Abstract
Bakgrunn
arrangøren og 5 «enden metylering regulering av tumorsuppressorgener er et felles trekk ved mange kreft. Slike hendelser fører ofte til taushet av disse viktige gener og dermed kan de bidra til utvikling av kreft, inkludert prostatakreft.
Metodikk /hovedfunnene
For å identifisere metylering endringer i prostata kreft, utførte vi et genom-wide analyse av DNA metylering ved hjelp av Agilent menneskelige CpG island arrays. Ved hjelp av beregningsorientert og gen-spesifikk validering tilnærminger vi har identifisert et stort antall potensielle epigenetiske biomarkører for prostatakreft. Ytterligere validering av kandidat gener på en egen kohort av lave og høye grad av prostatakreft ved kvantitativ MethyLight analyse har tillatt oss å bekrefte DNA hypermethylation av
HOXD3 Hotell og
BMP7
, to gener som kan spille en rolle i utviklingen av svulster høy klasse. Vi viser også at arrangøren hypermethylation er ansvarlig for downregulated uttrykk av disse genene i DU-145 PCa cellelinje.
Konklusjon /Betydning
Denne studien identifiserer nye epigenetiske biomarkører for prostatakreft og prostatakreft progresjon, og gir en global vurdering av DNA metylering i prostatakreft
Citation. Kron K, Pethe V, Briollais L, Sadikovic B, Ozcelik H, Sunderji A, et al. (2009) Funn av Novel Hypermethylated Gener i Prostate Cancer Bruke Genomisk CpG Island Mikromatriser. PLoS ONE 4 (3): e4830. doi: 10,1371 /journal.pone.0004830
Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Ordway Research Institute, USA
mottatt: 24 november 2008; Godkjent: 17 februar 2009; Publisert: 13 mars 2009
Copyright: © 2008 Kron et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Canadian Prostata Cancer Research Initiative, National Cancer Institute of Canada (# 18568). Ontario Student Opportunity Trust Fund, Scace Prostate Cancer Fellowship. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den vanligste diagnosen kreft i menn og den nest største årsaken til kreft i forbindelse med dødsfall i USA [1]. Studier har vist at PCa er en kompleks sykdom påvirket av genetiske og ikke-genetiske epidemiologiske faktorer, og tidlig diagnose er kritisk i den kliniske behandlingen av sykdommen. En vanlig patologisk variabel gitt i løpet av prostata svulst, med høyere score gjenspeiler dårlig differensiert karsinom. Gleason scorer ≤6 karsinom anses lav karakter, Gleason 7 er middels klasse, og de med Gleason scorer 8 og over regnes som høy klasse (for siste gjennomgang på karaktersystem, se [3]).
epigenetiske modifikasjoner har vist seg å påvirke genuttrykksmønster og ofte bidra til patogenesen av mange kreftformer [4]. Eksempler på epigenetiske histonmodifikasjonene omfatter metylering av spesifikke lysinrester, acetylering /deacetylering av lysinrester, og fosforylering av histon haler, som hver har varierende effekter på regulering av gentranskripsjon. Disse modifikasjonene forårsake unormale genuttrykksmønster og således anses for å bidra til utvikling av kreft [5], [6]. Avvikende CpG dinucleotide metylering er et anerkjent epigenetisk kjennetegn på mange kreftformer. Global genomisk hypometylering er funnet i forbindelse med lokaliserte regioner av hypermethylation, typisk i CpG øyer som vanligvis forekommer i promotorene eller 5 «regioner av gensekvenser [7]. Promoter hypermethylation virker sammen med spesifikke histonmodifikasjonene til taushet gener ved direkte inhibering av transkripsjonsfaktor biding [8], ved binding av metyl CpG-bindende domeneproteiner [9], eller gjennom interaksjoner med histon modifiserende enzymer [10]. Dette epigenetisk mekanismen kan gi en vekstfordel til kreftceller ved hypermethylation av tumorsuppressorgener. Følgelig kan DNA-metylering hendelser tjene som nyttige biomarkører [11], propelling et søk etter både diagnostiske og prognostiske indikatorer.
