Abstract
(-) – Epigallocatechin-3-gallate (EGCG ) er den mest omfattende studerte te polyfenol for sin anti-kreft-funksjon. I denne studien rapporterer vi en ny virkningsmekanisme for EGCG-mediert celledød ved å identifisere den kritiske rollen lysosomal membran permeabilization (LMP). Først ble EGCG-indusert celledød i humane kreftceller (både HepG2 og HeLa) funnet å være caspase-uavhengig og ledsages av innlysende cytosolisk vacuolization, bare observeres når cellene ble behandlet i serumfritt medium. Cytosoliske vacuolization observert i EGCG-behandlede celler ble mest sannsynlig forårsaket av lysosomal utvidelse. Interessant nok EGCG var i stand til å forstyrre autophagic fluks ved nedbrytningen trinn ved svekkelse av lysosomale funksjon, og EGCG-indusert celledød var uavhengig av Atg5 eller autophagy. Nøkkelen funn av denne studien er at EGCG er i stand til å utløse LMP, som dokumentert av Lysø-Tracker Red flekker, cathepsin D cytosolic trans og cytosolic forsuring. Konsekvent, en lysosomotropic agent, klorokin, redder effektivt celledød via undertrykke LMP-forårsaket cytosolic forsuring. Til slutt, har vi funnet at EGCG fremmer produksjonen av intracellulær ROS oppstrøms av LMP og celledød, noe som gjenspeiles ved forhøyet nivå av ROS i celler behandlet med EGCG og den beskyttende effekt av antioksidant N-acetylcystein (NAC) mot EGCG-mediert LMP og celledød . Til sammen data fra vår studie viser en ny mekanisme underliggende EGCG-indusert celledød involverer ROS og LMP. Derfor forstå dette lysosome-forbundet celledød sti kaste nytt lys på de anti-kreft effekt av EGCG
Citation. Zhang Y, Yang ND, Zhou F, Shen T, Duan T, Zhou J et al . (2012) (-) – Epigallocatechin-3-gallate induserer ikke-apoptotisk celledød i humane kreftceller via ROS-mediert lysosomal Membran Permeabilization. PLoS ONE 7 (10): e46749. doi: 10,1371 /journal.pone.0046749
Redaktør: Shi-Yong Sun, Emory University, USA
mottatt: 16 juli 2012; Godkjent: 04.09.2012; Publisert: 08.10.2012
Copyright: © Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble delvis støttet av forskningsmidler fra China National Natural Science Foundation (81028014 og 81172659 til ZXQ og SHM) og fra Singapore National Medical Research Council (NMRC /1260/2010-IRG09nov070 til SHM). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
fordelene med te forbruk til helse har blitt godt etablert via ulike studier på mennesker. De fleste av disse fordeler, blant annet forebygging av kreft og kardiovaskulære sykdommer har blitt tilskrevet den polyfenoliske komponentene i te [1]. Som den mest tallrike og biologisk aktive bestanddel blant te polyfenoler, (-) – har epigallocatechin-3-gallate (EGCG) fått mye oppmerksomhet i kreftforskning [2]. Til dags dato har mekanismene bak anti-kreft funksjon av EGCG blitt studert. Det er kjent at EGCG kan binde seg til flere molekylære mål, blant annet transmembrane reseptorer, kinaser eller andre viktige proteiner, og således påvirker en rekke signalveier, noe som resulterer i veksthemming, apoptose eller undertrykkelse av invasjon, angiogenese og metastase [3]. Blant dem er evnen til EGCG for induksjon av celledød i kreftceller betraktet som en av de viktigste mekanismer som er knyttet til sin anti-kreft-funksjon [4]. Likevel er de eksakte molekylære mekanismer for EGCG-indusert celledød er ikke fullstendig klarlagt. De fleste av tidligere rapporter har konkludert med at EGCG induserer caspase-mediert apoptose i forskjellige tumorceller via mitokondriell veien [5], [6], eller via død reseptor [7], mens bare få studier har vist ikke-apoptose celledøden forårsaket av EGCG [8], [9].
