Abstract
Bakgrunn
Aberrant aktivering av signalveier driver mange av de grunnleggende biologiske prosesser som følger startfasen og progresjon. Upassende fosforylering av mellomprodukter i disse signalveier er en hyppig observert molekylær lesjon som følger med uønsket aktivering eller undertrykkelse av pro- og anti-onkogene veier. Derfor er metoder som direkte spørring signalveien aktivering via fosforylering analyser i enkelte kreft biopsier forventes å gi viktig innsikt i den molekylære «logikk» som skiller kreft og normalt vev på den ene siden, og gjør det mulig for tilpassede intervensjonsstrategier på den andre.
Resultater
første dokumentet den største tilgjengelige sett tyrosinfosforylering nettsteder som er individuelt, differensielt fosforylert i lungekreft, og dermed gi en umiddelbar sett av narkotika mål. Deretter utvikler vi en ny beregningsmetodikk for å identifisere trasé som fosforyleringsaktivitet er sterkt korrelert med lungekreft fenotype. Til slutt viser vi muligheten for å klassifisere lungekreft basert på multi-varians fosforylering signaturer.
Konklusjoner
Svært forutsigbar og biologisk gjennomsiktige fosforylering signaturer av lungekreft gi bevis for eksistensen av et robust sett av fosforylering mekanismer (fanges opp av signaturer) til stede i de fleste lungekreft, og som på en pålitelig måte skille hver lungekreft fra det normale. Denne tilnærmingen bør forbedre vår forståelse av kreft og hjelpe sin behandling, siden fosforylering signaturer markere proteiner og trasé som fosforylering bør være hemmet for å hindre uregulert spredning
Citation. Wu CJ, Cai T, Rikova K , Merberg D, Kasif S, Steffen M (2009) En Predictive Fosforylering underskrift lungekreft. PLoS ONE 4 (11): e7994. doi: 10,1371 /journal.pone.0007994
Redaktør: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, USA
mottatt: 24. august 2009: Godkjent: 16 oktober 2009; Publisert: 25.11.2009
Copyright: © 2009 Wu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av et stipend fra National human Genome Research Institute (R01 HG003367-01A1 til SK), og American Lung Association (RG-52430-N til MS). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. D.M. og K. R. er ansatte i Vertex Pharmaceuticals og Cell Signaling Technology, henholdsvis. Verken selskapet gitt noen direkte midler til dette manuskriptet eller hadde noen rolle i analysen, beslutningen om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Disse forholdene endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
På molekylært nivå, kreft er heterogene sykdommer , som følge av genetiske faktorer, miljøkreftfremkallende og tilfeldig, somatisk mutasjon [1]. Fosforylering av proteiner er en viktig regulator av proteinaktivitet [2], og i særdeleshet, ombygging av tyrosinrester modulere kritiske signal- og kontrollprosesser [3]. I kreft, har avvikende fosforylering status viktige rester (sin tilstedeværelse eller fravær) blitt observert og dokumentert i mange studier, som inkluderer den opprinnelige onkogen, src [4], og mange andre [5].
Signaturer basert på proteinnivåer er i ferd med å bli utviklet [6]. Protein nivåer forventes å være sterkt korrelert med fenotype og proteinbaserte diagnose kan enkelt implementeres i de fleste store medisinske sentre. Overvåking av funksjonell status av proteiner kan derfor være svært relevante for kliniske applikasjoner, og gir et ekstra lag med spesifisitet for å øke vår vitenskapelige forståelse av årsaks progresjon av sykdommen. Fremgangsmåter for high-throughput påvisning av fosforylerte rester ved hjelp av massespektroskopi blir raskt utviklet [7], [8], [9], [10] og anvendes i studiet av signalveier [11] sammen med komplementære analyse og modellerings tilnærminger [ ,,,0],12], [13].
i denne artikkelen, undersøkte vi global tyrosinfosforylering data fra lungekrefttilfellene og normalt lungevev [14], som søker å identifisere differensielt fosforylert protein områder og forskjellig aktivert trasé, og for å vurdere deres egnethet som classifiers. Vi rapporterer et stort sett med nettsteder som er forskjellig fosforylerte i tumorer, mange av dem kan brukes som direkte mål for nye legemidler. Vi presenterer bevis for at visse veier er forskjellig aktivert, basert på deres globale fosforylering status ved hjelp av en ny beregningsorientert tilnærming til å utføre en proteinvariant av gen sett berikelse analyse.
