Abstract
Bevis er presentert for den kjernefysiske nærvær av en funksjonell hete kompleks av epidermal vekstfaktor (EGFR), Src og Signal Svinger og Activator av transkripsjon (Stat) 3 proteiner i kreft i bukspyttkjertelen celler. Stat3 forblir kjernefysisk og forbundet med Src eller EGFR, henholdsvis på siRNA knockdown av EGFR eller Src, noe som viser motstanden av komplekset til modulering av EGFR eller Src alene. Betydelig, kromatin immunoutfelling (chip) analyser viser atom EGFR, er Src og Stat3 kompleks bundet til c-Myc-promoteren. SiRNA knockdown av EGFR eller Src, eller det farmakologisk inhibering av Stat3 aktivitet bare marginalt trykkes c-Myc uttrykk. I motsetning til den samtidige modulering av Stat3 og EGFR, eller Stat3 og Src, eller EGFR og Src sterkt undertrykt c-Myc ekspresjon, noe som viser at de nye atom heteromert kompleks intrikat regulerer c-myc-genet. Forekomsten av transcriptionally funksjonell EGFR, gir Src, og Stat3 atomkomplekset ytterligere og ny mekanisme for å støtte kreft i bukspyttkjertelen fenotype og forklarer delvis ufølsomhet av kreft i bukspyttkjertelen celler til hemming av EGFR, Src eller Stat3 alene.
Citation: Jaganathan S, Yue P, Paladino DC, Bogdanovic J, Huo Q, Turkson J (2011) En funksjonell Nuclear epidermal vekstfaktor reseptor, Src og Stat3 hetero Complex i kreft i bukspyttkjertelen celler. PLoS ONE 6 (5): e19605. doi: 10,1371 /journal.pone.0019605
Redaktør: Marcelo G. Bonini, University of Illinois i Chicago, USA
mottatt: 30 november 2010; Godkjent: 12 april 2011; Publisert: 05.05.2011
Copyright: © 2011 Jaganathan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Cancer Institute Grants CA106439 (JT) og CA128865 (JT), Florida Department of Health Bankhead-Coley Foundation (Bridge Grant) (HQ), delvis støtte fra World Gold Council (GROW Program) (HQ), og Foundation National Natural Science of China Overseas Young Investigator Award (20828006) (HQ). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Mange intracellulære biokjemiske prosesser er utløst av montering av proteiner til makromolekylære komplekser. Sammenhengen mellom proteiner eller proteiner med andre molekylære enheter modulerer protein konformasjon, noe som gir et middel til å regulere myriade av biokjemiske prosesser som tjener til å effektivt håndtere viktige biologiske reaksjoner. Protein dynamikk og trafficking, og protein stabilitet er også prosesser som kan moduleres av foreningen av proteiner med andre. I vid forstand, inter-molekylære foreninger tillate spesialitet proteiner, slik som reseptorer, adaptere, enzymer og transkripsjonsfaktorer til forskjellig modulere intracellulære hendelser, og dermed skape mangfold i fysiologiske responser og fremme sammenheng avhengighet.
I løpet av induksjon av signaltransduksjon, er montering av forskjellige proteiner, som hver har bestemte funksjoner som er viktige for den signaloverføring og den tilhørende biologisk respons. Den tradisjonelle epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) signaltransduksjonsbane omfatter aktivering av mitogen-aktivert protein kinase kinase (MEK) -mitogen-aktivert protein kinase /ekstracellulære signalregulerte kinase (Erk
MAPK) og fremmer mitogen respons [ ,,,0],1], [2]. EGFR induksjon også fremmer aktivering av signal Svinger og Activator av transkripsjon (STAT) familie av proteiner, som på samme måte har en sentral rolle i EGF-indusert biologiske reaksjoner [1]. STAT proteiner er latente cytoplasmatiske transkripsjonsfaktorer som aktiveres i respons til mobil stimulering av cytokiner og vekstfaktorer [3] via fosforylering av en kritisk tyrosyl rest (Tyr705 for Stat3). Den tyrosinfosforylering av statistikk formidles av tyrosin kinaser av vekstfaktorreseptorer og av cytoplasmatiske tyrosin kinaser, som Src og Janus kinase (Jaks) familier. Aktivert statistikk som dimerer i kjernen binder seg til spesifikke DNA responselementene i arrangører av målgener å indusere gentranskripsjon. Atomtrans mekanisme for statistikk har vært gjenstand for siste intens etterforskning. Stat3 nukleær translokasjon er blitt rapportert å være formidlet av anerkjennelse og transport av importin-α og den Ran-GTPase [4], og ved hjelp av mekanismer som involverer chaperoning ved MgcRacGAP [5], EGF-reseptor-mediert endocytose [6], og etter plasma membran-assosiert lipid flåter menneskehandel [7].
