Abstract
Objektive
microRNAs (mirnas) uttrykk endres i kreftceller, og mirnas kan tjene som diagnostisk og prognostisk biomarkør for kreftpasienter. Denne studien er designet for å analysere sirkulerende mirnas uttrykk i ondartet pleural effusjon (OED) og deres tilknytning til pasientens overlevelse i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC).
Metoder
Pleuraeffusjon fra 184 pasienter med NSCLC og OED ble samlet. Mirna microarray og bioinformatikk tolkning ble brukt for å evaluere miRNA uttrykk profiler i 10 NSCLC pasienter med forskjellig overlevelse prognose. Assosiasjoner ble validert i 184 pasienter (tilfeldig klassifisert i trening og valideringssettet med likt antall i hver gruppe) ved hjelp av kvantitativ RT-PCR. Risiko score ble formulert basert på uttrykket signaturen miRNAs. Kliniske data, som for eksempel pasientens overlevelse, ble samlet for korrelasjonsanalyse.
Resultater
Trettitre mirnas ble funnet å endres mer enn to ganger av microarray i maligne effusjoner mellom lengre overlevelse og kortere-overlevelse grupper, og nivåer av fem mirnas (miRNA-93, miRNA-100, miRNA-134, miRNA-151 og miRNA-345) var signifikant assosiert med total overlevelse. Høy uttrykk for MIR-100 og lav uttrykk for miRNA-93, ble miRNA-134, miRNA-151 og miRNA-345 assosiert med dårlig overlevelse i både trening og validering kohort. Pasienter med høy risiko score hadde generelt dårlig overlevelse sammenlignet med pasienter med lav risiko score. Risiko minutter ble en uavhengig prediktor for pasientens overlevelse.
Konklusjoner
Expression mønstre av mirnas systematisk endret i OED av pasient med NSCLC. De fem miRNA signatur fra effusjon kan tjene som en prediktor for total overlevelse av pasienter med lungekreft
Citation. Wang T, Lv M, Shen S, Zhou S, Wang P, Chen Y, et al . (2012) Cell-Free mikroRNA Expression Profiler i Ondartet Effusion Associated med pasientens overlevelse i ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 7 (8): e43268. doi: 10,1371 /journal.pone.0043268
Redaktør: Sai Yendamuri, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: May 18, 2012; Godkjent: 18 juli 2012; Publisert: 24 august 2012
Copyright: © Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (81101552), Natural Science Foundation i Jiangsu-provinsen (BK2011571), Specialized forskningsfond for doktorgradsutdanning av høyere utdanning (20100091120002), og de grunnleggende forskning Midler til de sentrale universiteter (1118021418 og 1118021406). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er en av de mest fremtredende årsakene til kreft dødsfall på verdensbasis. Femten prosent av lungekreftpasienter kan ha ondartet pleural effusjon (OED) ved første gangs diagnose og en halv utvikle pleuravæske i et senere stadium av sykdommen [1]. OED er et dårlig prognostisk tegn for pasienter med NSCLC. Tumor spredning via overlevelse og proliferasjon av tumorceller i pleural effusjon er en viktig rute for metastasering og en hyppig årsak til morbiditet i NSCLC. Til tross for fremskritt innen behandlingsmetoder, er median overlevelse svært kort. Foreliggende standardbehandling synes å være maksimal sikker evakuering av pleuravæsken etterfulgt av intravenøs kjemoterapi eller intrapleural kjemoterapi [2] .Men det ble funnet at ikke alle pasienter ble dratt nytte av tilsetning av kjemoterapi, særlig hos pasienter med kort total overlevelse tid . Derfor er prognostisk evaluering av pasienten avgjørende for valg av bedre terapeutiske strategier. Hsu et al. viste at uttrykket nivåer av angiogenetic biomarkør var signifikant korrelert med pasientens overlevelse og pleuravæske kontroll [3]. I tillegg kunne de senere molekylær og genetisk profilering studier identifisere flere markører og unike signaturer som diagnostiske og prognostiske faktorer av NSCLC. Disse funnene åpnet opp muligheter for non-invasiv kreft diagnose og prognose. Noen av funnene er i ferd med å bli oversatt til klinisk bruk.
