Abstract
Vi beskriver her to nye endogene varianter av den menneskelige endoplasmatiske retikulum (ER) last reseptor SEL1LA, betegnet p38 og p28. Biokjemiske og RNA interferens studier i tumorigen og ikke-tumorigene celler tyder på at p38 og p28 er N-terminal, ER-anchor og mer stabilt i forhold til den kanoniske transmembrane SEL1LA. P38 er uttrykt og konstitutivt skilles, med økning etter ER stress, i KMS11 myelom linje og i brystkreftlinjer MCF7 og SKBR3, men ikke i den ikke-tumorigent bryst epitel MCF10A linje. P28 blir detektert bare i dårlig differensiert SKBR3 cellelinje, hvor det skilles ut etter ER stress. Konsekvent med tilstedeværelse av p38 og p28 i dyrkningsmedier, morfologiske studier av SKBR3 og KMS11 celler oppdage N-terminal SEL1L immunolabeling i sekretoriske /nedbrytende avdelinger og ekstracellulært utgitte membranvesikler. Våre funn tyder på at de to nye SEL1L varianter er engasjert i endosomal menneskehandel og sekresjon via vesikler, som kan bidra til å avlaste ER stress i tumorigene celler. P38 og P28 kan derfor være relevant som diagnostiske markører og /eller terapeutiske mål i kreft
Citation. Cattaneo M, Lotti LV, Martino S, Alessio M, Conti A, Bachi A, et al. (2011) Utskillelse av Novel SEL1L Endogen Varianter er fremmet av ER Stress /UPR via endosomer og Shed Blemmer i humane kreftceller. PLoS ONE 6 (2): e17206. doi: 10,1371 /journal.pone.0017206
Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA
mottatt: 26 oktober 2010; Godkjent: 22 januar 2011; Publisert: 17 februar 2011
Copyright: © 2011 Cattaneo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra MIUR-FIRB nRBIP064CRT Minis Università e Ricerca (MIUR), og MAPLOMBARDIA, Grant 7/193 ar 3 til IB, MIUR 60% tilskudd fra Universitetet La Sapienza til LVL, MIUR 60% tilskudd 2008-2010 fra G . d’Annunzio University for å RMC, og av en 2009 stipend fra Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) til RMC. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Flere homeostatiske mekanismene som styrer proteinfolding og montering og fremme salg av defekte proteiner opererer i forskjellige cellulære avdelinger for å gi beskyttelse fra endogen proteotoxic stresset [1] – [4]. Det endoplasmatiske retikulum (ER) er brettingen og sammenstillingen stedet for faste strukturelle proteiner og enzymer, samt for sekretorisk og plasmamembranproteiner [5]. Denne bemerkelsesverdige arbeidsmengde er administrert av effektiv og hi-fi proteinfolding og misfold-korreksjonssystemer, basert på ATP-avhengige anstand og disulfide Isomerases, parallelt med kvalitetskontroll mekanismer som gjør at Golgi transitt bare å brettet skikkelig proteiner [6]. Videre clearance av avvikende proteiner tilbakeholdt i ER er mediert gjennom ER-assosiert degradering (erad) pathway [7], en flertrinnsprosess som krever erkjennelse av defekte proteiner, retro-translokasjon til cytosoliske side av ER-membranen, ubiquitinering og degradering av 26S proteasomet [8].
Ikke desto mindre kan den cellulære protein-folding kapasitet og den erad sti bli svekket og /eller overbelastet ved en rekke forskjellige patologiske tilstander som forurolige energi og kalsium homeostase, økning sekretoriske proteinsyntese og /eller interferere med protein glykosylering og disulfidbindingsdannelse [6], [9]. I slike tilfeller kan intralumenal akkumulering av utfoldete /malfolded proteiner bestemmer ER stress, noe som i sin tur aktiverer en kompleks kaskade av overlevelsessignalveier, kollektivt betegnet ufoldede protein respons (UPR). Dette tar sikte på å lindre ER stress ved å dempe hastigheten av proteinsyntese og med opp-regulering av protein folding enzymer, det erad maskineri og den sekretoriske evne [6], [10], [11]. Hvis homeostase ikke kan gjenopprettes, UPR-aktiverte machineries kan utløse død /senescence programmer [12].