forekomsten av mange hyperaktive signaltransduksjonsveier som støtter kreft fenotype er en stor utfordring for terapi. Videre til den klassiske måten å fremme crosstalks mellom flere signalveier, makro-molekylær protein forsamlinger gi flere unike mekanismer for å indusere hendelser som ville støtte den ondartede fenotype. En slik ikke-tradisjonelle signaleringsmekanisme har blitt identifisert for EGFR, som har blitt påvist i cellekjernen og observert til å fungere som en transkripsjonsfaktor [8], [9]. Undersøkelser avslørte videre atom EGFR-komplekser med Stat3 i brystcancerceller, og dette komplekset induserer spesifikke gener, inkludert induserbar nitrogenoksid syntase (iNOS) [10]. Den ekstra EGFR funksjon ville forverre sin rolle som en mitogen og en pådriver for celleoverlevelse, som alle favorisere kreft. I den forbindelse, samtidig avvikende aktivering av EGFR og nedstrøms signalformidlere, inkludert Src og Stat3, som oppstår med høye frekvenser i humane kreftformer skyldes generelt signal kompleksitet som støtter kreft fenotype. For eksempel, med henvisning til kreft i bukspyttkjertelen, avvikende aktivering av EGFR forekommer i 30-50% av tilfellene [11] blir aktivert c-Src bemerket i mer enn 70% av tilfellene, og ofte følger EGFR overekspresjon [12], mens avvik Stat3 aktivering er også meget utbredt [13], [14], [15]. Viktigere, vår nylig rapport som kreft i bukspyttkjertelen er mer følsom for den samtidige hemming av avvikende Stat3 og EGFR eller Src [16] viser utnyttelsen av flere avvikende signalveier for vedlikehold av kreft fenotype, og hvordan dette påvirker responsen overfor terapi. For å utvide våre tidligere studier [16], forsøkte vi å undersøke den molekylære og funksjonelle samspillet mellom Stat3, EGFR og Src og de underliggende mekanismene for støtte av kreft i bukspyttkjertelen fenotype. Vi gir heri bevis for en funksjonell atomhete EGFR, Src og Stat3 kompleks i kreft i bukspyttkjertelen celler, som fremmer induksjon av c-myc-genet. Vår rapport er den første på identifisering av en kjernefysisk EGFR, Src og Stat3 hete kompleks som fremmer c-myc-genet induksjon. Forstå dynamikken i EGFR, ville Src og Stat3 molekylære interaksjoner i bukspyttkjertelkreft gi grunnlag for å utforme nye effektive fler målrettet terapi tilnærminger for kreft i bukspyttkjertelen.
Materialer og metoder
Cells og reagenser
Den menneskelige kreft i bukspyttkjertelen, Panc-1 og Colo-357 linjer har alle blitt beskrevet tidligere [16], [17]. Den foreviget menneskelige pankreasgang epitelceller (HPDEC) linjen var en slags gave av Dr. Tsao, OCI, uhn-PMH, Toronto) [18]. HPDEC ble dyrket i keratinocytt-SFM media supplert med 0,2 ng EGF, 30 mikrogram /ml bovint hypofysen ekstrakt og inneholder antimycol. Alle andre celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) inneholdende 5% jern-supplementert bovint kalveserum og 100 enheter /ml penicillin-streptomycin.
Peptidsyntese
Stat3 SH2 domene peptid inhibitor (SPI), FISKERERAILSTKPPGTFLLRFSESSK, de EGFR peptid motiver, pY1068EGFR (pY1068), PEpYINQS og pY1086EGFR (pY1086), PVpYHNQP ble kjøpt fra Peptide 2,0 (Fairfax, VA) i 95% renhet
Nuclear. Pakk forberedelse og Gel Shift Analyser
Nuclear ekstrakt forberedelse fra celler ble utført som tidligere beskrevet [17].