Vi viser at et forholdsvis lite antall fosforylerte peptider observert ved at data [14] kan skille mellom normalt vev og tumor med utsøkt sensitivitet og spesifisitet. Vi validere vår fosforylering signatur ved hjelp av strenge kryssvalidering og testing på en tidligere upublisert uavhengig sett. Til slutt sammenligner vi bindingsaffinitetene av flere kinase hemmere med fosforyleringsaktivitet av sine mål i vår studie. Integrasjonen med farmasøytiske data fører til interessante hypoteser om den relative effekten av slike legemidler og foreslår uutforskede men potensielt potente lungekreft midler, fremhever potensielle kliniske anvendelser.
Det er et grunnleggende skille mellom prediktiv signaturer, slik som de utvikles her, og den observasjon at et protein blir uttrykt forskjellig (eller fosforylert) med statistisk signifikans. I prinsippet kan et protein være forskjellig fosforylert, men være av liten prediktiv verktøyet for den brede klassifisering av en sykdom eller for å utforme en personlig behandlingsstrategi. Differensial fosforylering av et protein som er en populasjon aggregat sammendrag. Det betyr at, i gjennomsnitt, fosforyleringen nivået av et protein som er høyere eller lavere i en kreft enn normalt vev. Imidlertid, for enhver gitt pasient sannsynligheten for feil i klassifisere biopsi som en kreft kan være så høyt som 0,49 (dersom fordelingen av målingene for kreft og normale vev overlapper hverandre). Ikke hensyn til sykdom heterogenitet er vurdert, og forhøyede nivåer kan føre utelukkende fra en undergruppe av sykdomstilfeller. Motsatt vil en signatur med høy prediktiv verdi tyder på at fosfo-områder som inngår i signaturen er en del av en kjerne sett av veier som er universelt operative i sykdommen. De er derfor potensielt reflekterende av en universell patogenetisk mekanisme for denne sykdom, og kan føre til oppdagelse av en «fosforylering logisk» som fanger vevsspesifikk, eller til og med en generell, neoplastisk fenotype. Heterogene kreft sub-typer, vil nødvendigvis kreve mer kompliserte signaturene, noe som krever et stort sett av prediktiv mekanismer som kan gi høy dekning av differensial aktivitet av sentrale baner i den spesifikke kreft. Til slutt, hvis de prediktive signaturer består av et lite sett med proteiner som implisere spesifikke pathways (som følger av vårt arbeid), blir dette sett veier et ettertraktet mål for en bred kombinato multi-target narkotikastrategi.
Resultater
Flere Tyrosin nettsteder er forskjellig fosforylert i Lung Cancer Tissue
Vi først analysert enkeltprotein nettsider for å finne de som er forskjellig fosforylert mellom 48 normal og 94 ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) tumorprøver. Våre resultater viser 129 unike aminosyre områder som var signifikant forskjellig fosforylert mellom normale og tumorprøver (falske funnrate, FDR
q
verdi 0,05). Av disse 77 av nettstedene var mer fosforylert i kreftvev og 52 områder var mer fosforylert i normalt vev. Tabell 1 viser høyest rangerte 20 protein nettsteder med den minste ranksum
p
verdier, med alle områder oppført i tabell S1.