Det er stadig tydeligere at UPR har en viktig rolle i kreft, der det er nødvendig for å opprettholde den ondartede fenotype og for å utvikle resistens mot kjemoterapi [13]. Faktisk kreftceller må tilpasse seg nærings sult og hypoksi, som påvirker celle Redox status og tilgjengelighet av energi fra ATP hydrolyse. Dette forventes å kompromittere sine protein folding kapasiteter, som disponerer for ER stress [14] – [16]. Derfor oppregulering av de erad-UPR trasé kan i vesentlig grad bidra til de komplekse cellulære tilpasninger som er nødvendig for progresjon av kreft [17], [18]. I denne forbindelse er det kjent at mange ER-resident proteiner er deregulert, post-translasjonelt modifisert, unormalt utskilt og /eller celleoverflaten gjen lokalisert i forskjellige krefttyper [13], [19] -. [21]
Den mangefasetterte erad genet
SEL1L plakater (sel-en suppressor av lin-12,
C.elegans
-lignende) koder for minst tre forskjellige protein isoformer,
dvs.
, den kanoniske ER-resident SEL1LA, en last reseptor som forbinder med E3 ubiquitin-protein ligase HRD1 [22] – [25], og de mindre, nylig klonet SEL1LB og C, som mangler C-terminal SEL1LA membran som strekker seg over området for innføring i ER [26]. Flere rapporter har vist at SEL1L protein uttrykk varierer i humane svulster i forhold til matchet normalt vev, noe som tyder på et engasjement i kreft progresjon [27] -. [32]
Vi rapporterer her identifisering, karakterisering og subcellulære lokaliseringer av to nye anchor endogene SEL1L varianter, p38 og p28, studert i brystkreftcellelinjer SKBR3 og MCF7, multippel myelom linje KMS11 og de ikke-tumorigene linjer MCF10A (bryst) og 293ft (embryo nyre). Vi fant at:
i
p38 og p28 er kodet av 5 «enden av
SEL1L
genet;.
ii
. p38 er oppregulert og konstitutivt utskilles i kreftcellene, forskjellig fra den ikke-tumorigen MCF10A linje; .
iii
p28 uttrykkes bare i dårlig differensiert SKBR3 brystkreft linje; .
iv
ER stress /UPR sterkt forbedre p38 sekresjon i kreftcellene;
v
. N-terminal SEL1L er til stede i sekretoriske og nedbrytende kamrene SKBR3 og KMS11 celler, og i vesiklene frigjøres i det ekstracellulære rom. Totalt sett, biokjemiske og morfologiske bevis støtter det syn at SEL1L p38 og p28 er innblandet i trasé knytte ER stress /UPR til endosomal menneskehandel og sekresjon via ekstracellulært-skur vesikler. Videre er ekspresjon av p38 og p28 og deres frigjøring i kulturmediet blir oppregulert i tumorigen relativt til ikke-tumorigene celler, noe som tyder på kreftrelaterte funksjoner.
Materialer og metoder
Cellelinjer, kultur betingelser, trans
humant multippelt myelom KMS11, brystcancer MCF7, SKBR3, MDAMB453, lymfom Namalwa, livmorhalskreft HeLa og glioblastom G144, G166, G179 og celler ble holdt i RPMI inneholdende 10% føtalt bovint serum (Euroclone, Celbio, Pero, Italia). Humane embryo nyre 293 FT-celler ble dyrket i DMEM inneholdende 10% føtalt bovint serum (Euroclone, Celbio, Pero, Italia). Non-tumorigene bryst MCF10A celler [33] ble opprettholdt i MEBM (Lonza, Treviglio, Italia), supplert med EGF, 20 ng /ml; bFGF, 20 ng /ml; insulin, 10 ug /ml; og hydrokortison, 0,5 ug /ml. Non-tumorigene menneskelige fosterets hjerne CB660 celler hentet fra professor Austin Smith (Cambridge, UK), ble opprettholdt i menneskelig nevrale stamcelle medium på laminin-belagt retter. Cellene ble transient transfektert med de indikerte plasmider og sirnas av Lipofectamine 2000 (Invitrogen, S.Giuliano M.se, Italia) og høstet etter den angitte tiden. Celler ble behandlet med DTT (2 mM) i 3 timer, MG132 (10 uM) i 3 eller 22 timer, cykloheksimid (200 ug /ml) i 3, 6, 18 timer, som angitt.