CpG island hypermethylation ved PCA er et felles arrangement med over 30 hypermethylated loci tiden identifisert [12]. Den beste preget av disse hendelsene,
GSTP1
promoter metylering, forekommer i 90% av kreft og 70% av forløper høy klasse prostata intraepitelial neoplasi (PIN) lesjoner [13], [14] og kan også være påvises i blod og urinprøver [15]. Dermed
GSTP1
metylering kan tjene som et nyttig diagnostisk markør for PCa. Nylig har betydelig fremskritt blitt gjort i high-throughput screening epigenomic for identifisering av nye mål av DNA-metylering [16]. Senere har andre godt karakterisert hypermethylated gener er identifisert ved PCA inkludert
RASSF1A
,
CDH1
, og
CDKN2A
, for å nevne noen. Imidlertid har ingen genet studert hittil blitt identifisert som en spesifikk diagnostisk /prognostisk biomarkør ved PCA lik
GSTP1 product: [17], [18].
I denne studien, søkte vi å analysere metylering på et genom bred skala ved hjelp av humane CpG island mikromatriser å avdekke roman methylatled loci innen prostatakreft. Blant et panel av roman og /eller ulikt denaturert loci at vi identifisert, vi videre karakterisert
HOXD3 Hotell og
BMP7
hjelp av en kombinasjon av MassARRAY® EpiTYPER analyse og kvantitativ MethyLight analyse, og vurderes uttrykk i DU-145 PCA celler.
Metoder
Pasientprøver prøver~~POS=HEADCOMP
20 Dypfryst vevsprøver PCA (10 Gleason scorer seks eller ren mønster 3 (PP3), og 10 Gleason score 8 eller ren mønster 4 (PP4)) hentet fra prostatektomi eksemplarer av pasienter med prostatakreft diagnostisert mellom 2001 og 2007 ble samlet inn fra vevet banken ved University Health Network (uhn), Toronto. Pasienter som hadde behandling før operasjonen ble ekskludert. En annen serie av prøver som består av 39 formalinfikserte, parafininnstøpte (FFPE) PCA prøver (20 PP3 og 19 pp4) fra pasienter diagnostisert mellom 2006 og 2008 ble likeledes samlet for valideringssettet. Alle pasienter samtykket til donasjon av fjernet vev til uhn vev bank og prøvene ble oppnådd i henhold til protokoller godkjent av Forskningsetisk styret fra Mount Sinai Hospital (MSH) og uhn, Toronto, ON, Canada. PCA prøvene ble utsatt for histologisk undersøkelse av en ekspert patolog (TVDK) for uavhengig bekreftelse på Gleason karakterer.
Cellelinjer og DNA-ekstraksjon
Menneskelig PCA cellelinjer LNCaP (ATCC # CRL- 1740 ), DU-145 (ATCC # HTB-81), PC-3 (ATCC # 59500) og 22RV1 (ATCC # CRL- 2505) ble oppnådd fra Drs. M. Zielinska, R. Bristow, og E. Diamandis. Alle celler ble dyrket som monolag i RPMI 1640 medium (Life Technologies), og supplert med 10% føtalt bovint serum. Alle cellelinjer ble dyrket i fuktet atmosfære med 5% CO
2 ved 37 ° C. DNA ble ekstrahert etter høsting av cellene ved trypsinering etterfulgt av DNA ekstraksjon ved hjelp av QIAamp DNA mini kit (Qiagen Inc, Mississauga, ON, Canada), ved hjelp av protokollen anbefalt av leverandøren.
5-Aza 2 «-deoxycitidine (DAC) behandling og RT-PCR
250 ug /ml stamløsning av 5- aza- 2-deoxycitidine (DAC) (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada) ble fremstilt i vann og holdt ved -80 ° C inntil bruk. DU-145-celler ble sådd ut i 6 cm skåler og inkubert i dyrkningsmedium med 2 ug /ml DAC for 4 dager med medium bytte hver 2 dager. Cellene ble høstet og total RNA ble ekstrahert ved hjelp Trizol (Invitrogen, Carlsbad, California), ved hjelp av protokollen anbefalt av leverandøren.