microRNAs (mirnas) er 18- til 25-nukleotider, ikke-kodende RNA-molekyler som regulerer uttrykket av mange gener. Siden deres oppdagelse har mirnas blitt funnet å regulere en rekke cellulære prosesser, inkludert apoptose, differensiering og celledeling [4], [5]. Unormale uttrykk for spesifikke mirnas er innblandet i patogenesen av ulike kreft hos mennesker, og miRNA uttrykk profilering av humane tumorer har identifisert signaturer i forbindelse med diagnostisering, staging, progresjon, prognose og behandlingsrespons. Den prognostiske potensialet av miRNA er vist for kronisk lymfatisk leukemi [6], lungekreft [7], [8], brystkreft [9], og neuroblastomer [10]. I lungekreft, høye nivåer av pre-MIR-155 og lave nivåer av la-7 ble rapportert å være korrelert med dårlig prognose [11], mens MIR-34a kunne anvendes som en prognostisk markør for tilbakefall i kirurgisk reseksjon NSCLC [12 ]. Nylig har flere rapporter tyder på at cellefrie sirkulerende mirnas kan påvises i serum /plasma og nivåene av tumor-avledede mirnas forhøyet i pasienter med lungekreft [13], [14], som tyder på at blodbaserte mirnas kunne fremstå som revolusjonerende kilder til biomarkør for lungekreft diagnose og prognose. Men en miRNA signatur i OED som kan forutsi den kliniske utfall hos NSCLC pasienter ikke hadde blitt funnet så langt.
I våre tidligere studier, har vi lykkes isolert celle-free nukleinsyre i maligne effusjoner og vist at celle -fri BIRC5 mRNA kunne brukes som en potent diagnostisk biomarkør for MPE [15]. Vi har også funnet at MIR-24 og MIR-30d ble annerledes uttrykt i benigne og maligne effusjoner, mens den cellefrie MIR-152 kan anvendes for å forutsi kjemosensitivitet av docetaxel [16], [17]. Gitt den prognostiske potensiale for mirnas i kreft, er målet med denne studien var å finne ut om cellefrie miRNA i pleuravæske kan brukes til å forutsi overlevelse av pasienter med ondartet pleuravæske sekundært til NSCLC.
Resultater
Påvisning av effusjon miRNAs og bioinformatikk tolkning av funksjonelle mirnas
Alle pasientene ble fulgt opp fram til 16 september 2011 eller på tidspunktet for dødsfallet. Alle 184 pasienter overlevde etter en median på 6 måneder (range: 1-33 måneder). Den totale kumulative andelen pasienter som overlever på 3 måneder var 0,70, ved 6 måneder 0,45, og ved 12 måneder var 0,11.
For å oppdage ulike mirnas mellom lengre overlevelse gruppe og kortere overlevelse gruppe, mikromatriser ble utviklet 10 pasienter. Som vist i tabell 1, ble 5 pasienter i lengre overlevelse gruppen og 5 pasienter i kortere overlevelse gruppe nøyaktig matchet i frekvensene av histologisk type og stadium, mens alder, røykestatus og kjønn var ikke signifikant forskjellig mellom de to grupper. 113 mirnas ble påvist i disse 10 pasienter ved miRNA mikromatriser (File S1). Ved hjelp av klasse sammenligning analyse, ble 33 uavhengige mirnas identifisert til å være forskjellig uttrykt i to grupper med fold endringer 2 (tabell S1). En vulkan tomten gitt ytterligere informasjon om betydningen og omfanget av uttrykks endring av disse utvalgte mirnas (figur S1), som var nyttig i å bedømme de viktigste kandidatene for oppfølgingsstudier.