Bygger
Merket TPD52 isoform 1 konstruksjoner ble dannet ved kloning av full-lengde TPD52 isoform en kodende sekvens, sammensmeltet med et myc eller GFP-taggen i 3′-enden, inn pCDNA3.1myc-Hys (-) A eller peGFPN3 vektorer henholdsvis (Invitrogen, S. Giuliano M.se, Italia). Myc-merket
SEL1LB
konstruksjonene ble tidligere beskrevet [26].
RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp av TRI Reagens løsning (Applied Biosystems, Monza Italia) . RNA ble revers-transkribert med Super TM II revers transkriptase (Invitrogen, S. Giuliano M.se, Italia) i henhold til produsentens instruksjoner. Semi-kvantitative PCR presiseringer ble utført med 2 mL av RT produkt per reaksjon og 0,15 enheter av Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen, S. Giuliano M.se, Italia), ved hjelp av en Mastercycler instrument (Eppendorf, Milano, Italia). PCR-betingelsene for alle eksperimentene beskrevet her var: denaturering ved 95 ° C i 3 minutter, etterfulgt av 22 sykluser ved 95 ° C i 30 sekunder, deretter ved 60 ° C i 72 sekunder. De følgende spesifikke primere ble brukt:
SEL1LA
: forstand: 5′-ctcgctaacaggaggctcagtagtac-3 «; anti: 5»-gccactggcatgcatctgagc-3 «
HRD
1: forstand: 5′-ggccagggcaatgttccgc-3′; anti: 5′-gtccattgcctggagctcc-3 «
BIP
: forstand. 5′-tgcagcaggacatcaagttc-3′; anti: 5′-cgctggtcaaagtcttctcc-3 «
ATF6
: forstand: 5′-ctgatggctgttcaatacac-3′; anti: 5′-aatgactcagggatggtgct-3 «
CHOP
: forstand: 5′-gatggcagctgagtcattgc-3′; anti: 5′-atgcttggtgcagattcacc-3 «
XBP-en
: forstand: 5′-ccttgtagttgagaaccagg-3; anti: 5′-ggggcttggtatatatgtgg-3 «
GADD45β
: forstand: 5′-ggaagagctcgtggcgtgcg-3′; anti: 5′-gtctcgggcctcggtggtgc-3 «
SEL1LB
: forstand: 5′-ccggccccgagaggaggatgcgggtc-3′; anti: 5′-ggggaaacatagataccatg-3 «
SEL1LC
: forstand: 5′-ccggccccgagaggaggatgcgggtc-3′; anti: 5′-ggggcaatcagccaaactaatca-3 «
HPRT
: forstand: 5′-aattatggacaggactgaacgtc-3′ anti: 5′-cgtggggtccttttcaccagcaag-3 «
Western blotting, immunoutfelling, analyse av kultursupernatanter, N-glykosidase F og endoglykosidase H fordøyelse
Monoklonalt SEL1L antistoff ble dannet mot den N-terminale peptid av human SEL1L [34]. Affinitets-renset polyklonalt antistoff til SEL1L N-terminale ende ble vennligst tilveiebrakt av Dr. H.L. Ploegh [35]. Affinity-renset polyklonale C-terminal SEL1L antistoff ble reist mot et bakterielt-uttrykt rekombinante fragmentet som koder for aminosyrene 575-738 av menneskelig SEL1L (Primm, Milano, Italia). Monoklonale anti-vinculin og anti-myc-antistoffer ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, Milano, Italia). Polyklonale anti-TPD52 ble vennlig levert av professor J. Byrne (University of Sydney, Sydney, NSW, Australia). Celler ble lysert i 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1% NP40, inneholdende proteaseinhibitorer (Pierce, Celbio, Pero, Italia). Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved Bradford-analysen; Prøvene ble løst på SDS-polyakrylamidgeler, blottet på PVDF membraner, undersøkt med spesifikke antistoffer og utviklet med ECL (Genespin, Milano, Italia). For immunoprecipitation cellelysater ble pre-ryddet og inkubert med antistoffer immobilisert på protein G-sepharose (Invitrogen S. Giuliano M.se, Italia). Immunopresipitater ble vasket to ganger med 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,25% NP40, en gang med 5 mM Tris-HCl, og eluert med prøvebuffer før gelelektroforese. For analyse av supernatanter Cellene ble vasket og inkubert med OptiMem (Invitrogen, S. Giuliano M.se, Italia) i 16 timer. Supernatanter ble gjenvunnet, sentrifugert, utfelt med 10% TCA, resuspendert med 1 M Tris-HCl pH 7,4 og løst på SDS polyakrylamidgeler. Alle Western blot ble utført ved hjelp av X-BLOT Chamber (www.isenet.it).