Blant forskjellige mekanismer for EGCG-mediert celledød, reaktive oksygenarter (ROS) og oksidativt stress synes å være spesielt viktig. Selv om EGCG med en pyrogallol-type struktur på B-ringen behandler en sterk antioksidantaktivitet, er denne strukturen vist seg å være ustabile i dyrkede celle system [10]. Den auto-oksydasjon av EGCG i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) produserer vesentlig mengde av ROS, spesielt H
2o
2, som spiller en viktig rolle i den cytotoksiske effekten av EGCG mot kreft-cellelinjer [11], [12]. Tilsetning av antioksydanter i kulturmediet ble rapportert å inhibere EGCG-indusert apoptose [13], [14]. Nylig ble engasjementer av ROS og oksidativt stress i ikke-apoptotisk celledød eller nekrose har vært økende verdsatt [15]. Derfor er det av interesse for ytterligere å forstå rollen til ROS og oksidativt stress i EGCG-mediert celledød, inkludert både apoptotiske og ikke-apoptotiske celledød.
lysosomer er cytoplasmatiske membran-omsluttet organeller som inneholder hydrolytiske enzymer og som styrer den intracellulære omsetningen /degradering av makromolekyler [16]. I de senere år har den biologiske funksjonen til lysosomer i økende grad blitt verdsatt, og det er kjent for å spille kritiske roller i forskjellige fysiologiske prosesser som autofagi og i humane sykdommer som for eksempel lysosomal lagringssykdommer, cancer og nevrodegenerative sykdommer, [17]. Lysosomale proteaser, som holdes inne i membranen under normale forhold, vil lekke inn i cytosol i både apoptose og nekrose [18]. Ett viktig prosess som er kjent å være nært knyttet til celledød prosessen er lysosomal membran permeabilization (LMP) [19]. Den nøyaktige utfallet av LMP er avhengig av graden av lysosomal membranskade. En massiv ruptur av lysosomer og rask utløsning av sine sure innholdet er ofte et kritisk punkt for nekrose; mens den partielle og selektive lysosomal lekkasje er ofte forbundet med den apoptotiske prosess [20], [21]. Det er mange kjente faktorer for å forstyrre lysosomal membranintegritet og forårsake LMP, inkludert ROS, lysosomotropic vaskemidler, mikrotubulidynamikk giftstoffer og noen lipider [17], [19]. For eksempel er noen anti-cancermidler slik som vincristin og siramesine kjent for å forårsake lysosom-avhengig celledød [22], [23]. Så langt er det ikke kjent hvorvidt lysosomet er involvert i celledød indusert av EGCG i kreftceller.
I denne studie forsøkte vi å ytterligere undersøke de molekylære mekanismer som ligger under EGCG-mediert celledød. Våre resultater viste at første EGCG induserer en form for caspase-uavhengig ikke-apoptotisk celledød, noe som kan bli betydelig utvidet i serumfritt medium. For det andre, har vi funnet at EGCG utløser LMP, noe som resulterer i lekkasje av de viktigste proteaser (katepsin) inn i cytosol, og celledød. Interessant er slik celledød uavhengig av autophagy. Til slutt, vi gitt klare bevis som viser at EGCG fremmer intracellulær ROS formasjon som fungerer som en viktig prosess som fører til LMP og celledød. Derfor er data fra denne undersøkelsen identifisere en ny mekanisme celledød indusert av EGCG i kreftceller som involverer oksidativt stress, lysosomal skade og til slutt celledød.
(A) Serum-deprivasjon fremmer EGCG-indusert celledød i en konsentrasjon -avhengig og tidsforløpet måte. HepG2-celler ble behandlet med forskjellige doser av EGCG helt eller serumfritt medium i 12 timer (venstre panel) eller med 60 mM EGCG til forskjellig tid som indikert (høyre panel). Cellelevedyktigheten ble bestemt ved Hoechst-PI dobbel farging (n = 3, middelverdi ± SA). (B) Representative bilder av Hoechst-PI dobbel farging. HepG2-celler ble dyrket i fullstendig medium (som en kontroll); behandlet med 60 uM EGCG i 12 timer i serumfritt medium; eller inkubert med 20 ng /ml TNFa og 10 ug /ml CHX i 12 timer i komplett medium (som en positiv kontroll for apoptose). (C) EGCG induserer caspase-uavhengig celledød. HepG2-celler ble behandlet med EGCG (60 um x 24 h) eller i fravær eller nærvær av 40 pM Z-VAD-FMK. Den ko-behandling med TNFa (20 ng /ml) og CHX (10 ug /ml) i 12 timer ble anvendt som en positiv kontroll. Celleviabilitet ble bestemt som beskrevet i panel A. **
p
0,005 sammenligne med gruppen uten z-VAD (Student
t
-test, n = 3). (D) nr kaspase-3 aktivering og PARP-spaltning forårsaket av EGCG-indusert celledød. Cellene ble behandlet med EGCG eller TNF /CHX som beskrevet i panel C, og cellelysater ble samlet og under western blot.