I tillegg til de beste genene er oppført i tabellen mange andre prominente markører for kreft ble oppdaget i vår analyse. Spesielt er EGFR en reseptor tyrosinkinase involvert i lungekreft og er involvert i flere biologiske prosesser, inkludert apoptose, celleadhesjon, og vekst [15], [16], [17]. Mutasjoner av EGFR er sett i et sett av NSCLC med god respons på EGFR-inhibitor [18], [19]. Fosforyleringen statusene til to tyrosiner på den cytoplasmiske hale av EGFR ble funnet å være statistisk forskjellige, oppviser større grad av fosforylering i kreft. Residuene Y1172 og Y1197, er kjent for å regulere proliferativ aktivitet [20]. Interessant er Y1172 hyper-fosforylert (Tumor /Normal fosforylering spektral count ratio 1) bare i adenokarsinom (AD) prøver. Y1197 er hyper-fosforylert i både AD og plateepitelkreft (SCC) subtyper, men til en betydelig høyere grad i AD.
Nettstedet konkrete analyser avslørt, noe overraskende, at aminosyren mest konsekvent forskjellig fosforylert i normal og svulstvev var Y34 av alkohol dehydrogenase 1B, ADH1B (mindre fosforylert i tumorer). Dette proteinet deltar i flere relaterte prosesser som glykolyse, glukoneogenese, og fettsyremetabolisme. Dens uttrykk er oppregulert i sent stadium av rotte lunge utvikling, men nedregulert i human NSCLC [21]. Den spesifikke rolle Y34 er foreløpig ukjent, men den lave fosforylering teller kanskje reflektere enten nedsatt enzymaktivitet eller redusert protein overflod i svulster. Med sin rolle i alkoholmetabolismen, kan dette være en konsekvens av Warburg virkning hvorved tumorer anvende aerob glykolyse til å møte deres metabolske behov [22]. ADH1B ble nylig identifisert som en risiko modifier for squamous aerodigestive kreft, med en postulerte mekanisme av endret etanol stoffskiftet som å være medvirkende [23]. En annen studie bemerket redusert proteinnivåer ADH1B i brysttumorer [24], postulerte den manglende evne til å oksydere hydroksylgruppen av retinol blokkerer produksjonen av retinsyre, et molekyl som bidrar til å opprettholde epitelceller i sin differensiert tilstand.
Det var mange andre forskjellig fosforylerte proteiner. De som er hyperfosforylert i tumorer omfatter flere reseptor-tyrosin-kinaser (som er oppført i Tabell S2), og andre signaleringsproteiner, så som p38 delta-, protein kinase C deltaet, og medlemmer av PI3K signalveien, inkludert P85 beta. Omvendt, proteiner hypofosforylerte (svulst /normal-fosforylering spektral telleforholdet 1) i tumorer inkluderer transkripsjonsfaktorene STAT1 og STAT5, protein tyrosin fosfatase PTPN11, G-proteinkoblet reseptor GPRC5A, og kinaser MAPK1, MAPK3, og TNK2.
svært nøyaktig Klassifisering av svulstvev via Cross Validation
for å vurdere den potensielle nytten av overvåking protein aktivitet via tyrosinfosforylering data, utviklet vi classifiers å forutsi kreft /normale fenotyper av enkeltprøver . Spesielt undersøkte vi vår evne til å skille normalt vev fra kreft basert på lite sett med phosphotyrosines. Tabell 2 oppsummerer forestillinger av fem prediktive modeller vi undersøkte. To av modellene var basert på statistisk utvalgte nettsteder som gir maksimal diskriminerende effekt mellom kreft og normalt vev. Tre modeller var basert på biologisk drevet utvalg av nettsteder fra viktige veier i forbindelse med lungekreft. En ordnet regresjonsmodell (mål å redusere sannsynligheten for overfitting data) basert på alle signifikant forskjellig fosforylerte proteinsider (FDR
q
verdi 0,05) hell spådd prøvetimer med en gjennomsnittlig klassifisering nøyaktighet på 0,925 og et område-under-the-kurven, AUC på 0,974 i en streng bootstrapped kryssvalidering analyse som nøye skiller trening på tilfeldige undergrupper av data og testing på de gjenværende delsettet. Utvalget av mest informative nettsteder brukes til å konstruere modellen ble også gjort på treningsdata. Gjennomsnittlig antall fosfotyrosin nettsteder som brukes på tvers av alle bootstrap studiene var 88.