Sub-cellulær fraksjonering, og SDS-PAGE /Western blot analyse
Western blotting-analyse ble utført som tidligere beskrevet [19], [20] i hel-celle-lysatene, og på cytosoliske og membranfraksjoner, og den nukleære ekstrakter. Sub-cellulære fraksjoner ble fremstilt ifølge standardprotokollen. I korthet ble cellene vasket ved å bruke PBS, resuspendert og lysert i lav-salt-buffer (20 mM HEPES (pH 7,9), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 20 mM NaF, 1 mM Na
3VO
4, 1 mM Na
4P
2o
7, 1 mM ditiotreitol, 1 mM TLA, 0,5 mM fenylmetylsulfonylfluorid og 0,5% Nonidet P-40), og sentrifugert (13.000 x
g
, 4 ° C, 30 s) for å oppnå den cytosoliske fraksjon. Pelleten ble vasket tre ganger med fosfat-bufret saltvann (PBS), resuspendert i høy-saltbuffer (420 mM NaCl, 20 mM HEPES (pH 7,9), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 20% glyserol, 20 mM NaF, 1 mM Na
3VO
4, 1 mM Na
4P
2o
7, 1 mM ditiotreitol, 1 mM TLA og 0,5 mM fenylmetylsulfonylfluorid), inkubert ved 4 ° C i 30 min , med rock, og sentrifugert ved (13000 x
g
, 4 ° C, 30 min) for å oppnå den nukleære fraksjonen (supernatant). Den oppnådde pellet ble vasket tre ganger med PBS, suspendert på nytt i RIPA lysebuffer (50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 0,1% SDS, 1 mM TLA, og 0,5 mM fenylmetylsulfonylfluorid), inkubert i 30 minutter ved 4 ° C med gynge, og sentrifugert (13 000 xg, 4 ° C, 20 min). Supernatanten ble samlet opp som membranfraksjonen. Primære antistoffer som brukes er mot pY845EGFR (Upstate Biotech, Millipore, Billerica, MA), pY705Stat3, Stat3, pY1068EGFR, pY1086EGFR, pY1173EGFR, EGFR, pY416Src, Src, og β-Actin (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), og Tata- bindende protein (TBP) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California). De blokkerer peptider ble kjøpt fra de respektive selskapene.
Small-interfering RNA (siRNA) Transfeksjon
siRNA sekvenser for EGFR og Src ble bestilt fra Dharmacon RNAi Technologies, Thermo Scientific (Lafayette, CO) . Sekvenser er: EGFR senstråden, 5′-GAAGGAAACUGAAUUCAAAUU-3 «; EGFR antisensekjeden, 5»-pUUUGAAUUCAGUUUCCUUCUU-3 «; kontroll siRNA senstråden, 5»-AGUAAUACAACGGUAAAGAUU-3 «; og styre siRNA antisensekjeden, 5»-pUCUUUACCGUUGUAUUACUUU-3 «. C-Src SMARTpool siRNA-reagens (NM-005417, Catalog # M-003175-01-05) ble anvendt for Src. Transfeksjon inn i cellene ble utført med 20 nM av EGFR siRNA eller 25 nM av Src siRNA og 8 pl Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen Corporation, Carlsbad, California) i OPTI-MEM kulturmedium (GIBCO, Invitrogen Corporation).
Immunpresipitasjon (IP), og sekvensiell Immunoutfelling Studies
Disse studiene ble utført som tidligere rapportert [21] ved hjelp av hel-celle-lysatene eller nukleære ekstrakter (250 ug totalt protein) og 5 ul av anti-EGFR eller anti-Src polyklonalt antistoff eller det monoklonale anti-Stat3-antistoff (Cell Signaling Technology). For spesifisitet, immunblotting-analyse under anvendelse av anti-EGFR, anti-Src og anti-Stat3 antistoff ble utført i nærvær av den respektive blokkerende peptid. Sekvensielle IP-undersøkelser ble utført i henhold til publiserte prosedyrer [10] med noen modifikasjoner som følger: nukleære ekstrakter fremstilt som beskrevet tidligere [21], ble utsatt for en tilsvarende immunoutfelling med hensyn til den første primære antistoff, anti-EGFR-antistoff (Cell Signaling ) eller IgG (Santa Cruz) ved 4 ° C over natten. Den immunecomplex ble deretter pelletert med 20 ul protein A /G-agarosekuler (Santa Cruz), vasket tre ganger med vaskebuffer A (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 ), og deretter to ganger med vaskebuffer B (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0). Deretter ble proteinene eluert med nyfremstilt elueringsbuffer (1% SDS, 100 mM NaHCO
3) og underkastet den andre immunoutfelling ved inkubering med anti-Src-antistoff eller IgG (Santa Cruz). Kompleksene ble så felt, vasket, eluert med lamelli buffer og deretter utsatt for SDS-PAGE og Western blotting analyse sondering for Stat3.