Materialer og metoder
kjemikalier, reagenser og antistoffer
(-) – Epigallocatechin-3-gallate (EGCG, 90%) ble kjøpt fra Zhejiang University Tea Research Institute. 5- (og 6-) -chloromethyl-2 «, 7»-dichlorodihydrofluorescein diacetat acetyl-ester (CM-H
2DCFDA), ble Hoechst33342, og Lyso-Tracker® Rød (DND-99) oppnådd fra Invitrogen. z-VAD-FMK var skjema Enzo. Acridinoransje var fra immunokjemisystemer Technologies. E-64D og N-acetylcystein var fra Merk. Propidiumjodid (PI), digitonin, klorokin (CQ), bafilomycin A1 (Baf A1), pepstatin A og andre vanlige kjemikalier ble alle innkjøpt fra Sigma-Aldrich. De primære antistoffene anvendt i studien omfatter følgende: anti-poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), anti-kaspase-3 og anti-glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) fra Cell Signaling, anti-β-actin og anti-mikrotubul-assosiert protein en lettkjede 3 (LC3) fra Sigma-Aldrich, anti-p62 fra Abnova, anti-Atg5, anti-katepsin D og anti-lysosom-assosiert membranprotein (LAMPE-1) fra Santa Cruz. Den sekundære antistoffer, pepperrot peroksidase-konjugert geit anti-mus IgG, geite-anti-kanin-IgG og kanin-anti-geit IgG, var alle fra Thermo Scientific.
(A) Morfologiske forandringer av EGCG-behandlede celler i serum -Gratis medium ble analysert ved hjelp av lysmikroskopi. Representative bilder av HepG2 celle behandlet med EGCG ved indikerte konsentrasjoner i 12 timer (øvre panel) eller med 60 mikrometer EGCG for angitte tids kurs (nedre panel) er vist (skala bar: 50 mikrometer). (B) HepG2-celler ble behandlet med EGCG (60 eller 240 pM) i 12 timer. Cellene ble deretter fiksert og farget med hematoksylin og deretter analysert ved lysmikroskopi (Skala: 30 um). (C) vakuolen innholdet er ikke lipid-dråper. HepG2-celler ble EGCG (60 uM) i 12 timer. Dyrkede celler i fullstendig medium i 12 timer ble brukt som en negativ kontroll, og cellene ble behandlet med 1 mM oleat syre (OA) i DMEM-medium inneholdende 1% BSA i 12 timer ble anvendt som positiv kontroll. Cellene ble fiksert og farget med 0,5% Oil Red O og hematoxylin (Skala: 30 um). (D) vakuoler er av lysosome opprinnelse. Immunfluorescens farging av LAMP-en ble utført i MEF celler etter behandling med eller uten EGCG (60 mm) i 9 timer (skala bar: 10 mikrometer).
Cell Kultur og behandlinger
Humant heptoma cellelinje HepG2 var fra the American Type Culture Collection. Muse embryonale fibroblaster (MEF), både villtype (WT) og m5-7 celler med induserbar sletting av Atg5 ble gitt av Dr. N. Mizushima (Tokyo Medical and Dental University) [24]. Begge ble dyrket i DMEM (Sigma-Aldrich) inneholdende 10% føtalt bovint serum (HyClone) og 1% penicillin-streptomycin (Invitrogen), i en 5% CO
2 atmosfære ved 37 ° C.
celleviabilitet Analyser
I denne studien ble celleviabilitet kvantifisert ved hjelp av PI utelukkelse test som beskrevet tidligere med modifikasjoner [25]. For hver prøve ble celler utsådd i en 96-brønners plate ved 5 x 10
3 per brønn. Den neste dag ble cellene først behandlet som beskrevet i resultatene, og i figuren sagn, etterfulgt av inkubering med 10 ug /ml Hoechst33342 og 5 ug /ml PI i 15 minutter ved romtemperatur. Hoechst kan flekke alle cellene i blått, mens de døde cellene ble vist ved PI nukleær farging i rødt. For hver prøve ble ca. 500 celler visualisert, tilfeldig fanget og telles for celle-levedyktighet på grunnlag av forholdet mellom Pl-positive til negative celler ved hjelp av et invertert fluorescent mikroskop (Nikon ECLIPSE TE2000-S).