For fordøyelsen av
N
-glycosidase F (PNGase F) eller endoglykosidase H (endo H), cellelysater ble denaturert ved oppvarming ved 95 ° C i 0,05% SDS, 0,1% merkaptoetanol i 10 minutter og deretter inkubert ved 37 ° C i 1 time med eller uten PNGase F eller endo H (New England Biolabs, Celbio, Pero, Italia) , i henhold til leverandørens indikasjoner.
immunfluorescens-mikroskopi
SKBR3-celler, dyrket på dekkglass, ubehandlet eller behandlet med DTT som beskrevet ovenfor, ble fiksert med 4% paraformaldehyd i PBS i 30 minutter, vasket i 0,1 M glysin i 20 min, og permeabilisert i 0,1% Triton X-100 ° C i ytterligere 5 min. For å undersøke subcellulære lokaliseringene av SEL1L, ble cellene inkubert med den N-terminale anti-SEL1L monoklonalt antistoff [34] og med polyklonale antistoffer mot ER markør calreticulin (Interesse BioReagents, Breda, Nederland) og Golgi markør giantin (Covance , Princeton, NJ, USA). Kjernene ble farget med 4,6-diamido-to-phenylindole (DAPI, Sigma-Aldrich, Milano, Italia). Primære antistoffer ble visualisert ved hjelp av fluorescein isotiocyanat-konjugert geit-anti-mus IgG (Cappel Forsknings Products) eller Texas Red-konjugert geit-anti-kanin-IgG (Jackson Immunoresearch Laboratories) i 30 minutter ved romtemperatur. Celler ble analysert under anvendelse av en Apotome Axio Observer Z1 invertert mikroskop (Zeiss, Oberkochen, Tyskland), som er utstyrt med en AxioCam MRM Rev.3 ved 40X forstørrelse. Colocalization av fluorescens signaler ble analysert med AxioVision 4.6.3 programvare. Bildeanalyse ble utført ved hjelp av Adobe Photoshop.
Cryoimmunoelectron mikros
Celler behandlet for cryoimmunoelectron mikroskopi ble dyrket som ovenfor og fikseres i 2% paraformaldehyde, 0,2% glutaraldehyd i 0,1 M fosfatbuffer, pH 7,4, i 2 timer ved 25 ° C. Celler ble skrapt av objektglassene, sentrifugert, innebygd i 10% gelatin (Sigma-Aldrich) i 0,1 M PBS, pH 7,4 og størknet på is. Etter infusjon i 2,3 M sukrose over natten ved 4 ° C, ble celleblokker montert på aluminium pinner og frosset i flytende nitrogen. Ultratynne frysesnitt (60 nm) ble kuttet ved -120 ° C ved hjelp av en ULTRACUT EM FC6 cryoultramicrotome (Leica Microsystems, Wien, Østerrike), samlet med 1% metylcellulose i 1,15 M sukrose og enkelt- eller dobbelt immunolabelled med primære antistoffer. Bundet antistoff ble synliggjort ved bruk av geit-anti-mus konjugert med 5- eller 15-nm kolloidalt gull (britisk BioCell International, Cardiff, UK) eller med protein-A konjugert med 10 nm kolloidalt gull (levert fra G.Posthuma og J. Slot , Utrecht, Nederland). Immunolabeling ble utført med følgende primære antistoffer: monoklonalt anti-SEL1L N-terminale [34], polyklonale anti-SEL1L N-terminale [35], polyklonale anti SEL1L-C endestasjonen, polyklonale anti-calreticulin (Affinity BioReagents), anti-CD63 monoklonalt H5C6, utviklet av JT August og J.E.K. Hildreth, hentet fra utviklingsstudier hybrid Bank utviklet i regi av den NICHD og vedlikeholdt av The University of Iowa, Institutt for biologi (Iowa City, IA 52242), og monoklonale anti-c-myc (Sigma-Aldrich) for
SEL1LBmyc
-transfected 293 FT celler [26]. Enkel og dobbel immunolabeling ble utført som beskrevet tidligere [23], [36]. Frysesnitt ble analysert med en Philips CM10 transmisjonselektronmikroskop.
