Abstract
Protease-aktivert reseptor 4 (PAR4), et medlem av G-protein koblede reseptorer familie, var nylig rapportert til utstillings redusert uttrykk i magekreft og spiserørs plateepitel kreft, men økt uttrykk under utviklingen av prostatakreft. Trekløverfaktor 2 (TFF2), et lite peptid konstitutivt uttrykt i gastrisk mucosa, spiller en beskyttende rolle i tilbakeføring av mageslimhinnen. Altered TFF2 uttrykk ble også knyttet til utvikling av gastrointestinal kreft. TFF2 har blitt bekreftet å fremme cellemigrasjon via PAR4, men rollene PAR4 og TFF2 i utviklingen av tykktarmskreft er fortsatt ukjent. I denne studien ble uttrykket nivået av PAR4 og TFF2 i kolorektal kreft vev målt ved hjelp av real-time PCR (n = 38), western blotting (n = 38) og microarray (n = 66). De mRNA og protein uttrykk nivåer av PAR4 og TFF2 ble bemerkelsesverdig økt i tykktarmskreft sammenlignet med matchede noncancerous vev, spesielt i positiv lymfeknute og dårlig differensierte kreft. Den tykktarmskreft celle LoVo viste en økt respons på TFF2 som vurderes av celle invasjon på PAR4 uttrykk. Men etter inngripen fra PAR4 uttrykk, PAR4 positiv kolorektal kreft celle HT-29 var mindre mottakelig for TFF2 i celle invasjon. Genomisk bisulfitt-sekvensering viste hypometylering av PAR4 promoter i kolorektal kreft vev og hypermethylation i normal slimhinne som antydet lav metylering av promoteren var korrelert til den økte ekspresjon PAR4. Tatt sammen, resultatene viste at opp-regulert ekspresjon av PAR4 og TFF2 forekommer hyppig i kolorektal kreft vev, og at overekspresjon av PAR4 kan bli ført fra promotoren hypometylering. Mens TFF2 fremmer invasjon aktivitet LoVo celler som overuttrykker PAR4, og denne effekten ble betydelig redusert når PAR4 ble knockdowned i HT-29 celler. Våre funn vil være nyttig i videre etterforskning av funksjoner og molekylære mekanismer av proteinase-aktiverte reseptorer (Pars) og Trefoil faktor faktorer (TFFs) under utviklingen av tykktarmskreft
Citation. Yu G, Jiang P, Xiang Y, Zhang Y, Zhu Z, Zhang C, et al. (2015) økt uttrykk av Protease-aktivert reseptor 4 og Trefoil Factor 2 i Human tykktarmskreft. PLoS ONE 10 (4): e0122678. doi: 10,1371 /journal.pone.0122678
Academic Redaktør: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, KINA
mottatt: 04.06.2014; Godkjent: 24 februar 2015; Publisert: 13 april 2015
Copyright: © 2015 Yu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra den kinesiske National Natural Science Foundation (81160302, 31270835), Chinese Academy of Sciences (KJZD-EW-L03), Yunnan-provinsen Science and Technology Institutt Basic Research Foundation (2011FZ109) og State Key Laboratory of genressurssenter og Evolution (GREKF11-13)
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
progresjon av tykktarmskreft er en flertrinnsprosess involvert i polygenetisk endringer i prooncogenes og /eller tumorsuppressorgener og avvik epigenetisk genregulering kan føre til unormal vekst av ondartede svulster [1,2]. Pars er syv-trans G protein-koblede reseptorer (GPCR) som består av fire medlemmer oppnevnt par1, PAR2, Par3, og PAR4 [3]. Som har evnen til nedbrytning av ekstracellulære matriksproteiner, Pars tjene som signalmolekyler involvert i tumorcellemigrering, invasjon og metastase [4]. Par1, som ble allment uttrykt i kreftformer, fremmet tumor genese og invasjon av brystkreftceller og kolorektal celler [5,6]. PAR2, overexpressed i prostatakreft, fremmet prostatakreft cellemigrasjon [7]. Tvert imot, PAR2 viste også en tumor-beskyttende rolle i karsinogenese hud [8]. Par3 ble funnet i nyre og leverkreft [9,10]. PAR4 uttrykk er sterkt påvist i lunge, skjoldbruskkjertel, bukspyttkjertel, tynntarm og testis ved Northern blot [11]. Men uttrykket og potensielle roller PAR4 i tumorigenesis er fortsatt ukjent. PAR4 uttrykk var fraværende i normal tykktarm slimhinner, men syntes tydelig flekker i dysplastic og colorectalous slimhinner. PAR4 mRNA ble funnet i 10 ut av 14 (71%) human colorectal carcinom-cellelinjer [12].