Primer sekvenser for RT-PCR av
BMP7 Hotell og
HOXD3
har blitt beskrevet tidligere [19], [20] og er som følger: (
BMP7
fremover) 5′-AGA GCA TCA ACC CCA AGT-3 «, (
BMP7
omvendt) 5′-CTA CTC AGG CCC CAG CTT-3 «; (
HOXD3
fremover) 5′-AGG ATC CTG GTC TGA ACT CAG AGC AGC AGC3 «, (
HOXD3
bakover) 5′-ACT CGA GTT CAT CCG CCG GTT CTG GAA CCA-3 «.
DNA
Frisk frossen arkiverte vev ble hurtigfrosset i flytende nitrogen, knust, og genomisk DNA ble isolert ved hjelp av QIAamp DNA mini-sett (Qiagen) ifølge settprotokollen. FFPE vev ble seksjonert (7 mm) og lufttørket på lysbilder. Områder med en distinkt Gleason karakter i H E beiset lysbilder med minst 80% eller mer neoplastiske celler ble merket og de tilsvarende områdene ble identifisert på FFPE- seksjoner for høsting celler. Separate prøver med histologisk bekreftet normalt vev ble merket også. De beriket celle populasjoner fra uthevede områder ble deretter manuelt microdissected og genomisk DNA ble isolert ved hjelp av QIAamp DNA mini kit bruker en modifisert protokoll med utvidet proteinase K fordøyelsen. I korte trekk ble vev microdissected spaltet i 30 pl proteinase K ved 56 ° C over natten, fulgt av en tilsetning av 20 pl proteinase K-fordøyelse, og i en time ved 56 ° C den følgende dag. Den Qiagen anbefalte protokoll for FFPE vev ble deretter fulgt.
Differensial Metylering Hybridisering (DMH) og menneske CpG Island Mikromatriser
differensial metylering hybridisering teknikk for utarbeidelse av denaturert amplikonene ble utført som beskrevet tidligere [21]. Kort fortalt ble genomisk DNA (0,2 mikrogram) fra PP3 og PP4 tilfeller fordøyd med
Mse
I. De spaltede ender ble ligert med glødet H-12 /H-24 linkerne, etterfulgt av ytterligere oppslutning med to påfølgende runder med fordøyelsen med metylering sensitive enzymer, nemlig
Hpa
II og
Bst
UI . Linker PCR reaksjoner ble deretter utført med forbehandlet DNA for å generere de endelige målet amplikonene for microarray hybridisering. Endelige amplikonene ble renset ved anvendelse av QIAquick PCR-rensesett (Qiagen) ifølge produsentens protokoll. Referanseprøven besto av DNA isolert fra lymfocytter av seks friske menn alders matchet med PCA pasienter. Referanseprøver ble behandlet på samme måte for endelig målet generasjon og sammenslåtte amplikonene ble co-hybridisert til testtilfeller for individuelle arrays.
Data Analysis
Alle microarray data generert er i overensstemmelse med gjeldende MIAME standarder i henhold til brazma
et al product: [22].
Statistiske analyser ble utført med statistikkpakken
limma
av
R product: [23]. Prinsippet er å tilpasse en lineær modell for hver sonde der logg
2-forhold på røde kanal intensitet og grønne kanal intensitet tilbakegang på en tumor-indikator variabel (I). Vi utførte tre sammenligninger: Pure Pattern 3, Gleason 6 (PP3) (I = 1) vs. Referanse (I = 0), Pure M.4, Gleason 8 (PP4) (I = 1) vs. Referanse (I = 0) og PP4 (i = 1) sammenlignet med PP3 (i = 0), for å finne gener som har ulike profiler metylering på tvers av de to gruppene sammenlignet. Disse sammenligningene er analog til en klassisk to-utvalgs
t
-test analyse. Alternativt kan vi også brukt en empirisk Bayes
t
-test. Dette har samme tolkning som en vanlig
t
-statistic bortsett fra at standardfeil er blitt moderert over gener (krympet mot en felles verdi) ved hjelp av en enkel Bayesiansk modell. Dette har effekten av å låne informasjon fra ensemblet av gener for å gjøre den slutning om hver enkelt gen mer robust. Den moderert
t
-statistic har et økt antall frihetsgrader i forhold til ordinær
t
-statistic, reflekterer større pålitelighet knyttet til glattet standard feil. Våre analyser ble utført etter pre-dataene behandles. I det første tilfellet, brukte vi en bakgrunn korreksjonsmetode levert av Agilent. I det andre tilfellet, brukte vi en metode implantert i
limma
. En konvolusjon av normal og eksponentiell distribusjoner blir montert på forgrunnen intensiteter ved hjelp av bakgrunns intensiteter som en kovariat, og den forventede signal gitt observert forgrunnen blir korrigert intensitet. Dette resulterer i en jevn monoton transformasjon av bakgrunn subtrahert intensitet slik at alle de korrigerte intensiteter er positive. Begge metodene gode resultater på våre data. Vi deretter brukt en løss normalisering prosedyre innenfor arrays for å fjerne eventuelle systematiske tendenser som oppstår fra mikromatriseteknologi fra metylering tiltak [24].