Vi har også undersøkt om biologisk informerte modeller basert på relevante genet moduler kan levere en lik nøyaktighet. Nærmere bestemt, regresjonsmodeller basert på genene i MSigDB «spredning» protein-set (ofte referert til som «gensettene» i mikromatrise litteraturen) [25], og to forskjellige protein-sett som representerer EGFR-reaksjonsveien, ble også vist å diskriminere mellom normale og tumorprøver med høy nøyaktighet. For EGFR sti, vurderte vi to representasjoner: en «kjerne» bane med 11 proteiner (Biocarta) og en «utvidet» bane med 47 proteiner (HPRD). Proteinene er oppført i Tabell S3. Våre resultater tyder på at mens kjerne EGFR-proteinene gir en rimelig nøyaktighet for å skille kreft sammenlignet med normalt vev (0,83 AUC), den «ekspanderte» EGFR vei, med andre proteiner, utfører signifikant bedre (0,96 AUC). De mest informative proteiner i den utvidede veien ikke inkludert i kjerne EGFR-nettverket er CAV1, GAB1, PXN, og PTPN11. Til slutt, en modell basert på de 20 beste nettsteder med gode resultater har en gjennomsnittlig klassifisering nøyaktighet på 0,88 og AUC på 0,94. Dette klassifiseringsstøtter muligheten for å bygge en relativt billig brikken ved hjelp av meget få steder som markører for å muliggjøre deteksjon av kreftceller basert på fosforylering analyser.
Disse resultater, tatt sammen, tyder på at fosforylering status av proteiner kan benyttes å utvikle modeller som forutsier en ondartet fenotype av kliniske prøver med meget høy nøyaktighet, lik ytelse rapportert fra mRNA uttrykk (se note S1) [26].
svært nøyaktig Classification of Cancer Tissue via Tippe på selvstendig Validering datasett med 16 NSCLC prøver
Vi søkte to regresjonsmodeller opplært fra de 142 prøvene til et uavhengig datasett som består av 16 NSCLC prøvene. Koeffisientene som brukes til å integrere fosforylering nivå av proteiner i de to modellene er vist i tabell supplerende S4 og S5. Ved 90% sensitivitet for kreftpasienter i treningsdata, den statistiske modellen ved hjelp av de 20 mest informative fosforyleringsseter har 87,5% sensitivitet på valideringsprøvene. Vi gjentok analysen ved hjelp av kategorien «Formerinasanalyse gener» fra C2 database over MSigDB. Den tilsvarende validering følsomhet er 93,8%, som er litt bedre enn den følsomhet som oppnås ved den statistiske modell. De mest informative nettsteder som brukes til spredning modulen klassifikator er hentet fra EGFR og SYK (Spleen tyrosine kinase).
Fordi vi hadde ingen nye selvstendige normale prøver å vurdere spesifisiteten av classifiers, vedtok vi en variant av en resampling tilnærming for å estimere den totale nøyaktighet på uavhengig sett (beskrevet i metodedelen). Vi rapporterer gjennomsnittlig sensitivitet, spesifisitet, nøyaktighet og AUC i Tabell S6. Med sju prøvene utelatt fra treningsdata, viste de nye classifiers litt redusert følsomhet i løpet av de 16 valideringskreftprøver. Utbredelsen modulen klassifiserer viste bedre følsomhet, men lavere spesifisitet enn en basert på statistisk mest informative markører. Anslagene for nøyaktighet for disse to classifiers varierte 84-88%, og estimert AUC er 92-93%.