farging med laserskanning confocal bildebehandling
Panc-1 celler vokser på dekkglass i 12-brønners plater ble behandlet med eller uten inhibitorer for ett eller 24 timer og utsatt for immunfarging og fluorescens eller laser-scanning konfokal mikroskopi, som tidligere beskrevet [21]. Celler ble fiksert med 4% paraformaldehyd i 15 minutter, vasket tre ganger med PBS, permeabiliserte med 0,25% Triton X-100 i 10 minutter, og vasket tre ganger med PBS. Prøvene ble deretter blokkert i 0,1% BSA i PBST i 30 minutter og inkubert over natten ved 4 ° C med rotte-monoklonalt anti-EGFR (Santa Cruz), muse-monoklonalt anti-Src (Cell Signaling), og kanin-polyklonalt anti-Stat3 (Cell Signaling ) antistoffer ved 1:50 fortynning (i 0,1% BSA). Deretter ble cellene vasket tre ganger i PBST, ble inkubert i 1 time ved romtemperatur i mørke med 1:1000 fortynninger av de tre AlexFluor sekundære antistoffer, ALexaFLuor405 (geit-anti), AlexaFluor488 (esel-anti-kanin) og AlexaFluor546 (geite-anti -rat) (Molecular Probes, Invitrogen) for EGFR, Src og Stat3 deteksjon, henholdsvis. Prøvene ble så vasket tre med PBST. Deretter Dekkglass ble fjernet og montert på objektglass ved hjelp av Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL) og hindres i å tørke ved å forsegle kantene med spiker maling. Glassene ble lagret i mørke ved 4 ° C inntil bilder ble tatt. For negativ farging, ble sekundære antistoffer lagt uten de primære antistoffer. Confocal analyse ble utført ved undersøkelse av skred i henhold til Leica TCS SP5 konfokal mikroskop (Tyskland) på passende bølgelengder. Bilder ble tatt og behandlet ved hjelp av Leica TCS SP 5 programvaren.
Chromatin Immunpresipitasjon (chip) og sekvensiell Chip Analyser
For ChIP analysen, celler i kultur ble behandlet med formaldehyd ved en sluttkonsentrasjon på 1%, i 10 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av behandling med glycin ved en sluttkonsentrasjon på 0,125 M i 5 minutter ved romtemperatur for tverrbinding. Deretter ble cellene vasket med iskald PBS og resuspendert i og lyseres med lyseringsbuffer (20 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaF, 1 mM Na
3VO
4, 1 mM Na
4P
2o
7, 1 mM ditiotreitol), 1X TLA, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 5% Nonidet P-40, og sentrifugert. Deretter atom pellet ble resuspendert i lyseringsbuffer kjerner (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 1% SDS og proteaseinhibitorer) (Roche, Indianapolis, IN). Atomlysatene ble ultralydbehandlet (Omni International, Kennesaw, GA) ved 30% effekt i 3 pulser i 10 s intervaller på is for å klippe DNA. Den kromatin Oppløsningen ble pre-erte med protein A /G-agarosekuler (Santa Cruz) i 1 time ved 4 ° C med gynge. Da de på forhånd erte lysater ble immunopresipitert ved inkubering med anti-EGFR, anti-Src, eller anti-STAT3 antistoffer eller med IgG (uten antistoff) (Santa Cruz) ved 4 ° C over natten med gynge. Kompleksene ble samlet opp med 20 ul protein A /G-agarosekuler (Santa Cruz), vasket tre ganger med vaskebuffer A (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0) og to ganger med vaskebuffer B (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0). Deretter komplekser ble eluert med nylagde elueringsbuffer (1% SDS, 100 mM NaHCO
3). Kryssbindinger ble reversert ved oppvarming ved 65 ° C, i nærvær av NaCl, etterfulgt av proteinase K-behandling (20 ul av en 20 mg /ml) i 6 timer. DNA ble utvunnet og renset ved anvendelse av DNA-rensing kit fra Qiagen (Valencia, CA). Den rensede kromatin immunopresipitert DNA ble deretter anvendt som et templat for en polymerasekjedereaksjon (PCR) amplifikasjon av c-myc-promotoren ved bruk av primerne, Forward, 5’AAAAGGGGAAAGAGGACCTGG-3 «, og omvendt, 5′-TAAAAGGGGCAAGTGGAGAGC-3» eller TWIST arrangøren ved hjelp av primere, Forward, 5’AGTCTCCTCCGACCGCTTCCTG -3 «
Omvendt. 5’CTCCGTGCAGGCGGAAAGTTTGG -3′ (Invitrogen). PCR-produktene, 133 bp for c-myc og 332-BP for TWIST [22] ble løst på 2% agarosegel. Den sekvensielle Chip studier ble utført som tidligere rapportert [10] og følge sekvensielle immunoutfellingsstudier beskrives, ved hjelp av den første primære antistoff (anti-EGFR) og den andre primære antistoff (anti-Src). De gjenopprettede komplekser etter den sekundære immunoutfelling ble eluert med elueringsbufferen og deretter utsatt for å chip-analyse, som beskrevet.