Partek dataanalyse og integrasjon
Data fra Agilent Feature Extraction programvaren txt ble analysert ved hjelp av Partek Genomisk Suite programvare (PGS) under anvendelse av en modifikasjon av tidligere beskrevne protokoller [25], [26]. De behandlet R og G kolonnedata fra 10 PP3 og 10 PP4 ble importert til PGS. Den behandlede R signal samsvarer med tumor-DNA og behandlet G signal samsvarer med normal lymfocytt-DNA. Kreften spesifikt signal på tvers av alle prober ble normalisert som et forhold til baseline bruker Normal å Baseline Tool i PGS, hvor baseline data samsvarer med normal menneskelig lymfocytt DNA. Dataene ble deretter logge
2 transformert med PGS Normalisering og Skalering Tool.
Slik normalisert og forvandlet datasett ble deretter brukt for påvisning av kreft bestemte metylering profiler, og sekundært å skille mellom PP4 og PP3 spesifikke metylering profiler. For å oppdage betydelig kreftspesifikke berikelse /utarming, utførte vi Hidden Markov Model (HMM) region deteksjon over ca 244 000 prober med følgende parametre: minimum sonder: 5, deteksjon heter det: -2 2; ignorere tilstand: 0, maksimal sannsynlighet: 0.95, genomisk forfall: 10000, sigma: 1. Slike oppdaget genomiske regioner ble kommentert til de tilsvarende gener ved hjelp av PGS genet merknad verktøyet med Affymetrix HuGene-1_0-st-v1.na24.hg18.transcript CSV-fil. I tillegg til de direkte overlappende gener, proksimale gener (opp og nedstrøms 1000 nukleotider) til den anrikede /utarmet regioner ble også merket.
Signifikante forskjeller i anrikning mellom PP3 og PP4 tumorer ble identifisert ved å beregne den gjennomsnittlige gangers forskjell mellom PP3 og PP4 normalisert signal over alle sonder bruker PGS ANOVA verktøy, og påfølgende HMM region deteksjon og genet merknad ved hjelp av de ovennevnte parametere. Slike genomiske regioner ble ytterligere filtrert for å inkludere sekvenser med minimum 1,3 ganger berikelse, og minimum -1,3 fold uttømming. Visualisering av data ved hjelp av varmekart, .wig filer for UCSC Genome Browser, genom vise filer, og tilsvarende data tabeller /lister ble utført ved hjelp av PGS som tidligere beskrevet [25], [26].
MassARRAY EpiTYPER Analysis
Kvantitativ analyse av CpG dinucleotide metylering ble utført ved hjelp av en massespektrometri tilnærming som er tilgjengelig ved MassARRAY® EpiTYPER analyse (Sequenom). EpiTYPER analyse er en MALDI TOF massespektrometri basert metode som gir en kvantitativ oversikt over CpG dinucleotide metylering til én eller flere dinucleotide oppløsning. DNA er første bisulfite endret, merket med en T7 promoter, og transkribert til RNA. Dette blir deretter spaltet med RNase A og spaltningsproduktene av forskjellig masse kan løses ved å MS instrumentet. Analysene ble utført av Analytical Genetics Technology Centre (AGTC), prinsesse Margaret Hospital, Toronto, ON som per produsentens instruksjoner ved hjelp av en undergruppe av fersk frosset vev DNA som ble brukt for CpG island microarray analyse. Regioner analysert av EpiTYPER samsvarer med de som viste en beriket signal i CpG island matrise resultater. Alle analysene ble utført i triplikat og gjennomsnittet og standardfeil ble beregnet.