Off-gel proteiner fraksjone
Semi-væskefase isoelectrofocusing fraksjonering ble utført på en Off-Gel 3100 apparat (Agilent Technologies, Cernusco, IT ) under anvendelse av en 24 cm strimmel med immobiliserte pH gradient geler i 4-7 rekkevidde. Totale celle lysatprøvene (360 mL, tilsvarende 1300 ug protein) ble blandet med 3240 ul av isoelektrisk fokusering buffer (Agilent Technologies) og fylt på apparatet. Protein fraksjonering ble utført for 26 timer med maksimal 8000 Volt for totalt 60.000 V /t, i henhold til produsentens protokoll. De resulterende flytende fraksjoner (150 mikroliter) med 0,25 pH-området ble samlet inn og prøver av proteiner videre løst på 10% akrylamid SDS-PAGE for Western blot sondering.
Protein identifikasjon ved MALDI-TOF massespektrometri (MS) analyse
Bands av interesse fra SDS-PAGE ble fjernet fra gels, redusert, alkylerte og fordøyd over natten med bovin trypsin (Roche, Milano, Italia), som tidligere beskrevet [37]. Ett ul (1 ul) alikvoter av supernatanten ble brukt for masseanalyse ved anvendelse av den tørkede dråpe teknikk og α-cyano-4-hydroxycinnamic syre som matrise. Massespektra ble oppnådd på et MALDI-TOF Voyager-DE STR massespektrometer (Applied Biosystem, Foster City, CA). Alternativt, sur og basisk peptid ekstraksjon fra gelstykkene etter tryptisk fordøyelse ble utført, og de resulterende peptidblandinger underkastet en enkelt avsalting /konsentrasjonstrinn før MS-analyse i løpet av Zip-TipC18 (Millipore Corporation, Bedford, MA, USA). Spektra ble internt kalibrert ved hjelp av trypsin autolyse produkter og behandles via Data Explorer programvare. Proteiner ble entydig identifisert ved å søke en omfattende ikke-redundante protein database av National Center for Biotechnology Information (NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) og massespektrometri proteinsekvens DataBase (msdb, http: //msdn.microsoft.com/en-us/library/ms187112.aspx), valgt som standard med i huset programmene dyp v4.10.5 og Mascot v1.9.00 henholdsvis [38], [39]. En savnet cleavage per peptid var tillatt, og en første masse toleranse på 50 ppm ble brukt i alle søk.
Resultater
Novel ER-anchor SEL1L varianter
Et monoklonalt antistoff dannet mot den N-terminale ende av den SEL1L protein [34] ble brukt til å screene et panel av hele lysater fra fem humane cellelinjer, inkludert MCF7 og SKBR3 (brystkreft), KMS11 (lg-K-utsondrende myelom), 293ft ( embryo nyre) og den ikke-tumorigen epithelial brystcellelinje MCF10A. Foruten den kjente 95 KDa SEL1LA protein, to tilsetnings bånd, betegnet som p38 og p28, ble visualisert ved tilnærmet 38 kDa og 28 kDa (figur 1A). Mens p28 ble kun påvist i SKBR3 linje, ble p38 sterkt uttrykt, på et nivå høyere enn SEL1LA, i alle cancercellelinjene som ble testet, med lavere nivåer i MCF10A, hvor SEL1LA uttrykket (protein og RNA) var også lavere (figur 1A- B). Et polyklonalt antistoff dannet mot det SEL1L C-terminale ende, som omfatter SEL1LA halen anker for innsetting i ER-membranen, detekteres den 95 KDa SEL1LA protein, men ikke p38 og p28, selv om et ytterligere bånd ble påvist ved omtrent 55 KDa, som kunne angir den karboksy-terminale fragment som resulterer fra spalting av det native protein (figur S1A). Særlig av p38-varianten ble sterkt uttrykt også i andre testede cancercellelinjene, inkludert Namalwa (lymfom), MDAMB453 (brystkreft), HeLa (cervikal kreft), og G144, G166, G179 (glioblastom), som alle resulterte negativ for p28 (Figur S1B). Analyse av SEL1L proteinprofil i den ikke-tumorigen humane føtale hjernecellelinje CB660 sammenlignet med de tre glioblastoma cellelinjer (figur S1B) videre forutsatt
in vitro
bevis på at p38 ble faktisk uttrykt i høyere nivåer i tumorceller.