Gelfiltreringskromatografi
ferdigpakket Superdex 200 10/30 GL glasskolonne ble kjøpt fra GE Healthcare og biovitenskap (Piscataway, NJ). Kromatografien systemet som brukes i undersøkelsen var den biologiske Duoflow system (Bio-Rad, Hercules, CA). Den kromatografi Analysen ble utført ved å følge produsentens instruksjoner med en generell run sekvens av likevekt, last, eluering, regenerering og lagring. RIPA buffer (50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,1% SDS, 1% Nonidet P-40) ble anvendt som den mobile fase buffer. Prøver (Panc-1 cellelysat, 2 mg totalt protein i et volum på 250 ul) ble lastet inn til kolonnen, da strømningshastigheten ble justert til 0,25 ml /min, og deretter fraksjon (500 ul) samling ble startet rett etter at prøven lasting og overvåket ved elueringsmiddel absorbans ved 280 nm. Ifølge absorbanstoppene ble fraksjonene 21-34 utvalgt og utsatt for immunblotanalyse ved anvendelse av antistoffer mot EGFR, Stat3, og Src (Cell Signaling), og mot RNA helikase A (RHA) (Abcam, Cambridge, MA). For immunoprecipitation analysen, 100 pl hver av fraksjonene 23-27 ble slått sammen, som EGFR immunecomplex ble felt ved hjelp av anti-EGFR-antistoff (Cell Signaling) og utsatt for immunblotanalyse for Stat3, Src og EGFR.
Utarbeidelse av anti-EGFR og mus IgG1-BNP sonder
Gull nanopartikler (GNPs), 0,1 nM, med en diameter på 40 nm ble kjøpt fra Ted Pella Inc. (Redding, California). Mus monoklonalt anti-EGFR [F4] antistoff ble kjøpt fra Abcam (kat. Nr. Ab62, kons. 1,2 mg /ml), og ikke-spesifikk monoklonalt IgG1 ble kjøpt fra Sigma (kat. Nr. M9629, kons. 1 mg /ml). Polyklonalt anti-Stat3 (kons. 0,2 mg /ml), polyklonalt anti-Src (0,1 mg /ml), polyklonalt anti-EGFR (0,2 mg /ml) og ikke-spesifikke kanin IgG (0,4 mg /ml) ble kjøpt fra Santa Cruz. Alle andre kjemikalier og buffer ingredienser for analysen utvikling ble innkjøpt fra Sigma. Den anti-EGFR-BNP-probe ble fremstilt ved å tilsette 10 ul av mus monoklonalt anti-EGFR-antistoff til 1 ml av GNPs. Etter inkubering i 15 minutter ved romtemperatur, ble proben blokkert med 2,5 mg BSA i 30 minutter. Etter sentrifugering ved 10.000 rpm i 5 minutter, supernatanten ble kastet, og nanopartikkel resten ble redispergert i 0,5 ml 0,25% BSA i 10 mM fosfatbuffer (PB). Proben ble deretter anvendt i analysen. Den negative kontroll mus lgG1-BNP-probe ble fremstilt ved å tilsette 10 ul av monoklonalt muse-lgG1-antistoff til 1 ml GNPs, og fulgte prosedyren er identisk med den som brukes for EGFR sonde fremstillingen. Mus IgG1 ble brukt her for å forberede styre sonde, fordi anti-EGFR monoklonalt antistoff er en mus IgG1 typen antistoff.