David genet merknad ble brukt til å tolke den biologiske effekten av mirnas filtrert etter vulkan plot. I henhold til resultatene av data mining, ble 31 GOs klassifisert på grunnlag av disse miRNA mål (fig S2A). En annen funksjonell analyse av mirnas etter KEGG viste at 9 signaltransduksjonsveier ble vist å delta i forskjellige overlevelsestid for pasienter med lungekreft (figur S2B). Disse resultatene representerer romanen bevis for regulerende effekt av miRNAs på lungekreft via målgener og signalveien. I tillegg miRNA-mRNA nettverksanalyse integrert mirnas og mRNA ved å skissere interaksjoner av miRNA og målrettede gener (Figur S3). Tatt disse bioinformatikk tolkninger av funksjonelle mirnas sammen, 5 mirnas (miRNA-93, miRNA-100, miRNA-134, miRNA-151 og miRNA-345) ble valgt for videre analyse.
Sammenhengen mellom uttrykket av miRNAs i effusjon og pasient overlevelse
Vi testet de prediktive effekten av disse fem mirnas på lungekreft overlevelse blant 184 pasienter, tilfeldig gruppert i en trenings kohort (n = 92) og en validering kohort (n = 92). Det som kjennetegner disse pasientene med NSCLC ble vist i tabell 1. Fra trening årsklasse, høy effusjon uttrykk nivåer av MIR-100 (median, 0,02) og lave nivåer av MIR-134 (median, 0,50), MIR-345 (median , 0,09) MIR-151 (median, 0,05), og MIR-93 (median, 0,03) ble alle individuelt assosiert med lavere MSTS (7,1 måneder versus 4,3 måneder for MIR-134, 7,1 måneder versus 3,9 måneder for MIR-151, 8,2 måneder versus 2,9 måneder for MIR-345, 9,2 måneder versus 5,5 måneder for MIR-93, og 8,0 måneder versus 5,2 måneder for MIR-100, Tabell 2 og Figur 1a). Når disse terskelverdiene ble brukt til valideringssettet, ble tilsvar log-rank
P
verdier og HRS observert (tabell 2 og figur 1B).
A) 92 pasienter i opplæringen datasettet . B) 92 pasienter i valideringsdatasettet. C) Risiko score og total overlevelse i trening datasett D) Risiko score og total overlevelse i valideringsdatasettet.
Bilder
Cox proporsjonal hazard regresjonsanalyse for alle de 184 prøvene viste at uttrykket nivåer av de fem mirnas var signifikant assosiert med kreft død (
P
= 0,004 for MIR-134,
P
= 0.01 for MIR-151,
P
= 0,008 for MIR -345,
P
= 0,03 for MIR-93, og
P
= 0,02 for MIR-100, Tabell 3). Det var fire mirnas som var beskyttende og en miRNA som var risikabelt basert på korrelasjon av sine uttrykk og samarbeid med pasient overlevelse.
Nature av 5 miRNA uttrykk signatur
Disse 5 mirnas var deretter brukes til å lage en signatur ved å beregne en risiko score for hver pasient. Ifølge risiko score, ble pasientene i trenings kohort delt inn i høy og lav risikogruppene ved hjelp av median risikoscore som cutoff. Pasienter som tilhører høyrisikogruppen hadde en kortere median overlevelse enn pasienter med lav risiko score (9,4 måneder versus 4,0 måneder,
P
= 0,003). hentet fra trening kohorten den samme risiko poengsum formel og cutoff punktet ble brukt på 92 pasienter i valideringen kohort. I likhet med resultatene fra treningssettet, overlevelse var større i den lave risikogruppe enn i høyrisikogruppen gjennom oppfølging (tabell 4, figur 1C).
Effusion miRNA uttrykk signatur er uavhengig av røykestatus
for å finne ut om fem miRNA uttrykket signaturbaserte risikoscore er en uavhengig prediktor for kreft pasientens lunge overlevelse, gjennomførte vi Cox regresjonsanalyse. Som vist i tabell 5, røyking, alder og risikoscore var statistisk signifikant overlevelsesfaktorer ved hjelp av en Cox univariat regresjonsmodell. Men når en Cox multivariat regresjonsmodell ble brukt, risikoscore (
P
= 0,01) og røyking (
P
= 0,04) var begge uavhengige prediktorer for pasient overlevelse (tabell 5).