natriumbisulfitt Modifisering og MethyLight
Natriumbisulfitt modifikasjon av genomisk DNA ble utført ved anvendelse av DNA-EZ Metylering Gold Kit (Zymo Forskning Corp, Orange, CA, USA) i henhold til produsentens protokollen med 0,8 mikrogram av parafin- innebygd vev DNA.
metylering nivåer av de to gener av interesse ble bestemt av quantiative metylering spesifikk PCR (MSP), den MethyLight assay, som tidligere beskrevet [27]. Primere og prober ble utviklet spesielt for sulfitt konverterte, metylert DNA og er som følger: (
BMP7
fremover) 5′-CGT TTT TTT GGT TCG GAT CGC-3 «, (
BMP7
probe ) 6FAM-5’GTG TCG AGA GGG Tags GGT CGG TTT CG-3′-BHQ1, (
BMP7
bakover) 5′-CTA AAA CCT AAC GAA ACG TCG CG-3 «; (
HOXD3
fremover) 5’GTT TTG GTA TTT CGG GTT TTT ATC G-3 «, (
HOXD3
probe) 6FAM-5’AAG AGC GTT TGG GGG AGG GGG GC 3′-BHQ1, (
HOXD3
bakover) 5′-TAA AAC TCC TAA CTT CGC GCT ACG-3 «; (
Alu
fremover) 5′-GGT TAG GTA TAG TGG TTT ATA TTT GTA ATT TTA GTA-3, (
Alu
probe) 6FAM-5′-CCT ACC TTA ACC TCC C- 3′-MGBNFQ, (
Alu
bakover) 5′-ATT AAC TAA ACT AAT CTT AAA CTC CTA ACC TCA-3 «. Alle reaksjoner ble utført på Applied Biosystems 7500 Real Time PCR instrument. Standardkurver ble generert ved å bruke serielle fortynninger av positiv kontroll supermethylated DNA for det aktuelle genet og
Alu
gjentas. Prosent metylert forhold (PMR) for et gen som ble beregnet ved hjelp av
Alu
gjentar som referanse som følger: (-gen /
Alu
fluorescens mengdeforhold for modifisert prøve-DNA) /(gen /
Alu
ratio for supermethylated DNA) X 100%. En positiv score for metylering ble gitt hvis PMR for en gitt svulst ble ≥10%.
Resultater
Analyse av genomisk metylering
Vi skilles analyse av våre microarray data inn to undergrupper. Det første delsettet besto av alle 20 kreftprøvene i forhold til referanse-DNA. En liste av gener som ble identifisert som betydelig hypermethylated i de statistiske metodene som utføres for kreft versus referansedatasettet (PP3 PP4 versus henvisning DNA) er vist i tabell 1. Interessant, 27 av de 100 metylert gener (rangert etter individuell sonde fold endring) fra kreft /referansesettet er homeobox eller T-box gener (tabell 2), i samsvar med aktuell litteratur analyse metylering mønstre i andre kreftformer, inkludert de i lunge, bryst, og tykktarm [28], [29], [30 ]. Vi har også funnet 2 ganger signal i gener som tidligere er identifisert som metylert i prostatakreft som
CDKN2A plakater (gjennomsnitt på 15,8 fold berikelse),
RUNX3 plakater (2,8 ganger), og
PTGS2 product: (2,9 ganger). Genet som viser størst grad av metylering var
FOXC1
med en gjennomsnittlig ganger endring av 60,9 versus referansen DNA. Ved hjelp av PGS, som begrenset analysen til flere sonder som viser berikelse, størst grad av metylering i et karakterisert gen var
HOXD9 plakater (3,2 ganger endring over 8 prober).