Detection og kinetisk binding studie av EGFR fra atom ekstrakt til BNP sonder
Den Panc-en kjerneekstrakt prøve ble fortynnet i fosfatbuffer (PB) til 1 mg /ml av totalt protein. I en prøvecelle for Dynamisk lysspredning (DLS) måling (Hellma kuverten QS 3 mm), 20 ul av anti-EGFR-BNP-probe ble blandet med 2 ul av prøven, og partikkelstørrelsen øker ble avlest med en DLS instrument (Zetasizer Nano ZS90 DLS system, Malvern Instruments Ltd., England) på nøyaktig 1, 6, 11, 16, og 30 minutter etter blandingen. Det samme eksperiment ble også utført med mus IgG1-BNP sonde. For å bekrefte spesifisiteten til anti-EGFR-BNP sonde i deteksjon av EGFR fra kjerneekstrakt, ble en inhibering eksperiment utført ved å behandle 5 pl av prøven med 1 pl av monoklonalt anti-EGFR-antistoff ved romtemperatur i 7 min og 24 min før bruk av prøven i analysen. Etter denne inkubering ble 20 ul av anti-EGFR-BNP sonde blandet med 2 ul av den behandlede prøve, og partikkelstørrelsen ble avlest ved 1, 6 og 11 minutter etter blandingen.
proteinkompleks bindings partner studie ved hjelp av polyklonalt antistoff
i et 1,5 ml mikrosentrifugerør, ble 80 ul av anti-EGFRGNP sonde blandes med 8 pl av prøven. Etter inkubering i 30 minutter ved romtemperatur ble denne oppløsning oppdelt i fire 20 mL porsjoner. Etter overføring inn i prøvecellen, ble partikkelstørrelsen til hver av disse partier les med en DLS instrument. Etter denne lesningen ble oppløsningen tilsatt med et polyklonalt antistoff: enten med 1 mL av anti-Stat3 eller 2 ul av anti-Src eller 1 ul av anti-EGFR eller 0,5 ul av kanin-IgG. Partikkelstørrelsen Økningen ble lest på nøyaktig 5 min og 10 min etter start av første lesning.
Dynamisk lysspredning (DLS) målinger
DLS målinger av alle prøve løsninger ble utført ved hjelp av en Zetasizer Nano ZS90 DLS systemet er utstyrt med en rød (633 nm) laser og en Avalanche fotodiode detektor (APD) (quantum effektivitet 50% ved 633 nm) (Malvern Instruments Ltd). DTS-applikasjoner 5,10 programvare ble brukt til å analysere dataene. Den gjennomsnittlige partikkelstørrelse (Z-gjennomsnitt) av løsningen ble oppnådd ved bruk av en Cumulant metode. For hver prøve ble ti DLS målinger utført med ett løp, og hvert løp varte i 10 sekunder. Alle målinger ble utført ved 90 ° detekteringsvinkel.
Resultater
Påvisning av atom EGFR, Src og Stat3 hetero
Vi har søkt å undersøke signale komplekse montering og dynamikken av interaksjoner av den hyperaktive Stat3, EGFR og Src [14], [16], [23] i sammenheng med den humane kreft i bukspyttkjertelen fenotype. Co-immunoprecipitation (co-IP) med immunoblotting analyse viser, EGFR immunecomplex fra Panc-1 eller Colo-357 hel-cellelysater inneholdt både Src og Stat3 (Fig. 1A (i)), Src immunecomplex inneholdt både EGFR og Stat3 (Fig . 1A (ii)), mens Stat3 immunpresipitatet inneholdt EGFR og Src (fig. 1A (iii)). For spesifisitet, det ikke-spesifikke kanin IgG i immunpresipitering og immunblotanalyse for Src, Stat3 eller EGFR viste ingen påvisbar protein (Fig. 1A, IgG, og data ikke vist), og den immunoblotting analyse utført på immun utfelles i nærvær av de respektive blokkerende peptider (BP) viste en fullstendig eller nesten fullstendig blokk av immun påvisning av Stat3, Src eller EGFR, sammenlignet med nivåene som detekteres i fravær av de blokkerende peptider (figur 1B (i) -. (iii), sammenligne + BP, nedre paneler til – BP, øvre paneler). Vi har fastslått at virkningen av siRNA knockdown av EGFR eller Src på kompleksdannelsen. Co-immunoutfelling med immunoblottingforsøk studier av hel-cellelysater fra Panc-1 celler viste at når EGFR er knockdown etter siRNA (Fig.1C (i), øvre bånd), forblir Src immunecomplex forbundet med Stat3 (Fig. 1C (i), IP: SRC), og vice-versa (fig 1C (i.), IP: Stat3). Likeledes når Src er knockdown av siRNA (Fig. 1C (ii), øvre band), forblir EGFR immunecomplex forbundet med Stat3 (fig 1C (ii), IP:. EGFR)., Og vice-versa (fig 1C (ii) , IP: Stat3). Egge (con) siRNA har ingen effekt. Disse funnene tyder på at i forhold til EGFR, Src og Stat3 heteromert kompleks, STAT3 proteiner forblir forbundet med Src eller EGFR, henholdsvis på siRNA knockdown av EGFR eller Src.