(A) EGCG øker LC3-II og p62 protein nivå. HepG2 og MEF-celler ble behandlet med EGCG (60 uM) for angitte varigheter i fullstendig medium eller i serumfritt medium som angitt. Cellelysater ble samlet for western blot. (B) EGCG øker dannelsen av GFP-LC3 puncta. MEF med stabil ekspresjon av GFP-LC3 (m5-7-celler) ble behandlet med eller uten 60 mM EGCG i 9 timer i serumfritt medium og analysert ved konfokal mikroskopi (Skala: 20 um). (C) EGCG ikke fremme autohpagic forandring. HepG2-celler ble behandlet i serumfritt medium med 60 uM EGCG, 50 nM Baf A1, eller begge deler i 9 timer. Cellelysater ble samlet og under western blot. (D) EGCG har ingen virkning på autophagosome-lysosomet fusjon. MEF-celler med stabil ekspresjon av GFP-LC3 ble dyrket i serumfritt medium i 9 timer (som en kontroll); behandlet med EGCG (60 um x 9 h) i serumfritt medium; eller dyrket i EBSS medium i 2 timer (som en positiv kontroll). Cellene ble deretter farget LAPM-1 som beskrevet i figur 2D. Celler ble analysert ved konfokal mikroskopi (skala bar: 10 mikrometer).
Oil Red O for Lipid Droplet Farging
Lipid dråpe farging ble utført ved hjelp av en etablert metode [26]. Kort sagt ble HepG2 celler sådd ut på 24-brønners plate på et dekkglass og dyrket over natten. For den positive kontroll, ble cellene behandlet med 1 mM oljesyre i serumfritt DMEM inneholdende 1% BSA. Etter behandling ble cellene fiksert med formaldehyd, og deretter farget ved hjelp av 0,5% Oil-Red-O i isopropanol i 30 min og kjerner ble kontra farget med hematoksylin.
immunfluorescens Farging
I denne studere, lysosomet-assosiert membran protein (LAMP-1) ble undersøkt ved immunfluorescens farging, basert på en etablert metode [27]. Behandlede celler ble fiksert med 4% paraformaldehyd i PBS i 15 minutter ved værelsestemperatur, og permeabilisert med 0,01% saponin i PBS i 10 min. Etter blokkering med 1% BSA i PBS i 30 minutter, ble celler inkubert med rotte-anti-muse-LAMPE-1 (1D4B) primære antistoff (utviklingsstudier Hybridom Bank) i en fortynning 1:100 over natten ved 4 ° C, etterfulgt av Alexa Fluor 555 geit-anti-rotte-sekundært antistoff (Invitrogen). Cellene ble undersøkt ved hjelp av en konfokal mikroskop (Olympus Fluoview FV1000) og representative celler ble valgt, og fotografert.
(A) MEF celler med induserbar sletting av Atg5 (m5-7 celler) ble dyrket med eller uten 10 ng /ml Dox i 4 dager, deretter EGCG (60 pM x 6 h), og cellelysater ble oppsamlet og utsatt for western blot. (B) Dannelsen av vakuoler er Atg5 uavhengig. m5-7-celler som beskrevet i panel A ble behandlet med EGCG (60 uM) i 12 timer og observert under lett mikroskopi (Skala: 30 um). (C) EGCG-indusert celledød er uavhengig av autophagy. m5-7-celler som beskrevet i panel A ble behandlet med EGCG (60 uM) i 24 timer. Cellen levedyktighet ble bestemt av Hoechst-PI dobbel farging (n = 3, gjennomsnitt ± SD).
lysosomale Farging
lysosomale farging ble utført ved hjelp Lysø-Tracker, en lysosomotropic sonde (Invitrogen) [28]. De behandlede cellene ble inkubert i 30 minutter ved 37 ° C med 5 nM av Lyso-Tracker. Cellene ble undersøkt ved hjelp av en konfokalmikroskop og representative bildene ble fotografert.