A. Western blot-analyse: Lysatene (50 ug) fra forskjellige cellelinjer, inkludert 293ft (embryo nyre), MCF10A (ikke-tumorigen bryst), MCF7, SKBR3 (brystkreft) og KMS11 (multippel myelom), ble oppløst ved SDS-PAGE ( 10%) og probet med monoklonale å SEL1L N-terminus. Vinculin ble anvendt som en kontroll lasting. I tillegg til å SEL1LA (95 kDa), den N-terminale SEL1L antistoff anerkjent to mindre kodede produkter, ved ca. 38 og 28 kDa (betegnet p38 og p28). P38 var rikere enn SEL1LA og begge var opp-modulert i kreftcellelinjer i forhold til MCF10A. P28 var synlig bare i SKBR3. Bands over p38, sannsynligvis tilsvarende umodne forstadier eller post-translatorisk endrede produkter, ble av og til sett i de testede cellelinjer. Blottet er representative for fire uavhengige eksperimenter. B. RT-PCR-analyse: RNA fra KMS11, MCF10A og SKBR3 celler ble analysert ved RT-PCR ved anvendelse av primere som var spesifikke for
SEL1LA
. Signaler vist ble oppnådd med 27 sykluser for
SEL1LA
.
HPRT
ble anvendt som en kontroll lasting.
SEL1LA
ble opp-modulert i kreftcellelinjer i forhold til den ikke-tumorigen MCF10A linje. Den bilde representerer tre ulike analyser basert på uavhengige behandlinger. C.
Intra /inter
-molecular disulfidbindingene analyse av p38. 293ft cellelysatene ble oppløst ved SDS-PAGE (10%) under reduserende (R) og ikke-reduserende (NR) betingelser og blottet med monoklonalt anti-SEL1L N-terminus. P38 migrerte som en dublett under ikke-reduserende betingelser (banene sammenligne p38-migrasjon under reduserende og ikke-reduserende betingelser er fra samme gel). D. Down-modulering av SEL1LA, p28 og p38 ved SEL1L små interfererende RNA (siRNA): Venstre panel: SKBR3 celler (3 x 10
5) ble behandlet med egge siRNA eller siRNA spesifikke for SEL1L (siRNA SEL1L) for 48 timer, etterfulgt av en andre siRNA behandling for ytterligere 48 timer. Dempe effektivitet ble bekreftet av Western blot. SEL1LA, P28 og p38-proteinnivåer ble redusert i nærheten av 55%, 30% og 16% henholdsvis sammenlignet med celler behandlet med egge siRNA. Vinculin ble anvendt som en kontroll lasting. Høyre panel: 293ft celler (6 × 10
5) ble behandlet med egge siRNA eller siRNA-SEL1L i 48 timer. SEL1LA og p38-proteinnivåer ble redusert i nærheten av 45% og 23% henholdsvis sammenlignet med celler behandlet med egge siRNA. Vinculin ble anvendt som en kontroll lasting. Histogrammene viser verdiene normalisert i forhold til rengjøring signaler og uttrykt som gangers modulasjon i forhold til kontroller, densitometrisk analyse ble bestemt ved hjelp av smart bildebehandlingsprogram. (Www.scioncorp.com). Dataene er gjennomsnitt av tre uavhengige forsøk, ± SD; T-test ble benyttet for å bestemme statistisk signifikans *
p
0,1; **
p
0,05. E. Analyse av p38 og SEL1LA stabilitet: 293 FT-celler (6 x 10
5) ble behandlet i 3, 6 og 18 timer med cykloheksimid (CHX, 200 ug /ml). Aliquoter av lysater (50 ug) ble oppløst ved SDS-PAGE (10%) og probet med monoklonale anti-SEL1L og anti-vinculin antistoffer. I motsetning til SEL1LA, som gradvis redusert i løpet av cykloheksimid eksponering opp til omtrent 90%, ville p38-nivåene ikke endres vesentlig. Histogrammet viser densitometriske quantifications innhentet gjennom Scion bildebehandlingsprogram (www.scioncorp.com). Verdier ble normalisert i forhold til renhold signaler og uttrykt som fold modulasjon i forhold til ubehandlede prøver. Dataene er gjennomsnitt av to uavhengige eksperimenter, ± SD.