Differensial Fosforylering av kreft Associated Pathways
For å få innsikt i biologiske prosesser som aktivitet kan moduleres i lungesvulster, testet vi 639 kuraterte protein-sett fra den kanoniske sti database over MSigDB å avgjøre om de overordnede fosforylering nivåer av tyrosin steder i proteiner fra hver bane er signifikant forskjellig mellom normale og tumorprøver. Vi var ikke i stand til å bruke tradisjonell Gene Set Enrichment analyse [25] for å oppdage disse feilregulert trasé på grunn av den ekstreme sparsity av dataene. I stedet har vi tilknyttet en metaprotein representasjon med hver sti og beregnet hvorvidt fosforylering nivået av dette metaprotein er korrelert til endringer i fenotype. Denne teknikken er en ny variant av metagene teknikk utplassert for genekspresjon analyse.
I alt 181 proteiner observert i dette datasettet var et medlem av minst en av de 639 protein-sett. Tabell 3 viser de beste 15 protein-sett som viser differensial fosforylering nivåer. Proteinet-sett som viser den største endringen i sin samlede fosforylering nivå når man sammenligner normalt og NSCLC vev er KEGG bane «HSA05211 nyrecellekarsinom.» Av de 181 proteinene vurderes her, 14 av dem tilhører denne protein-set, og 9 vises høy korrelasjon med metaprotein fosforylering nivåer. Disse 14 proteiner er vist i tabell Tilsetnings S7, i hvilken en positiv koeffisient indikerer høyere fosforylering i tumoren. To andre veier som er spesielt relevant for lungekreft som har vesentlig forskjellige generelle fosforylering nivåer er «HSA05223 ikke-småcellet lungekreft» og «METPATHWAY BIOCARTA.» Fem flere veier er eksplisitt relatert til kreft: «HSA05220 kronisk myelogen leukemi», «HSA05215 prostatakreft «,» HSA05218 FØFLEKKREFT «,» HSA05213 livmorkreft «og» HSA05210 tykktarmskreft. «To veier er generiske for signalveier,» HSA04070 fosfatidylinositol signalering «og» HSA04010 MAPK signalveien «, og geneset med flest medlemmer var den «inte celleadhesjon GENMAPP», med 32 observerte og 28 korrelerte proteiner.
på grunn av sin sentrale rolle i lungekreft, undersøkte vi EGFR sti i større detalj. I figur 1, kartlegger vi alle observerte tyrosinfosforylering aktivitetene til bestanddel proteiner, med en modell konstruert fra de KEGG og HPRD /NetPath databaser. Som forventet, EGFR og mange nedstrøms proteiner i veien er forskjellig fosforylert i NSCLC prøvene. I alt 10 tyrosin områder er mer fosforylert i tumorer (rosa), 7 mer fosforylert i normalt vev (grønn) og 12 proteiner ble fosforylert i en tilsvarende grad i begge prøvetyper. Selv om ingen klare mønster er lett synlig, er det kanskje overraskende å observere at tyrosinene Y186 og Y204 på ERK1 og ERK2 henholdsvis er mindre fosforylert i lungesvulster. Det har blitt observert mange ganger at overskytende fosforylering av ERK1 /2 kan resultere i cellesyklus-stans, gjennomgått i [27], og således de lavere nivåene observert i tumorer kan føre til økt celle sykling, krever imidlertid denne ytterligere studier.
Pink indikerer høyere fosforylering i tumorprøver, mens grønn indikerer høyere fosforylering i normale vevsprøver. Gule nodene ble observert å være fosforylert, men ikke endres vesentlig i de to typene. Grå noder ble ikke observert i analysen. En rød pil (eller kant) gjelder en kinase til målet, grønne kanter indikerer en fosfatase og sitt mål. Blå kanter indikerer aktivering, som kanskje ikke er direkte. Til slutt, en diamantform på enden av en kant indikerer fosforylering, mens en sirkel indikerer en inhibering av fosforylering. Pilspisser indikerer aktivering, noe som kan være indirekte.