Diskusjoner
Ved hjelp av en sample-splitting tilnærming, en 5 miRNA uttrykk signatur som kan forutsi overlevelse både i trening og valideringssett ble identifisert i denne studien. Enda viktigere, 5 miRNA uttrykket signatur var en uavhengig prognostisk markør for dårlig overlevelse i multivariat analyse. Så vidt vi vet, er dette den første rapporten om en miRNA uttrykk signatur i maligne plevravæske som kunne forutsi NSCLC pasient overlevelse.
Vi brukte miRNA microarray for å påvise annerledes uttrykt miRNAs. Sammenlignet med kortere overlevelse gruppe, 21 mirnas var oppregulert og 12 mirnas ble nedregulert i lengre overlevelse gruppe. De fleste tidligere studier valgt mirnas basert på
P
verdier og Brett endringer. Her har vi også brukt bioinformatikk tolkning av funksjonelle mirnas å velge miRNAs. GO sikt og KEGG sti merknad ble brukt til sine mål genet pool. Som et resultat, KEGG annotering viste at viktig proliferative (MAPK og Wnt), overlevelse (TGF-p og mTOR), lim, onkogene og metabolske signalbaner som var rikelig blant de betraktelig beriket seg. De fleste av dem har allerede blitt rapportert til å ta del i lungekreft opprykk. GOs relatert til signal transduksjon, cellevekst, apoptose og metabolisme representerte de fleste av de i betydelig grad beriket GO betingelser, som var i samsvar med den KEGG analyse. Dette funksjonelle identitet bekreftet en systematisk endring i mirnas og deres mål gener under tumordannelse og markedsføring. Den miRNA-mRNA interaksjon nettverksanalyse ytterligere integrert bioinformatikk funn, og deretter skissert de viktigste målene for miRNAs. Sentrum av nettverket var representerer etter grad, noe som betyr at bidraget en miRNA til genene rundt. mirnas med høyere grader ble valgt for videre analyse. Derfor kan bioinformatikk tolkning hjelpe oss med å plukke opp mirnas med viktige funksjoner under lungekreft progresjon.
De fem miRNA signatur identifisert i denne studien inkluderte en miRNA (miRNA-100) som var risikabelt og fire mirnas (miRNA-93 , miRNA-134, miRNA-151 og miRNA-345) som var beskyttende i forhold til deres tilknytning mellom deres uttrykk og pasient overlevelse. Den beskyttende og risikofylt natur disse miRNAs er tankevekkende av sine funksjoner være enten hemmende eller fremme av ulike egenskaper ved kreftceller som spredning, migrasjon og invasjon. Økt MIR-100 er funnet i ovarialcancer [18], leverkreft og spiserørs plateepitelkarsinom [19], [20]. I god korrelasjon med våre data, ble Mir-100 uttrykk forbundet med progresjon og prognose i magekreft [21]. Zheng et al. viste at MIR-100 regulerer celledifferensiering og overlevelse ved å målrette RBSP3, en fosfatase-lignende tumor suppressor i akutt myelogen leukemi [22]. Blant de fire verne mirnas, bare MIR-134 ble rapportert å øke celleoverlevelse ved å fremkalle G1 arrest i lungekreftceller [23]. Våre resultater viser at alle disse fire mirnas ble oppregulert hos pasienter med lengre overlevelsestid. Uttrykk for disse mirnas var positivt korrelert med pasientens overlevelse. Infiltrering av effusjon ved lumophcytes kan føre til en tumor immunrespons. Derfor spekulerer vi at mirnas forbundet med bedret overlevelse kan indikere en betennelsesreaksjon, som må bevises.