Utarbeidelse av membranfraksjonen av Digitonin Utvinning
metode for å skille cytosoliske fraksjoner fra membranfraksjoner ble brukt som tidligere rapportert [29 ]. Etter angitte behandlinger, cellene ble først suspendert i ekstraksjonen buffer (250 mM sukrose, 20 mM HEPES pH 7,5, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl
2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, med tillegg av med 250 ug /ml digitonin (Sigma) i 10 minutter på is med gjentatt virvling, etterfulgt av sentrifugering (90 sekunder, 13000 rpm, 4 ° C). den resulterende supernatant ble deretter holdt som den cytosoliske fraksjonen og pellet som membranfraksjonen. Dette optimale konsentrasjon av digitonin i utvinning buffer ble bestemt av hvor den gir effektiv utvinning av cytosoliske proteiner (analysert ved immunoblotter bruker GAPDH som en markør), mens du fortsatt forlate lysosomale membraner intakt (med cathepsin D som en markør).
Western Blotting
ved slutten av de angitte behandlinger, ble cellene lysert i hele cellen lyseringsbuffer (62,5 mM Tris-HCl ved pH 6,8, 20% glycerol, 2% SDS, 2 mM DTT, 100 uM PMSF og proteinase -inhibitor cocktail). prøver med lik mengde proteiner ble underkastet SDS-PAGE og overført til en polyvinyliden fluorid (PVDF) membran (Bio-Rad). Etter blokking med 5% fettfri melk, undersøkt med utpekte primære og sekundære antistoffer. Membranen ble utviklet med den forbedrede chemiluminescence metoden (Thermo Scientific) og visualisert med Kodak Image Station 4000R (Kodak).
(A) Effekt av EGCG på intracellulære sure avdelinger. HepG2-celler ble med EGCG (60 uM) for angitte varigheter eller med Baf A1 (50 nM) i 6 timer. De sure avdelinger ble merket med 5 nM Lyo-Tracker Red og undersøkt av confocal (skala bar: 20 mikrometer). (B) EGCG induserer lekkasje av katepsin fra lysosome til cytosol. Cellefraksjonering ble utført for å separere lysosomale og cytosoliske fraksjoner i HepG2 ble behandlet med 60 uM EGCG i serumfritt medium som angitt. Cathepsin D ble påvist ved western blotting i de forskjellige fraksjoner og helcellelysater. LAMP-en ble brukt som en markør for lysosome. (C) EGCG fører lysosomale nøytralisering og cytosolic forsuring. HepG2-celler ble behandlet med 60 uM EGCG som angitt i serumfritt medium, fulgt av farging med 5 ug /ml akridin orange (AO) i 30 minutter og analysert ved konfokal (Skala: 20 um).
Acridine Orange (AO) Farging
AO er en metachromatic og svak base membran permeant fluorescerende fargestoff, som fluorescens utslipp er konsentrasjonsavhengig, fra rødt ved høye konsentrasjoner (i lysosomer) til grønn ved lave konsentrasjoner (i cytosol), med gul som mellomprodukt ved noen betingelser [19]. I våre eksperimenter ble celler sådd til et dekkglass sleidekammeret ved 3 x 10
4 per brønn. Etter de angitte behandlinger, de ble lastet med AO (5 ug /ml) ved 37 ° C i 15 minutter, renset, og deretter undersøkt under mikroskop konfokalt med eksitasjonsbølgelengde på 488 nm, mens to separate utslipps bånd (505-570 nm og 615 -754 nm) ble samtidig samlet.
Påvisning av reaktive oksygen arter
Analyse av intracellulær ROS produksjonen ble utført ved hjelp av en etablert metode [30]. Kort sagt ble HepG2-celler med angitte behandlinger inkubert med 10 pM CM-H
2DCFDA ved 37 ° C i 15 og analysert under et fluorescensmikroskop. Representative bilder av tid kurs ble valgt, og fotografert.
Statistical Analysis
De numeriske data ble presentert som gjennomsnitt ± SD fra minst 3 uavhengige eksperimenter. Statistisk analyse ble beregnet ved hjelp av Student
t
-test (to-tailed distribusjon, ulik varians).