Fosforylering analyse av ulike Tumor Subtyper
Den histopatologiske æren av AD og SCC kan være utfordrende [28], men med ulike behandlingstilbud tilgjengelig [29], en viktig en. Vi analyserte fosforylering nivåforskjeller mellom AD og SCC vev på nivåene av enkelte områder, stier og protein-sett.
Til vår overraskelse, det er ingen enkeltsider som er statistisk forskjellig fosforylert i de to kreft subtyper i eksisterende datasettet. Tilsvarende ansette metaprotein analysen beskrevet ovenfor, vi observerer ingen signifikant forskjellig fosforylerte trasé eller protein-sett (Supplementary Tabell S8). Den tidligere diskutert genet modeller for svulst subtype klassifisering ble evaluert, med resultater oppsummert i Tilleggs Tabell S9. Den eneste klassifiserer som utfører rimelig bra, med AUC = 0,78, er basert på EGFR valgte funksjoner manuelt med vekt på områder som observeres ofte (uten hensyn til kreft subtype). Forutsatt at alle prøvene ble diagnostisert riktig, disse resultatene tyder på at forskjellene i fosforylering målinger mellom AD og SCC er små og vanskelig å oppdage med rene statistiske eller maskinlæringsmetoder. Vi forventer at en mer kvantitativ analyse ved hjelp av relative topparealer, i motsetning til spektrale teller, vil trolig gi bedre resultater for denne oppgaven.
Sammenligning av Classifiers Basert på mRNA Expression data med fosfotyrosin data
For sammenligning, inkluderer vi i tillegg en rapport om nøyaktighet på classifiers basert på mRNA uttrykk. Basert på dagens data, ser det ut til at fosforylering status og mRNA uttrykk er omtrent like informativ med hensyn til å klassifisere prøvene som svulster eller normal. For å skille tumor subtyper, phosphotyrosines fungerer rimelig godt (AUC ~0.78), men classifiers bygget med mRNA transkripsjonsnivåer gjør det signifikant bedre (AUC ~0.98). Verken type data er vellykket til å skille tidlig fase (fase I og II) fra sent stadium tumorer (trinn III og IV). Men denne «feil» kan gjenspeile tilsvarende biologi av de primære svulster i de to sakene, som kanskje ikke endres vesentlig som metastaser kolon fjerne områder. Interessant, har vi ikke observerer en signifikant korrelasjon mellom disse mRNA nivåer som er forskjellig uttrykt, og differensial tyrosinfosforylering nivåer av relaterte proteinprodukt, fremhever den komplementære natur opplysninger gitt av aktivitetsbaserte tiltak.
Diskusjoner
resultatene presenteres i denne artikkelen åpner døren til en rekke fremtidige retninger i både grunnforskning og translasjonsforskning. Forstå nøyaktig rolle fosforylering måling i regulering av signalveier i kreft er fortsatt en viktig utfordring, og vi primært fokusert på rollen av EGFR og celleproliferasjonsprosesser veier. Vi har identifisert et sett av tyrosinrester som er differensielt fosforylerte i kreft og normalt lungevev. Mer enn mRNA-transkript eller protein ekspresjonsnivåer, blir fosforyleringen status av utvalgte rester knyttet til den funksjonelle aktiviteten til de tilhørende genprodukter. Dette er spesielt viktig i potensielt kreftformer som nærvær eller fravær av ulike reseptorproteiner kan ikke gjenspeile aktiviteten til nedstrøms signalmellomprodukter. Dette scenario kan være viktig i minst to tilfeller med hensyn til signalveier, en i hvilken en reseptor er til stede, men det er ingen aktiverende ligand (eller en mengde av en ikke-fungerende ligand) for å initiere nedstrøms signaleringshendelser, eller hvis -reseptoren er til stede, men mutert og aktiv og derfor ute av stand til å overføre binde signal.