Immunoblotting analyser av immunecomplexes av EGFR (IP : EGFR), Src (IP: Src), og Stat3 (IP: Stat3), eller av ikke-spesifikk IgG ikke-immunpresipitatet fremstilt fra hel-celle-lysater av Panc-1 eller Colo-357-celler utransfekterte (A og B) eller transfektert med EGFR siRNA, Src siRNA, eller kontroll (con) siRNA (C) og sentret for Src, Stat3 og EGFR i fravær (A og C) eller nærvær (B) av Stat3 blokkerer peptid (Stat3 BP), Src blokkerer peptid (Src BP) eller EGFR blokkerer peptid (EGFR BP). Bånd tilsvarende proteiner i gelen er vist; inngang: mindre annet er angitt, representerer immunoblotting for den respektive immunoutfelte proteinet i den samme mengde av lysat benyttet i analysen; Dataene er representative for 3 uavhengige studier.
Vi stilte spørsmålet om den observerte EGFR, Src og Stat3 hete komplekse var til stede i kjernen. Co-immunoutfelling med immunblotting-analyse av kjernefysiske ekstrakter viser at EGFR immunecomplex inneholdt både Stat3 og Src (figur 2A (i), IP:. EGFR), Src immunecomplex inneholdt både Stat3 og EGFR (figur 2A (ii), IP:. Src) , mens Stat3 immunecomplex inneholdt både EGFR og Src (figur 2A (iii), IP:. Stat3). Disse data viste tilstedeværelsen av EGFR, Src og Stat3 heteromert kompleks i kjernen. For spesifisiteten av immunologiske reagenser, var ikke-spesifikke kanin IgG pull-down prøver som på lignende måte ble immunoblottet viste ingen påvisbar EGFR, Src eller Stat3 (fig. 2A, IgG og data ikke vist). Immunoblotting analyse sondering for Tata-bindende protein (TBP) bekreftet at ekstrakter som brukes i disse studiene er av kjernefysisk opprinnelse (Fig. 2A (iv)). Den heteromert kompleks ble validert ved å utføre sekvensiell immunoutfellingsanalyse, hvorved EGFR immunecomplex (IP: EGFR) ble videre underkastet en sekundær immunoutfelling ved å bruke anti-Src-antistoff (IP: EGFR /IP: Src) og deretter immunoblottet for EGFR og Stat3. Resultatene av disse undersøkelser viste tilstedeværelse av EGFR og Stat3 i de etterfølgende immunopresipitatene (figur 2B, IP:. EGFR /IP: Src). I motsetning til dette IgG pull-down som ble utsatt for immunblotting for EGFR eller Stat3 viste ingen påvisbare nivåer (fig. 2B, IgG), noe som ytterligere bekrefter spesifisiteten av de immunologiske reagenser som brukes.
(A og B) Immunoblotting analyser av immunecomplexes av EGFR (IP: EGFR), Src (IP: Src), Stat3 (IP: Stat3), EGFR /Src (IP: EGFR /IP: Src), eller av ikke-spesifikk IgG ikke-immuneprecpitate fremstilt fra nukleære ekstrakter av Panc-1 eller Colo-357 celler og sondering for Stat3, EGFR, Src, eller Tata-bindende protein (TBP); og (C), immunblotting-analyse av membranen (MEM) og cytosoliske (Cyto) fraksjoner og av kjerne (NUC) ekstrakter fra Panc-1 celler prober for (i) EGFR, (ii) Stat3 og (iii) Src. Bånd tilsvarende proteiner i gelen er vist; inngang: mindre annet er angitt, representerer immunoblotting for den respektive immunoutfelte proteinet i den samme mengde av kjerneekstrakt benyttet i analysen; IP: EGFR /IP: Src, sekvensiell immunoutfelling med anti-EGFR og deretter anti-Src-antistoff; Dataene er representative for 3 uavhengige studier.