I denne studien ble cellefrie miRNA profiler i plevravæske oppdaget for første gang, som har en rekke fordeler. For NSCLC pasienter med OED, målene for behandlingen er å kontrollere volumet på pleuravæske og forlenge overlevelsen. Derfor thoracoscopically evakuering av effusjon er en rutinemessig i klinisk. Innsamling av effusjon prøven ikke økte belastning for pasientene. Dessuten pasienter med lungekreft og maligne effusjoner kan ikke motta kirurgisk behandling. Effusjon prøven er lettere å oppnå enn vevsprøve. Videre mirnas som biomarkører som brukes for prognosen i klinisk setting har viktige fordeler i motsetning til mRNA. I motsetning til mRNA, mirnas i effusjon fortsatt i stor grad intakt og stabil. Et lite antall mirnas kan være tilstrekkelig til å forutse pasientens overlevelse. Det har vist seg at klassifiseringen av flere kreftformer basert på miRNA uttrykket signaturer er mer nøyaktig enn mRNA basert underskrifter [24].
Selv om ytterligere prospektive studier med et stort antall pasienter er garantert å bekrefte rollen miRNA signatur som en prognostisk faktor, kan de foreliggende resultatene har betydelige kliniske implikasjoner, ettersom det ikke er etablert prognostisk markør unntatt forbehandling performance status for NSCLC pasienter med OED [25]. De fem miRNA signatur, identifisert i denne studien, klassifiserer pasienter vellykket i lav risiko og høy risikogrupper i både trening og valideringssett. Dette kan bidra til klinikere å identifisere pasienter som hører til høy risiko for mer effektiv adjuvant behandling i tillegg til standardbehandlingsprotokoll. Våre funn at fem miRNA signatur kan forutse pasientens overlevelse også sannsynlig å generere potensielle molekylære mål for utvikling av anticancerterapi. Siden mirnas kan målrette flere gener, er mer grundige studier for å forstå reguleringsmekanisme av disse miRNAs som sannsynligvis vil resultere i bedre forståelse på pleural metastasering av NSCLC.
I konklusjonen, vi har identifisert fem miRNA signatur som kan forutsi pasientens overlevelse i avansert NSCLC. Effusions med høy ekspresjon av MIR-100 og lav uttrykk for miRNA-93, ble miRNA-134, miRNA-151 og miRNA-345 assosiert med dårlig overlevelse utfallet. Disse funnene kan ha implikasjoner i forståelsen av avansert NSCLC, utvikling av målrettet terapi og valg av kreftpasienter for adjuvant behandling.
Metoder
All forskning som omfatter mennesker deltakere har blitt godkjent av «Drum Tower Hospital etikk komité «og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle fag.
Prøvetaking og RNA isolering
utgytelse prøver av 184 påfølgende pasienter med histologisk bekreftet lungekreft ble samlet i perioden mars 2006 til desember 2010 kl Drum Tower Hospital og Nanjing Chest Hospital. Ingen av pasientene fikk hulrom medisin levering før prøvetaking. 5 ml effusjon for RNA-ekstraksjon ble oppsamlet i en RNase-frie rør inneholdende sitronsyre fra hver pasient. Supernatanten ble oppnådd ved sentrifugering ved 4000 g i 20 min. 800 pl supernatant ble blandet med 2,4 ml TRIzol LS reagens (Invitrogen, CA, USA). En annen 30 fmol ath-miR159a ble supplert inn i hvert prøverør. Deretter ble total RNA som inneholder små RNA hentet fra effusjon bruker miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens protokoll.
microarray og bioinformatikk tolkning av funksjonelle mirnas
miRNA microarray var utviklet i 10 prøver (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Etter en grundig analyse og FDR analyse, valgte vi de differensielt uttrykte gener i henhold til
P
-verdi terskel og brett endringer [26]. GO-analyse ble brukt for å analysere den viktigste funksjon av de differensielle ekspresjons-genene i henhold til den Gene Ontologi som er nøkkelen funksjonelle klassifisering av NCBI [27]. Tilsvarende ble hovedbane analyse anvendt for å finne ut den betydelige reaksjonsveien av differensial genene ifølge KEGG, Biocarta og Reatome [28]. Forholdet av miRNA og genene ble talt ved sine differensial uttrykk verdier, og miRNA -Gene-nettverket ble bygget i henhold til interaksjoner av miRNA og gener i Sanger miRNA database [29]. Sentrum av nettverket var representerer etter grad, noe som betyr at bidraget en mikroRNA til genene rundt. De 5 mirnas med høyeste grader ble valgt for videre studier.