(A) Forskjellige lysosome hemmere presentere ulike effekter på EGCG-indusert celledød. HepG2-celler ble behandlet i EGCG (60 um x 24 timer) i serumfritt medium i fravær eller nærvær av forskjellige inhibitorer, inkludert E64-D (10 ug /ml) + pepstatin A (10 ug /ml), klorokin (CQ , 25 mm), Baf A1 (50 nM). Cellelevedyktigheten ble bestemt ved Hoechst-PI dobbel farging (n = 3, middelverdi ± SA).
p
verdier ble bestemt ved hjelp av Student
t
-test (*
P
0,05, **
P
0,005). (B) CQ, men ikke Baf A1 blokker cytosoliske forsuring indusert av EGCG. HepG2-celler ble med EGCG (60 pM), CQ (25 uM) eller Baf A1 (50 nM) i serumfritt medium i 6 timer, etterfulgt av farging med 5 ug /ml AO i 30 minutter og analysert ved konfokal (Målestokk: 20 mikrometer).
(A) EGCG induserer intracellulær ROS produksjon. HepG2-celler ble behandlet med EGCG (60 uM) i 6 timer i komplett medium eller i serumfritt medium Behandling med H
2o
2 (200 mm) i 3 timer ble anvendt som en positiv kontroll. Det intracellulære ROS ble påvist ved CM-H
2DCFDA og analysert under et fluorescensmikroskop. (B) NAC hindrer ROS dannelse indusert av EGCG i serumfritt medium. Celler ble behandlet med EGCG (60 pM x 6 timer) i fravær eller nærvær av N-acetylcystein (NAC, 5 mM). (C) Beskyttelse av NAC av EGCG-indusert celledød. HepG2-celler ble behandlet med EGCG (60 uM) eller H
2o
2 (200 uM) som vist i 12 timer i fravær eller nærvær av 5 mM NAC. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved Hoechst-PI dobbel farging (n = 3, middelverdi ± SA). **
P
0,005 sammenlignet med gruppen uten NAC (Student
t
-test). (D) NAC hindrer cathepsin D trans forårsaket av EGCG. HepG2-celler ble behandlet med EGCG (60 pM x 6 timer) med eller uten 5 mM NAC. Både lysosomale og cytosoliske fraksjoner ble analysert ved hjelp av western blot. (E) NAC forhindrer EGCG-indusert cytosolic forsuring. HepG2-celler ble behandlet med EGCG (60 pM x 6 h) eller H
2o
2 (200 uM x 3 timer) med eller uten 5 mM NAC. Cellene ble deretter farget med AO i 30 minutter og analysert ved konfokal (Skala: 20 um). (F) CQ unnlater å påvirke ROS-produksjon indusert av EGCG. HepG2-celler ble dyrket i serumfritt medium i 1 time, deretter tilsatt 60 pM EGCG, med eller uten tilstedeværelse av 20 uM CQ i 6 timer. (G) Illustrasjon for mekanismene bak EGCG-mediert caspase-uavhengig celledød, som involverer ROS og LMP.
Resultater
Serum Sult Forbedrer EGCG celledød
EGCG er tidligere blitt rapportert å indusere apoptotisk celledød i en rekke humane kreftcellelinjer [31]. En overraskende funn i løpet av vår studie er at tilstedeværelsen av 10% serum har en stor innvirkning på cytotoksisitet av EGCG testet. Som vist i figur 1A, HepG2-celler var stort sett motstandsdyktige mot EGCG i fullstendig medium så høy som 240 uM dyrket i opp til 36 timer, mens EGCG er i stand til i betydelig grad å redusere cellenes levedyktighet av HepG2-celler når de ble behandlet i serumfritt medium. ble observert Lignende effekter i andre humane kreftcellelinjer så som HeLa-celler (data ikke vist). Derfor våre resultater tyder på at serum sult er i stand til å fremme EGCG-indusert celledød.
Neste vi satt til å bestemme form av celledød indusert av EGCG i serumfritt medium. For å gjøre dette, må vi først undersøkte morfologiske endringer av atomkjerner med Hoechst farging. Som vist i figur 1B, gjorde kjerner i celler behandlet med EGCG viser ingen åpenbare endringer, mens tydelig atom kondensasjon ble observert i celler behandlet med TNFa og CHX, som en positiv kontroll for typisk apoptotisk celledød. Videre z-VAD-FMK, en generell kaspaseinhibitor mislyktes i å beskytte mot EGCG-indusert celledød, mens den helt forhindret celledød indusert av TNFa og CHX (figur 1C). Konsekvent var det ingen aktivert kaspase-3 (17 kDa) eller spaltet PARP (89 kDa) som detekteres ved Western-blotting (figur 1D) i HepG2 celler behandlet med EGCG. I motsetning til dette ble slike apoptose merkene funnet i celler behandlet med TNFa og CHX og forhindret av Z-VAD-FMK. Til sammen er det tydelig at EGCG induserer celledød under serumfrie betingelser er sannsynlig å være caspase-uavhengig non-apoptotisk celledød.