Tilstedeværelsen av EGFR, Src og Stat3 kompleks i kjernen av kreft i bukspyttkjertelen celler ble ytterligere undersøkt ved å underkaste kjerneekstraktpreparater til gelfiltrerings-kolonne-kromatografi-analyse (Superdex200 , utelukkelse begrenser 200 kD), som beskrevet i «Materialer og metoder», i forbindelse med immunblotanalyse. De oppsamlede fraksjonene, som viste maksimal absorbans ved 280 nm (data ikke vist) ble immunoprobed. Resultatene viste at EGFR-proteinet først vises i fraksjon 23, og er til stede sammen med Stat3 og Src, og de tre proteinene samtidig påvises i fraksjonene 23-29 (fig. S1A). Resultatene viste også påvise Stat3 og Src proteiner i fraksjoner 30 gjennom 32 godt etter EGFR ble fullstendig eluert (fig. S1 A). Analyse av den tidligere rapporterte EGFR-proteinet partner, RNA helikase A (RHA) [24] viste også detekterbare nivåer som var hovedsakelig i fraksjonene 23 og 24 (fig. S1A, RHA). Disse fraksjoner ble videre underkastet ko-immunoutfellingsanalyse validere tilstedeværelsen av komplekset. Immunblotting-analyse av EGFR immunecomplex stilles fra de sammenslåtte fraksjonene 23-27 lenger viste tilstedeværelsen av Src og Stat3 (fig. S1B). Den tidlige og den samtidige eluering av EGFR, Src og Stat3 øke muligheten for at hvert av proteinene er en del av en høyere molekylvekt-proteinkomplekset, og også at de tre proteinene tilknyttede som en del av det samme kompleks, som foreslått av immunecomplex formasjonen . Det har vært en tidligere rapport om atom EGFR /Stat3 kompleks under forhold med mobil stimulering av EGF [10]. Vi undersøkte derfor om atom EGFR, Src, Stat3 komplekset var tilstede konstitutivt (uten stimulering ligand) i tumorceller. Immunoblotting analyse fant ingen vesentlige nivåer av Stat3 eller Src i EGFR immunecomplex eller av Src eller EGFR i Stat3 immunpresipitatet fra atom ekstrakter fra humant brystkreft, MDA-MB-231 og den menneskelige ikke-småcellet lungekreft, A549 linjer (fig. S1C), noe som tyder på en minimal mulighet for eksistensen av en konstitutiv atom EGFR, Src, Stat3 kompleks i de to kreftcelletyper. Disse studiene viser sammen for første gang at EGFR, Src og Stat3 danner et heteromert kompleks i kjernen av kreft i bukspyttkjertelen celler.
Gitt påvisning av EGFR, Src og Stat3 kompleks i hel-celle og nukleære lysater , var vi interessert i å bestemme den relative nivåer og størrelser av EGFR, Src og Stat3 i de ulike sub-cellulære fraksjoner. Membran og cytosoliske fraksjoner, og nukleære ekstrakter ble fremstilt fra PANC-1 celler i henhold til etablerte protokoller og som er involvert ved bruk av 10% Nonidet P-40 lyserings, og en lav-salt HEPES-buffer ekstraksjon for cytosolisk ekstrakt, en høy-salt HEPES buffer ekstraksjon for nukleære ekstrakter (18, 22), og 0,5% SDS buffer for membranfraksjonen. Immunblotting-analyse av prøver av lik total protein fra sub-cellulære fraksjoner viser at med hensyn til hver av de EGFR, Src, eller Stat3 protein, er størrelsen den samme i membranen (MEM), cytosoliske (Cyto) eller nukleær fraksjon (Nuc) (fig. 2C). Resultatene viser videre at nivået av det totale EGFR-proteinet er høyest i membranen, og er høyere i den cytosoliske fraksjonen enn i den kjernefysiske ekstrakt (fig. 2C (i)). I motsetning til dette viser resultatene at STAT3 nivåer er høyest i den cytosoliske fraksjonen, og høyere i kjerneekstrakt, sammenlignet med nivåene forbundet med cellemembranen (fig. 2C (ii)). Resultatene for Src viste også merkbare forskjeller, med membranassosierte nivåer høyere enn både den cytosoliske og atomnivå, som var nesten identiske (fig. 2C (iii)).