som i noen systematisk genom-skala undersøkelsen, observasjon av uventede resultater utfordrer evnen til å utlede forklarende hypoteser. Slik er tilfellet med den observasjon at ADH1B er den mest differensielt fosforylert protein, med redusert mengder observert i tumorer. Innblandet i squamous aerodigestive svulster [23] hvor en fremtredende rolle i metabolismen av inntatt etanol er overbevisende, kan det være slik at i lungesvulster, kan tumorassosiert hypoksi være å endre celle karbohydrat metabolismen.
Det sentrale resultatet av analysene som presenteres her er demonstrasjonen som signaturer basert på differensial fosforylering av tyrosinrester vise robust ytelse til å klassifisere kreft fra normalt vev. Dette gjelder uansett om signaturen er basert på et stort antall områder protein, et mindre antall, eller sti-spesifikke rester. Dette resultatet ble bekreftet i både streng kryssvalideringsstudie samt på et uavhengig sett. Klassifiseringen Nøyaktigheten av kreft sammenlignet med normalt vev er i det vesentlige ekvivalente med de resultater som ble oppnådd ved microarray eksperimenter, selv når den utføres på bulk-dissekert vev.
Tyrosinkinaser som er hyperfosforylert i lungesvulster er antatt å være unødvendig aktivert, og kan derfor betraktes som potensielle terapeutiske mål for inhibering. I denne studien, observerer vi opptil 19 tyrosin-kinaser som har statistisk forskjellig fosforylering nivåer mellom lungekreft og normalt vev, og nesten alle av disse er hyperfosforylert i lungesvulster (Tilsetnings Tabell S2).
Aktiveringen av multiple tyrosinkinaser i en gitt kreft har tidligere blitt observert i glioblastoma multiforme [30]. I dette tilfelle var nødvendige kombinasjoner av tyrosinkinaseinhibitorer (TKI) for hovedsakelig å redusere cellenes levedyktighet. I stedet for å kombinasjoner av medikamenter, er et alternativ å anvende en multi-kinase-inhibitor, slik som imatinib, sorafenib og sunitinib, som hver individuelt er i stand til å inhibere flere tyrosinkinaser [31]. Dette førte oss til å utforske mulige eksistensen av en multi-kinase inhibitor som målrettet en stor andel av disse kinaser som vi observerte skal hyperfosforylert i lungekreft. En omfattende, offentlig tilgjengelige datasett av TKI bindende data [32] analysert 38 TKI mot 317 kinaser. Vi integrert TKI bindende data med vår differensial fosforylering analyse (Supplementary tabell S2). Av de tyrosin kinsases som bindende data ble rapportert, og vi finner at nesten alle av dem ble bundet av TKI dasatinib med høy affinitet (Kd er 2 nM). Dette tyder på at dasatinib kan potensielt være et nyttig terapi for et utvalg av pasienter med lungekreft. Mer generelt vår studie illustrerer anvendeligheten av å integrere globale tyrosinfosforylering assays [14] med medikamentbindingsdata for raskt å komme frem til potensielle terapeutiske muligheter, og muligheten for å forutsi en respons på bestemte kinase inhibitorer.
Analyse av reaksjonsveien -spesifikke total-fosforylering nivåer demonstrerer spesifisiteten av den generelle tilnærmingen, som 7 av de 15 protein-sett som er identifisert er uttrykkelig definert som kreft protein-sett. Signalveier sto for fire av de gjenværende 15 beste protein-sett, inkludert de viktigste eksemplene på phosphatidylinositol og MAPK signalveier. Pathways nedstrøms av EGFR og Met-reseptorer, med fremtredende roller i lungekreft biologi, var tilsvarende innblandet.