den andre delsett av data i forhold ti PP3 tilfeller til de 10 pp4 saker, som vi betegnet progresjon datasett. Ved hjelp av en to-fold gjennomsnittlig berikelse signal forskjellen mellom de to mønstrene som en cut-off, oppdaget vi et sett av 493 array-sonder som er i stand til å skille mellom PP3 og PP4 kreft. Vi deretter filtrert ut flere sonder som representerer det samme gen og sonder som representerer uncharacterized steder, noe som gir en endelig liste av 223 enkeltgener. Én spesifikk sonde som representerer CAP-GLY domene som inneholder linkeren proteinfamilie, delen 4 (
CLIP4
) viste den største ganger forskjell mellom de to mønstre (6,5). Ved hjelp av PGS for statistisk analyse, ventral anterior homeobox 1 (
VAX1
) vises størst gjennomsnittlig ganger forskjell (2.7) over flere sonder (6 totalt). En representant visning av gener fra PGS analyse er gitt i tabell 1. I likhet med kreft /referanse datasettet, 23 av de 100 genene rangert etter probe ganger endring fra progresjon datasettet er homeobox gener (tabell 2).
Vi neste valgte to gener fra disse listene for videre analyse ved hjelp av en kombinasjon av metylering og uttrykk baserte teknikker. Utvalgskriteriene inkluderte den biologiske funksjonen av genet, engasjement i /bidrag til prostatakreft, og statistisk signifikans fra CpG microarray resultater
Gene spesifikk metylering analyse
Genene valgt for analyse var:.
BMP7 product: [Bone morphogenic Protein] (kromosom 8p21), et gen som allerede er innblandet i PCa progresjon [31] som tidligere ble rapportert som metylert i en oligodendroglioma cellelinje og mage kreft [32] , [33]. Vi besluttet å ytterligere undersøke dens metylering profilen på grunn av sin antatte nedregulering i PCa progresjon [31] og observert metylering signal i vårt kreft /referansesettet (3,2 gangers anrikning), hvilket antyder at metylering av dette genet kan spille en rolle i PCa progresjon.
HOXD3 product: [Homoebox transkripsjonsfaktor] (kromosom # 2q31-37), et gen funnet å være metylert i lungekreftcellelinjer og primære svulster [34], som viste et tydelig mønster med økende metylering med svulst karakter i vår serie basert på gjennomsnittet berikelse forskjell (6,4), noe som tyder på at metylering av dette genet kan være involvert i sykdomsutviklingen også.
Partek grafisk og heatmap visualisering av microarray data er vist for de to genene i figur 1.
(A)
BMP7 Hotell og (B)
HOXD3
. Linje grafer i øvre panel av hvert show log
2 ratio verdiene for hver sonde, med røde representerer pp4 tilfeller A-J og blå representerer PP3 tilfeller 1-10. Den nedre panel av hver er et varmekart for hver sonde i enkelt pp4 og PP3 tilfeller. Røde piler tilsvarer regioner valgt for EpiTYPER analyse mens svarte pilene tilsvarer regioner valgt for MethyLight analyse.
EpiTYPER kvantifisering av CpG Metylering
EpiTYPER analysen inkluderte en undergruppe av saker som viste anrikning av ≥3 ganger eller mangel på metylering signal (≤2 fold) på mikromatriser. Data fra EpiTYPER analyse bekreftet berikelse /metylering profiler i
BMP7 Hotell og
HOXD3
som var tydelig fra microarray resulterer i et sett med fire microarray tilfeller valgt for analyse (figur 2, 3) . For
BMP7
, metylering av den region identifisert ved vår mikromatriseanalyse bekreftet at for prøvene B og 3, var det en betydelig grad av metylering sammenlignet med referanse DNA (opp til 76% for CpG-dinukleotid 4 i prøve B) (figurene 2A, B). Disse prøver hadde en gjennomsnittlig metylering på 43% og 52% (metylert /unmethylated-forhold, gitt som prosent), henholdsvis på tvers av alle 35 CPGs analysert, mens prøvene I og 4 viste en gjennomsnittlig CpG metylering på 14% og 17%, respektivt.