Når analysert i 293ft celler ved SDS-PAGE og immunoblot under reduserende tilstand, p38 migrert som en monomer, mens det virket som en dublett under ikke -reduserende forhold (figur 1C). Således, mens mange proteiner som inneholder intramolekylære disulfidbindinger vandrer hurtigere under ikke-reduserende betingelser på grunn av den mer kompakt naturlig struktur [40], p38 migrerte raskere i redusert enn i oksydert tilstand, et fenomen som tyder på at mer langsomt migrerende skjema kan bli engasjert i inter disulfidbindinger [41] – [43]. Den p28 signal fremsto som en eneste band under begge reduserende og ikke-reduserende forhold (data ikke vist).
For å forsikre seg om at p38 og p28 var
bonafide
endogen
SEL1L
-kodet proteiner, ble SKBR3 og 293ft celler transfektert med siRNAs rettet mot SEL1L N-terminale. Nivåene av de tre SEL1L signalene var betydelig lavere i cellene behandlet med
SEL1L
versus egge sirnas, med nedgang på 55% og 45% for SEL1LA og av 16% og 23% for p38 i SKBR3 og 293ft celler henholdsvis, og fra 30% til p28 i SKBR3 (figur 1D). I 293ft-celler, inhibering av proteinsyntese ved cykloheksimid i 3 og 6 timer, tidsvinduer som ikke fører til celledød, redusert SEL1LA nivå med omtrent 50%, men hadde nesten ingen effekt på p38 (figur 1E). På 18 timer, cycloheximide forårsaket celledød, samtidig til en drastisk reduksjon av SEL1LA (ca 90%), men endret ikke p38 nivå. Dette indikerer at p38 er mer stabil enn SEL1LA, noe som kan forklare den beskjedne p38 uttømming av siRNAs til SEL1L N-terminale.
Til sammen disse dataene indikerer at p38 og p28 er SEL1L proteinvarianter kodet av 5 «enden av
SEL1L
genet. Mens p38 resulterte uttrykt i alle de testede cellelinjer, med høyere nivåer i kreft linjer, ble p28 oppdaget bare i dårlig differensiert metastatisk brystkreft linjen SKBR3 [44].
De p38 og P28 varianter vise sekretoriske egenskaper
for å utforske atferd og utskillelsen av p38 og p28 i celler under ER stress /UPR, vi analysert ved SDS-PAGE og immunoblot cellelysater og kultursupernatanter av MCF10A, SKBR3 og KMS11 celler under normale forhold og etter behandling med DTT, noe som fører til protein misfolding ved reduksjon av disulfidbindinger [45] (figur 2A-C). I alle de testede celler DTT utløst ER stress /UPR, vurderes av
XBP-en
skjøting kombinert med
BIP
,
ATF6 Hotell og
CHOP
opp -modulation, og styrket
SEL1LA
mRNA uttrykk (figur 2A1, C1, figur S2A-C), mens SEL1LA proteinnivået ikke øker betydelig (figur 2A-C, C2). P38, men ikke SEL1LA, var lett påvises i SKBR3 og KMS11 supernatanter, økende nær tre og fem ganger henholdsvis etter DTT (figur 2B-C). Ingen tegn på p38 ble påvist i MCF10A supernatanter under både normale og DTT-stressede forhold (Figur 2A). P28 var utelukkende funnet etter DTT behandling og bare i supernatanten av den SKBR3 cellelinje som uttrykker denne varianten (figur 2B).