Kvantitativ RT-PCR
mirnas ble revers-transkribert til cDNA med AMV revers transkriptase (Takara, Japan). Det totale RNA (1,5 ul for hver miRNA) ble anvendt som maler, og reaksjonen ble inkubert ved 16 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 42 ° C i 40 min og 70 ° C i 15 minutter for å denaturere den reverse transkriptase. Kvantitative PCR reaksjoner for mirnas ble utført ved hjelp av UPL probe (Roche, Basel, Switerland) ved ABI Stepone Plus Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). PCR-betingelsene var 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 50 sykluser ved 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. Hver prøve ble analysert i tre paralleller. Relative miRNA uttrykket nivåer ble beregnet i henhold til den komparative Ct metode med ath-miR159a som referanse og en blanding av RNA ekstrahert fra humane lungekreft A549 celler og magekreft BGC-823 celler (1:1) som kalibratoren.
Statistisk analyse
Forskjeller mellom to grupper ble evaluert av t-test. Assosiasjonene mellom total overlevelse og effusjon miRNA uttrykk nivåer ble analysert ved hjelp av Kaplan-Meier metoden, log-rank test, og Cox proporsjonal fare regresjonsmodeller. Risiko score ble tildelt til alle pasienter i henhold til en lineær kombinasjon av uttrykket nivået av miRNA, vektet etter regresjonskoeffisienten fra treningsprøvene. Risikoen Poengsummen ble beregnet som følger: risiko-poeng = (1,21 × uttrykk nivå av MIR-100) + (- 0,28 × uttrykk nivå av MIR-134) + (- 0,33 × uttrykk nivå av MIR-151) + (- 0,35 × uttrykk nivå av MIR-345) + (- 0,19 × uttrykk nivå av MIR-93). Cox trinnvis regresjonsmodell og lagdeling analyser også ble gjennomført. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av programvaren (SPSS 18, SPSS, Chicago, IL). Statistisk signifikans ble akseptert for
P
verdier. 0,05
Hjelpemiddel Informasjon
Fil S1.
113 mirnas ble påvist i disse 10 pasienter mellom lengre overlevelse gruppe og kortere overlevelse gruppe av miRNA mikromatriser (File S1). Brett endringer, ble FDR verdi og p-verdien beregnet for alle mirnas
doi:. 10,1371 /journal.pone.0043268.s001 plakater (XLS)
Figur S1.
Vulkanen Plottet viser forskjellig uttrykt mirnas i effusjon mellom lengre overlevelse gruppe og kortere overlevelse gruppe. Den horisontale aksen representerer ganger endring mellom to grupper. Den vertikale aksen representerer P-verdien for t-test for forskjeller mellom prøvene
doi:. 10,1371 /journal.pone.0043268.s002 plakater (TIF)
Figur S2.
GO og sti analyse basert på miRNA målrettet gener. Den vertikale aksen er GO (A) og sti kategori (B), og den horisontale aksen er berikelse av GO og veier
doi:. 10,1371 /journal.pone.0043268.s003 plakater (TIF)
Figur S3.
miRNA-mRNA-nettverk. Red Box nodene representerer miRNA og blå sykkel nodene representerer mRNA. Edges viser hemmende effekt av miRNA på mRNA. Sentrum av nettverket var representerer etter grad, noe som betyr at bidraget en mikroRNA til genene rundt. miRNA-93 har de største grader
doi:. 10,1371 /journal.pone.0043268.s004 plakater (TIF)
Tabell S1.
mirnas som er forskjellig uttrykt i effusjon mellom lengre overlevelse gruppe og kortere overlevelse gruppe.
doi: 10,1371 /journal.pone.0043268.s005 plakater (DOC)
Takk
Vi takker Qian Qian og som Yu i Nanjing Chest Hospital for å gi en del av vår effusjon prøver.