HOXD3
vises et tydelig mønster av økt metylering i pp4 tilfeller i forhold til PP3 tilfeller. Analysen av fersk frossen DNA-prøver F, I, 4, 8 og bekreftet en differensial mønster av metylering fra PP3 til PP4, i det minste med hensyn til de fire tilfeller som ble analysert (figur 3A, B). Høy grad av tilfellene F og jeg hadde en gjennomsnittlig metylering av 72% og 43% henholdsvis over alle 27 CpG dinukleotider analysert, mens lav karakter prøvene 4 og 8 henholdsvis hadde en gjennomsnittlig metylering av 19% og 35%.
(A) PP3 tilfellene 3 og 4, og (B) pP4 tilfeller B og I. det vises lymfocytt er vist for hver. Fargede barer representerer gjennomsnittet metylering over tre gjentak med standardfeilfelt som vises.
(A) PP3 tilfeller 4 og 8 og (B) pp4 tilfeller F og I. Reference lymfocytt er vist for hver. Fargede barer representerer gjennomsnittet metylering over tre gjentak med standardfeilfelt som vises.
MethyLight Analyse
Hvis du vil kontrollere metylering mønstre av disse genene, vi validert dem i en uavhengig serie av parafin innebygd PCA tilfeller med matchet normalt vev fra de samme prøvene der det er tilgjengelig, og også vurdert deres metylering status i PCA cellelinjer (DU-145, PC-3, 22RV1, og LNCaP) ved hjelp MethyLight.
BMP7
metylering ble bekreftet i totalt 4 vevsprøver (to PP3, to PP4) samt to normale prøver fra separate tilfeller (figur 4A).
HOXD3
metylering var til stede i alt åtte prøver (to PP3, seks PP4) (figur 4B). DU-145 celler var positive for metylering av både
BMP7 Hotell og
HOXD3
. PMR verdier for DU-145 og positive tilfeller er gitt i tabell 3.
(A)
BMP7 Hotell og (B)
HOXD3
MethyLight forsterkning plott. X-aksen viser syklusen nummer, mens y-aksen viser den delta Rn verdi. + Ctrl -. Supermethylated DNA
RT-PCR
Vi har behandlet neste du-145 celler med demethylating agenten DAC og utført semi-kvantitativ RT-PCR analyse ved hjelp av ubehandlet og behandlede celler for å vurdere effekten av metylering på ekspresjon av de to gener.
HOXD3
uttrykk ser ut til å være fullstendig avskaffet i ubehandlede DU-145 celler mens
BMP7
er minimalt uttrykk. Behandling med DAC indusert
HOXD3
uttrykk og forårsaket en økning i
BMP7
mRNA nivåer (figur 5), noe som indikerer at metylering er involvert i redusert uttrykk for både
BMP7 Hotell og
HOXD3
NTC – nr. mal kontroll. -DAC – Ubehandlet. + DAC – behandlet med 5-aza-2-deoxycytidine
Diskusjoner
Vi har brukt menneske CpG island mikromatriser å identifisere denaturert gener ved PCA som helhet, samt forskjellig. metylert i lav karakter, PP3 og høy klasse, PP4 PCa. Intermediate Gleason score 7 svulster ble ikke undersøkt da de er sammensatt av både mønstre 3 og 4, og vi valgte å begrense vårt fokus til de svulster som består utelukkende av Gleason mønster tre eller Gleason mønster 4 for å ha beriket celle mønster populasjoner. Vi fant ut at vi var i stand til å identifisere CpG øyer som er både kvantitativt mer metylert og denaturert ved en økt frekvens i pp4 svulster i forhold til PP3 svulster. Dette kan gjenspeile en generell omlegging til en større tilstand av metylering innen promoter CpG øyer som svulsten utvikler seg i retning av en høyere klasse.
