vivo (figur 2D, p 0,05). Konsekvent, fant vi at nedregulering av MIR-574-5p også signifikant forlenget overlevelse av tumorbærende nakne mus (figur 2E,
p
0,05). Ved å kombinere disse dataene antydet at Mir-574-5p dratt effekten av TLR9 signalering på tumorprogresjon av humane lungekreftceller.
MiR-574-5p fremmet tumorprogresjon av menneskelige lungekreft celler
å karakter mekanismen ligger under sentral rolle MIR-574-5p i forbedret tumorprogresjon indusert av TLR9 signalering, vi evaluert videre den direkte effekten av MIR-574-5p på veksten av 95D celler in vitro og in vivo. Som vist i Figur 3A, har vi funnet at over-ekspresjon av MIR-574-5p i 95D-celler resulterte i deres forhøyet proliferasjon in vitro (p 0,05). Konsekvent, redusert uttrykk av MIR-574-5p i 95D celler svekket deres spredning in vitro (figur 3B, p 0,05). For ytterligere å bekrefte disse resultatene in vivo, ble nakne mus utfordret med 95D celler som ble stabilt transfektert med MIR-574-5p ekspresjonsvektor eller MIR-574-5p svamp vektor hhv. Vi fant at over-uttrykte MIR-574-5p betydelig forbedret tumorprogresjon av 95D-celler in vivo, fulgt av en redusert overlevelse av tumorbærende mus (figur 3C og D, p 0,05). Konsekvent, nedregulering av MIR-574-5p i 95d cellene opphevet deres vekst in vivo og forlenget overlevelse av tumorbærende mus (figur 3E og F, p 0,05). Disse resultatene antydet at Mir-574-5p ble en viktig faktor assosiert med økt tumorprogresjon av menneskelig lungekreft.
Ches1 var et direkte mål for MIR-574-5p å fremme tumorprogresjon of Human Lung Cancer
for ytterligere å forstå effekten av MIR-574-5p på å regulere tumor progresjon av humane lungekreftceller, spådde vi målene fra Mir-574-5p av prediksjon programmer, inkludert TargetScan og Miranda, og valgte 10 mulige mål inkludert CALCOCO1, RFX4, CD96, CHEX1, FOXI2, DGKG, ZNF589, ZDHHC14, CCDC88C, CLVS1 for sanntids PCR-analyse. Vi har funnet at ekspresjonen av Ches1 viste en dramatisk økning i 95D-celler transfektert med MIR-574-5p inhibitor (figur 4A, p 0,05). For å bekrefte dette resultatet, utførte vi western blot å påvise uttrykk for Ches1 i 95D celler transfektert med MIR-574-5p hemmer. Vi har funnet at proteinnivået Ches1 ble betydelig øket ved transfeksjon med MIR-574-5p inhibitor i 95D celler (figur 4B, p 0,05). Vi utførte en luciferase reporter analysen for å validere potensialet regulatoriske forhold. En signifikant negativ effekt på luciferase-aktivitet ble observert på den 3′-UTR av Ches1 i nærvær av MIR-574-5p, forsvant slik undertrykkelse når den forutsagte målsetet i 3′-UTR av Ches1 ble mutert (figur 4C, s 0,05 ). For ytterligere å oppdage potensielle rolle Ches1 i TLR9 signaliserer økt vekst av 95D celler, ble 95D celler transfektert med Ches1 ekspresjonsvektor og deretter stimulert med CpG ODNs. Som vist i figur 4D, har vi funnet at transfeksjon med Ches1 ekspresjonsvektor betydelig økt deres ekspresjon i 95D celler (p 0,05). Spesielt, har vi funnet at transfeksjon av MIR-574-5p etterligner mislyktes i å forbedre spredning av 95D-celler som ble ko-transfektert med Ches1 ekspresjonsvektor (figur 4E, s 0,05). Vi viste videre at transfeksjon med Ches1 ekspresjonsvektor effektivt avskaffet svulst fremme effekten av MIR-574-5p in vivo (Figur 4F, p 0,05). Videre har vi vist at opp-regulering av Ches1 effektivt inhiberte TLR9 aliserte forbedret spredning av 95D-celler (figur 4G, p 0,05). Konsekvent, fant vi at over-uttrykk for Ches1 i 95D cellene effektivt svekket deres forbedret tumorprogresjon indusert av TLR9 signalering i hårløse mus (figur 4H, p 0,05). Resultatene indikerte at Ches1 var en bona fide mål av MIR-574-5p i regulering TLR9 signaliserer økt tumorprogresjon av menneskelig lungekreft.