A. Western blot-analyse av ubehandlede og DTT-behandlede celler MCF10A: MCF10A celler ble utsatt for DTT (2 mM) i 3 timer og suksessivt ble opprettholdt i 24 timer i OptiMem. Utskilt protein (50 pg) ble ekstrahert fra kulturmediet ved TCA-utfelling, og alikvoter av cellelysater (50 ug) ble oppløst ved SDS-PAGE (10%) og blottet med monoklonale anti-SEL1L og anti-vinculin antistoffer. P38 var ikke påvisbar i kulturmediet, både i nærvær og i fravær av DTT. I tillegg til p38, MCF10A celler viste en høyere band, sannsynligvis svarende til en umoden forløper eller post-translasjonelt-modifisert produkt. Bildet er representative for to uavhengige eksperimenter. A1. RT-PCR-analyse av ubehandlede og DTT-behandlede celler MCF10A: RNA ble ekstrahert fra prøvene som er beskrevet i panel A og analysert ved RT-PCR for UPR respons. Histogrammet viser uttrykket verdier normalisert i forhold til renhold signaler og uttrykt som fold modulasjon i forhold til de ubehandlede prøvene; densitometrisk analyse ble utført av Scion bildebehandlingsprogram. UPR aktivisering på DTT behandling er indisert ved opp-modulering av
BIP Hotell og
CHOP Hotell og
XBP-en
spleising, samtidig
SEL1LA
økes ( grå bar). De tilsvarende bilder er vist i figur S2A. Dataene er gjennomsnitt av to forskjellige analyser basert på uavhengige behandlinger, ± SD. B. Western blot analyse av ubehandlede og DTT-behandlede celler SKBR3: Sekresjon av p38 og p28 ble evaluert i ubehandlede og DTT-behandlet SKBR3 celler. Celler som utsettes for DTT (2 mm) i 3 timer eller ikke eksponert ble opprettholdt i 24 timer i OptiMem. Utskilt protein (50 pg) ble ekstrahert fra kulturmediet ved TCA-utfelling, og alikvoter av cellelysater (50 ug) ble oppløst ved SDS-PAGE (12%) og blottet med anti-SEL1L og anti-vinculin antistoffer. ER stress /UPR sterkt fremmet sekresjon av p38 og i mindre grad p28 i kulturmediet. Bildet er representativt for fem uavhengige eksperimenter. C. Western blot-analyse av KMS11 celler behandlet med DTT og MG132: KMS11 celler ble utsatt for DTT (2 mM) eller MG132 (10 uM) i 3 timer og suksessivt ble opprettholdt i 24 timer i OptiMem. Utskilt protein (30 ug), ekstrahert fra kulturmediet ved TCA-utfelling, og alikvoter av cellelysater (50 ug) ble oppløst ved SDS-PAGE (10%) og blottet med anti-SEL1L og anti-vinculin antistoffer. Begge behandlingene markert indusert p38 sekresjon i kulturmediet. Bildet er representativt for fem uavhengige eksperimenter. C1. RT-PCR-analyse av KMS11 celler behandlet med DTT og MG132: RNA ble ekstrahert fra de samme prøver som beskrevet i panel C og analysert ved RT-PCR for UPR respons. Histogrammet viser uttrykket verdier normalisert i forhold til renhold signaler og uttrykt som fold modulasjon i forhold til ubehandlede prøver; densitometrisk analyse ble bestemt av Scion bildebehandlingsprogram. UPR aktivisering på DTT behandling er indisert ved opp-modulering av
ATF6
,
BIP
, og
CHOP Hotell og av
XBP-en
spleising ( se Figur S2C), samtidig uttrykk for
SEL1LA
,
HRD1 Hotell og
GADD45β
økes (grått felt). De tilsvarende bilder er vist i figur S2C. MG132 behandling ikke utløse UPR aktivering, som indikert av fravær av
ATF6 Hotell og
BIP
un-modulasjon og mangel på
XBP-en
spleising (se figur S2C) likevel
CHOP Hotell og
GADD45β
ble markert opp-modulert og
SEL1LA Hotell og
HRD1
ned-modulert (svarte striper). Dataene er gjennomsnitt av fire forskjellige analyser basert på uavhengige behandlinger, ± SD. C2. SEL1LA protein uttrykk i KMS11 celler behandlet med DTT og MG132: Histogrammet viser SEL1LA protein expression verdier hentet fra prøvene som er beskrevet i panel C, normalisert i forhold til renhold signaler og uttrykt som fold modulasjon i forhold til den ubehandlede prøven; densitometrisk analyse ble utført ved hjelp av smart bildeprogrammet. MG132 bestemt SEL1LA akkumulering av proteiner opp til 2 ganger i forhold til kontrollnivå (sort strek). Dataene er gjennomsnitt av fire uavhengige forsøk, ± SD.
MG132, som bestemmer ER stress gjennom erad blokkering av proteasomhemmingen [46], ble testet på KMS11 myelom linje, blir kjent at brystkreftcellelinjer er ganske motstandsdyktige mot en slik behandling [47]. En ca. femdoblet økning av p38 i KMS11 medium skjedde etter tre timer med MG132 eksponering, samtidig til en betydelig økning i
CHOP Hotell og
GADD45β
uttrykk, en indikasjon på ER stress /UPR aktivisering, selv hvis du er i mangel av
XBP-en
skjøting og
BIP Hotell og
ATF6
up-modulasjon (figur 2C-C1, figur S2C). MG132 behandling også økt SEL1LA proteinnivå (figur 2C, C2), som er konsistent med rapporterte bevis for at SEL1LA degraderes via proteasome [22].