De fleste gener avdekket gjennom våre arrays har heller aldri vist seg å være metylert ved PCA eller på annen typer kreft. Andre tidligere beskrevet denaturert gener i prostata kreft, for eksempel
CDKN2A
,
PTGS2
, og
RUNX3
, alle viste tegn på metylering basert på fold endringer og statistisk signifikans. Nivåene av statistiske analyser som vi utførte kunne ha forhindret inkludering av disse genene i våre topp gener av progresjon eller kreft /referanse datasett. Derfor kan dette ikke være en indikasjon på manglende metylering, men i stedet kan forklares ved kvantitative metylering nivåer. Det er mulig at metylering av disse genene kan ha skjedd i færre celler og /eller i et mindre antall CpG-dinukleotider, og dermed produsere en mindre robust signal i vår skjerm. Alternativt gruppering av tilfeller i statistiske analyser kan ha filtrert disse genene ut, siden metylering i et færre antall eksemplarer ville skape en lavere gjennomsnittlig og høyere variasjon på tvers av disse tilfellene. Vi ble overrasket over å finne ut at den beste karakterisert metylering hendelse i PCA hypermethylation av
GSTP1
promoter, ikke ble fanget i vår rekke skjerm resultater. Det er mulig at metoden vi brukte for target DNA-preparat i kombinasjon med microarray plattform er ansvarlig for manglende påvisning av
GSTP1
metylering signal. Sekvensanalyse av
GSTP1
vist at vår metylert DNA oppformering metode ville produsere et fragment på tilnærmet 1900 bp, noe som kan påvirke annealing å sonder av vesentlig mindre lengde (ca. 45-60 mer) eller kan ikke forbli intakt etter metylering sensitiv fordøyelse. Ved nærmere undersøkelse av
GSTP1
metylering i de samme 20 kreftprøver, men vi kunne oppdage metylering i 80% av tilfellene bruker MSP (data ikke vist).
Vi har utviklet en liste av gener å sammenligne den totale kreft datasettet i forhold til referanse, så vel som separering av metylering profiler for PP3 og PP4 Gleason score. Vi valgte å gjøre en grundig metylering analyse av
BMP7 Hotell og
HOXD3
, da disse er nye mål for metylering ved PCA. De representerer en undergruppe av gener der støydempere kan spille en rolle i utviklingen av høy klasse prostatakreft basert på vår rekke resultater, men også basert på tilgjengelig funksjonell informasjon fra aktuell litteratur. Derfor trenger disse genene ikke nødvendigvis størst statistisk signifikans eller størst metylering ganger endring av enten to datasett som vi produserte. Genene med størst fold endringer i datasettene,
FOXC1 Hotell og
VAX1
, vil kreve fremtidig validering i en større serie av prostatakreft.
Bone morphogenic proteiner skilles faktorer som styrer utvikling og vedlikehold av beindannelse og tilhører TGFB super av signalanlegg proteiner [35]. Innenfor PCa har det vist seg at
BMP7
er betydelig underexpressed i laser microdissected kreftceller, som fører til en epitelial-til-mesenchymale overgang [31]. Det gjør det, men ser ut til å bli re-uttrykt i metastatisk PCa foci av bein [36]. Våre funn av arrangøren metylering i
BMP7
antyder en mulig mekanisme som den første stanse oppnås, som behandling av DU-145 cellelinjer med DAC økt
BMP7
uttrykk dramatisk. Tidligere studier har vist metylering av
BMP7
i mage kreft og oligodendroglioma cellelinjer [32], [33], noe som tyder på at stanse av
BMP7
gjennom denne mekanismen er ikke begrenset til PCa alene. Av notatet,
BMP7
metylering var ikke eksklusivt for histologisk kreftvev, men var også tydelig i tilstøtende normalt vev. Dette kan føres tilbake til feltet cancerization virkning hvorved metylering inntreffer før noen histologiske kreft endring i cellene, noe som har vist seg å forekomme i prostatakreft [37]. Alternativt kan dette metylering være primært aldersrelatert, da dette fenomen er også blitt vist tidligere i normal prostata vev [38]. Fremtidige studier er nødvendig for å løse disse problemene.
HOXD3
, en annen roman PCa metylering mål, viste en tydelig dreining mot større grad av metylering fra PP3 til PP4 PCa når analysere våre CpG matrise resultater. Rollen som
HOXD3
spiller i tumorgenesen og /eller progresjon av sykdommen har ennå ikke identifisert, men aktivering av TGFB signale har vært vist i A549 celler transfektert med
HOXD3 product: [39]. Avvik i denne veien har blitt godt dokumentert ved PCA og andre kreftformer [40]. Det er derfor mulig at metylering-indusert stanse av
HOXD3
er perturbing TGFfi signalering, og kanskje bidra til utvikling av høy klasse PCa.