Over-uttrykk for Ches1 hemmet Cell Cycle Entry of Human lungekreft celler
for å belyse potensielle rolle Ches1 i tumorprogresjon av humane lungekreftceller, ble 95D celler stabilt transfektert med Ches1 ekspresjonsvektor oppdaget for deres spredning in vitro og progresjon i hårløse mus in vivo. Vi viste at over-uttrykk for Ches1 vesentlig hemmet spredning av 95D celler (figur 5A, p 0,05). Konsekvent, fant vi at svulsten progresjon av 95D celler transfektert med Ches1 ekspresjonsvektor var dramatisk bedres enn kontrollgruppen (figur 5B, p 0,05). Disse funnene antydet at Ches1 var en hemmende spiller i veksten av humane lungekreftceller. For ytterligere å karakterisere den underliggende mekanisme, analyserte vi den mulige effekten av Ches1 på apoptose og cellesyklus av humane lungekreftceller. 95D celler som er stabilt transfektert med Ches1 ekspresjonsvektor eller kontrollvektor ble først synkronisert ved G0 fase ved å erstatte dyrkningsmediet med serumfritt medium, og deretter kontinuerlig dyrket og høstet etter 24 timer. Vi fant at apoptose frekvensen av 95D-celler transfektert med Ches1 ekspresjonsvektor var lav og generelt sammenlignbar med kontrollgruppen (figur 5C). I motsetning til dette var andelen av 95D-celler transfektert med vektor Ches1 expresson på Go /G1 trinn var signifikant høyere enn i kontrollgruppen (figur 5D, p 0,05). Dessuten har vi også avdekket reduksjon av CDK2 ekspresjon i 95D-celler etter transfeksjon med Ches1 ekspresjonsvektor (figur 5E, s 0,05), som kan delvis forklare resultatene og var i samsvar med vår tidligere undersøkelse som viser at oppregulering av CDK2 var kritisk for TLR9 signale å stimulere spredning og cellesyklus oppføring av humane lungekreftceller [4].
The Expression of Mir-574-5p var positivt korrelert med TLR9 og Reversely korrelert med Ches1 i kliniske lungekreftpasienter
for ytterligere å undersøke den potensielle rolle MIR-574-5p i effekten av TLR9 signalering på humane lungekreftpasienter, vi har oppdaget forholdet mellom uttrykket av MIR-574-5p og TLR9 hos pasienter kliniske NSCLC. Som vist i figur 6A, uttrykket nivåer av TLR9 og MIR-574-5p var høyere i lungekreft vevet sammenlignet med tilstøtende vev fra tumor fra kliniske prøver lungekreft (p 0,05). I motsetning til ekspresjonen av Ches1 var signifikant lavere i tumorvev sammenlignet med tilstøtende vev (figur 6A, s 0,05). Viktigere, fant vi at uttrykket nivået av MIR-574-5p var positivt korrelert til uttrykk av TLR9 i kliniske tumorvev (figur 6B, p 0,05). Videre har vi vist at ekspresjonen av MIR-574-5p er omvendt korrelert med ekspresjonsnivået av Ches1 i tumorvev (figur 6C, p 0,05). Videre er ekspresjon av TLR9 ble også omvendt korrelert med ekspresjonsnivået av Ches1 i tumorvev (figur 6D, p 0,05). Disse funnene var i tråd med våre ovennevnte data som viste at Ches1 var en dominerende mål for MIR-574-5p å gi forbedret tumorprogresjon indusert av TLR9 signalering i menneskelig lungekreft.
Diskusjoner
i de senere år akkumulerende data antydet at TLR’ene ble funksjonelt uttrykt i tumorceller og er involvert i tumorprogresjon [4] – [8]. Vi har tidligere vist at TLR9 aliserte kunne øke tumorprogresjon av humane lungekreftceller in vitro og in vivo [3], [4], [9] – [11]. Her vi utvidet vår tidligere studie ved å vise at oppregulering av MIR-574-5p overdro Det forbedret tumorprogresjon indusert av TLR9 signalering i humane lungekreftceller. Våre funn antydet at Mir-574-5p var en viktig aktør i TLR9 signalering og tumorbiologi.
I denne studien fant vi at TLR9 signaliserer betydelig forhøyet uttrykk av MIR-574-5p i 95D celler, som var i tråd med vår tidligere studie [19]. For å møte den potensielle rolle MIR-574-5p i TLR9 signaliserer økt progresjon av humane lungekreftceller, vurderte vi effekten av nedregulering av MIR-574-5p på TLR9 signaliserer økt progresjon av 95D celler og fant at nedregulering av MIR-574-5p kan selvsagt redusere progresjonen av 95D-celler in vitro og in vivo. Våre data antydet at iboende MIR-574-5p kunne bidra til utviklingen av humane lungekreftceller. Faktisk vår påfølgende studie viste at Mir-574-5p kunne fremme utviklingen av humane lungekreftceller, noe som indikerer at vedvarende uttrykk for MIR-574-5p var avgjørende for utviklingen av humane lungekreftceller.