EGCG Triggers cytosolic vacuolization grunn lysosome Utvidelse i serumfritt medium
en morfologiske trekk observeres under lysmikroskop ble cytosoliske vacuolization i cellene behandlet med EGCG i serumfritt medium og tiden og doseavhengige endringer ble presentert i figur 2A. Spesielt ble ingen slik vacuolization funnet i celler behandlet med EGCG i fullstendig medium (figur 2B). Lignende resultater ble også funnet i HeLa-celler med den samme behandling (data ikke vist). Slik vacuolization var også synlig i celler farget med hematoksylin, en kjernefysisk fargestoff (figur 2B). En annen synlige morfologiske trekk i celler behandlet med den høyeste konsentrasjon av EGCG i serumfritt medium er tapt av cytosolisk innhold, med øket cellestørrelse (figur 2B).
Tatt i betraktning den nære sammenhengen mellom vacuolization og celledød vi så forsøkt å finne ut hva slags kilder de cytosoliske vakuoler. Den vacuolization ble rapportert å være forårsaket av et bredt spekter av stimuli, og induktive involverte mange forskjellige organeller og strukturer, slik som endoplasmatisk retikulum (ER), Golgi, og lysosomet [32]. I våre undersøkelser har vi først utelukkes muligheten for at vakuoler indusert av EGCG er lipid-dråper, som de er negativ farging med Oil Red O (figur 2C), i motsetning til celler behandlet med OA som ble anvendt en positiv kontroll. Dessuten er slike vakuoler var også ikke forbundet med ER eller Golgi basert på farging av respektive markørproteiner (data ikke vist). Interessant, fant vi at slike vakuoler godt co-lokalisere med lysosomal membranprotein LAMP-en (figur 2D), noe som tyder på at vakuoler var nært knyttet til lysosomer.
EGCG Blocks autophagic Flux
at serum sult forbedrer EGCG-indusert celledød ber oss om å undersøke hvilken rolle autophagy i EGCG-mediert celledød. Det har blitt godt etablert at sult induserer autofagi og autofagi er nært involvert i celledød prosessen, enten som en pro-overlevelse eller pro-død mekanisme [33]. For å teste dette, må vi først undersøkte autofagi nivå i celler behandlet med EGCG, ved å analysere LC3-II nivå, et mye brukt markør for autophagosomes [34]. Som vist i figur 3A, var det signifikant økning av LC3-II på EGCG-behandlede celler, både i HepG2 og MEF, i serumfritt medium, men ikke i fullstendig medium. På samme måte var det signifikant økning av GFP-LC3 puncta i MEF med stabil ekspresjon av GFP-LC3 (figur 3B). I denne studien brukte vi en rekke tilnærminger for å undersøke om de økte autophagic markører observert i EGCG-behandlede celler skyldes økt nivå av autophagic flux eller blokkering av autophagosome modning eller degradering i sent stadium. Først brukte vi bafilomycin A1 (Baf A1), en hemmer av lysosomal V-ATPase, for å blokkere autophagosome-lysosome fusion [35]. Spesielt Baf A1 klarte å ytterligere øke LC3-II (Figur 3C). For det andre, vi undersøkte endring av p62 protein nivå. Det er kjent at p62 er selektivt innarbeidet i autophagosomes gjennom direkte binding til LC3 og effektivt nedbrutt av autofagi [34]. Vi har observert tydelig opphopning av p62-protein i både HepG2 og MEF behandlet med EGCG (figur 3A, 3C). Til slutt fant vi ut at EGCG behandling vesentlig forbedret samlokalisering av autophagosome (merket med GFP-LC3) og lysosome (preget av LAMP-1), sammenlignet med kontrollcellene med serum-sult (figur 3D). Til sammen alle data som er beskrevet ovenfor indikerer klart at EGCG er i stand til å hemme autophagic forandring ved å blokkere sent stadium autolysosome degradering.