Mens resultatene av fosfotyrosin signaturer var beskjeden for diskriminering av AD og SCC, med topp resultater klassifikator å ha en AUC på 0,78, mRNA transkripsjonsnivåer klassifisere disse subtypene med høyere nøyaktighet, og verken metoden skiller tidlig fra avanserte stadier av lungekrefttilfellene. Sistnevnte observasjon kan gjenspeile en begrensning av metoden, eller det kan stemme overens med biologi av lungekrefttilfellene, ved at fundamentalt nye prosesser ikke er nødvendig for progresjon, bare at nok tid har gått for feilregulert gener og veier å erodere videre inn i omkringliggende vev og som metastaser har oppstått.
Fremtidige utfordringer for karakterisering av tumorer basert på fosforylering signaturer omfatter de relative sparseness av data (spesielt blant flere prøver), konvolveringen av proteinnivåer med fosforylering nivåer, og den semi- kvantitativ natur spektral telling for måling peptid overflod. Men enkle forbedringer finnes for å løse hver av disse begrensningene. Det er sannsynlig at den mest signifikante forbedring ville resultere fra bruken av stabile isotopen etiketter. Disse vil tillate direkte sammenligninger mellom flere prøver, og øke kvantitativ nøyaktighet. Det faktum at slike utmerket ytelse for å klassifisere normal versus svulstvev kan allerede oppnås gjør ytterligere forbedringer svært ønskelig. Et annet løfte er mulighet for å utvikle signaturer for å veilede behandling og forutsi pasientens utfall. Kinase hemmere er en spennende ny klasse av behandlinger for kreft [33], [34], men senere studier har understreket at enkelt mål av hemming kan ikke være tilstrekkelig for å oppnå en terapeutisk respons [30]. Kombinasjoner av kinase-inhibitorer, med hvert potensielt binding til flere mål, kan være nødvendig for å hemme uønskede vekst- og spredningssignaler aktiv i neoplasmer [35]. De fosforylerte proteiner analysert her representerer mål av kinaser som bør trolig bli hemmet for å oppnå effekt. Computational [36] eller eksperimentelle [37] metoder for å utlede de aktive kinaser vil potensielt bidra til identifisering av relevante terapeutiske mål i enkeltsaker.
Konklusjoner
Fordi upassende aktivering av signalveier representerer grunnleggende biologiske prosesser i kreft, analyserte vi fosforylering data fra lungekreft og normalt lungevev å identifisere forskjeller. Vi identifiserte flere hundre forskjellig fosforylerte steder i lungekreft, og utviklet ny beregningsmetodikk for å identifisere veier som fosforylering er feilregulert. Til slutt, demonstrerte vi muligheten til å klassifisere lungekreft med høy nøyaktighet basert på multi-varians fosforylering signaturer. Fosforyleringen områder identifisert gi en umiddelbar sett av romanen narkotika mål, og en analyse av komplement av tomtene gir logikk for valg blant potensielle behandlinger med multi-målrettede kinase hemmere eller kombinasjoner av selektive hemmere.
Materialer og metoder
data~~POS=TRUNC
prosedyrene for eksperimenter og kjøpet av tyrosin-fosforylering data ble beskrevet i forrige publisering [14]. Det første datasettet inneholder 151 NSCLC og 48 normale lungeprøver. Av de 151 tumorprøver, ble 42 adenokarsinom (AD) prøver og 52 plateepitelkarsinom (SCC) prøver med tilgjengelig klinisk informasjon som brukes i klassifiseringen analysen. De fleste av de 4551 observerte fosforyleringsseter ble identifisert i et forholdsvis lite antall prøver. For våre analyser, har vi inkludert de områdene som ble fosforylert i minst 10% av prøvene under vurdering. Et annet datasett bestående av 16 NSCLC prøvene som ikke var opprinnelig med i [14] (og er derfor tidligere upublisert) ble brukt for å gi en uavhengig validering av prediktiv signatur.
Statistical Analysis for Differential Fosforylering av Protein nettsteder