EGCG-mediert celledød er uavhengig av Autophagy
Etter å etablere inhiberende virkning av EGCG på autophagy, forsøkte vi å teste om avbrutt autophagic fluksen bidrar til EGCG-indusert celledød. Her benyttet vi de m5-7 celler med induserbar Atg5 sletting [24]. Som vist i figur 4A, tilsetning av doksycyklin (Dox) elimineres Atg5 og endring av LC3-II. Interessant, sletting av Atg5 hadde ingen effekt på cytosolisk vacuolization indusert av EGCG (figur 4B), og til slutt celledød (figur 4C). Derfor er det antatt at EGCG-mediert celledød er uavhengig av Atg5 eller autofagi.
EGCG induserer lysosomale Membran Permeabilization (LMP)
Tidligere data funnet i denne studien indikerer muligheten for lysosomal skade forårsaket av EGCG. For ytterligere å undersøke endringene av lysosomal funksjon forårsaket av EGCG, vi først brukt Lyso-Tracker Rød (LTR) til å merke og spore de sure intracellulære kamre (lysosomer) i levende celler. Som vist i figur 5A, tilsetning av EGCG markert redusert fluorescens på en tidsavhengig måte, noe som indikerer en reduksjon av intracellulære sure komponenter forårsaket av EGCG behandling. Som forventet, behandling av Baf A1 fullstendig avskaffet LTR farging på grunn av avskaffet lysosomal sur.
som en acidotropic sonde, den reduserte LTR fluorescens kan ikke bare gjenspeile en økning i lysosomal pH, men også antyder muligheten av lysosomale membranen permeabilization (LMP) [19]. For å bestemme hvorvidt EGCG kan utløse LMP, fordelingen av cathepsin B og cathepsin D, to viktige lysosomale enzymer, ble sammenlignet ved immunoblot mellom de cytosoliske og membranfraksjoner. Som vist i figur 5B, var det en tidsavhengig økning i en moden form av cathepsin D i cytosol-ekstraksjon i celler behandlet med EGCG, tilsvarende reduksjon i membranfraksjonen. Et slikt tidsmessig mønster er faktisk i overensstemmelse med reduksjonen av LTR farging vist i figur 5A, som indikerer en lekkasje av lysosomale innhold inn i cytosol.
EGCG-indusert LMP ble ytterligere bekreftet ved farging av akridinorange (AO) en lysosomotropic metachromatic fluorokrom, som vanligvis rød fluorescens inne lysosomene hvor det er sterkt konsentrert, og svakt grønt i cytosol med en lavere konsentrasjon [19]. Som vist i figur 5C, EGCG behandling tidsavhengig ført til tap av røde puncta i lysosomer, og økning av diffust rød fluorescens i cytosol, med en konsekvent tidsmessig mønster med LTR farging og lekkasje av cathepsin D er vist tidligere. Slike observasjoner tyder dermed på at EGCG fører til brudd på lysosome, som deretter utløser en utgivelse av syrlig innholdet fra lysosomale lumen til cytosol, med reduksjon av lysosomale forsuring og dramatisk økning av cytosoliske forsuring. Verdt å merke seg, nuklein- grønn fluorescens ble også forbedret over tid, noe som indikerer kjerner surgjøring med langvarig behandling av EGCG (figur 5C). Betydningen av slike endringer i EGCG-indusert celledød gjenstår å bli ytterligere undersøkt.
EGCG Induserer LMP-avhengig celledød
Opp til dette punktet, har vi vist at EGCG induserer caspase-uavhengig celledød, uavhengig av autofagi. Enda viktigere, har vi identifisert lysosome som hovedmålet av EGCG, dokumentert av lysosomal membran permeabilization, tap av cytosoliske forsuring og lysosome utvidelse. Her ønsket vi å teste om nedskrivning av lysosomer spiller en utløsende rolle i EGCG-indusert celledød. Først brukte vi flere forskjellige lysosome hemmere og blant dem, klorokin (CQ), en lysosomotropic agent, tilbys den mest effektive beskyttelsen mot EGCG-indusert celledød (Figur 6A). To katepsinaktivitet inhibitorer (E64-D og pepstatin A) var også effektiv, men i mye mindre grad.