trekløver faktorer (TFFs), allment uttrykt i slimhinnene i mage-tarmkanalen, er små og kompakte peptider inneholdende ett eller to trekløverdomener. Tre nært beslektede TFFs er kjent i menneskelig, PS2 (TFF1), spasmolytic polypeptid (SP eller TFF2), og tarmtrekløverfaktor (ITF eller TFF3) [13]. TFFs peptider antas å bidra til slimhinnetilheling og hvile i kraft av å fremme cellemigrering og undertrykke apoptose [14]. TFFs er også involvert i tumordannelse [15]. TFF2, inneholdende to trekløverdomener, antas å være den viktigste cytobeskyttende trekløverfaktor i magen, og ekspresjonsnivået av TFF2 ble deregulert i magesår og kreft i vev [16]. I nyere forskning har TFF2 vist seg å fremme epitelial cellemigrering og sårheling via PAR4 involvert fosforylering av ERK1 /2 [17], men de detaljerte funksjoner og molekylære mekanismer for PAR4 og TFF2 i progresjon av gastrointestinal tumor har ikke blitt oppdaget . I studien, viste vi uttrykket nivåer av PAR4 og TFF2 ble økt i kolorektal kreft vev sammenlignet med matchet noncancerous slimhinner, og oppregulering uttrykk for PAR4 i kolorektal kreft kan skyldes arrangøren hypometylering. Videre våre data viste at TFF2 fremmer kolorektal kreft celle invasjon ved å aktivere PAR4.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Studiet ble godkjent av Kunming Institute of Zoology, den Chinese Academy of Sciences og Kunming Medical University. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra pasientene før du skaffer prøvene for denne studien.
forsøkspersonene
Totalt 38 pasienter med kolorektal kreft, som samtykket i å delta i vår studie, signert informert samtykke danne og fikk driften ved First Affiliated Hospital of Kunming Medical University. Kolorektale prøver ble oppnådd fra kolorektal tumorvev og tilstøtende ikke-cancer områder, som var minst 6 centimeter fra svulsten. De oppsamlede vev ble ytterligere bekreftet ved histologi og ble umiddelbart frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C inntil bruk. Kolorektal kreft vev microarray som representerer 66 kolorektal kreft med sine ikke-neoplastiske reseksjonskanten bygget [18] var fra Shanghai overgå biochip senter (Shanghai, Kina).
RNA ekstraksjon og polymerasekjedereaksjon (PCR)
RNA ekstraksjon og den første tråd cDNA-syntese ble utført som tidligere beskrevet [19]. For semikvantitativ RT-PCR og real-time PCR primerne som ble brukt var som følger: primerne for PAR4 (147 bp produkt) var 5′-CCTTCATCTACTACTACTACGTGTCG-3 «(fremover) og 5′-ACTGGAGCAAAGAGGAGTGG-3» (revers ); for TFF2 (74 bp produkt) var 5’CTGCTTCTCCAACTTCATCT-3 «(fremover) og 5′-CTTAGTAATGGCAGTCTTCC-3′ (bakover); og for intern kontroll glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH, 107 bp produkt), var 5»-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3 «(fremover) og 5′-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3» (bakover). Etter RT-PCR, ble amplikonene av PAR4, TFF2 og GAPDH elektroforert på 2% agarosegeler, farget med etidiumbromid og vist under ultrafiolett belysning.
Kvantitativ PCR ble utført med en kontinuerlig fluorescens-detektor (Opticon Monitor, Bio-Rad, Hercules, CA, USA). PCR-reaksjoner for PAR4, TFF2 og GAPDH ble utført ved anvendelse av en SYBR grønn real-time PCR kit (Takara, Dalian, Kina) med den betingelse av: innledende denaturering ved 95 ° C i 1 minutt, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 s, 60 ° C i 15 s, og 72 ° C i 20 s. Hver prøve ble kjørt i triplikat. Templat-kontroller (ingen cDNA i PCR) ble kjørt for å oppdage uspesifikke eller genomisk forsterkning og primer dimerization. Fluorescens kurve analyse ble utført ved hjelp av Opticon Monitor programvare. Relativ kvantitativ evaluering av PAR4 og TFF2 ekspresjonsnivåene ble utført med E-metode og uttrykt som et forhold av transkripsjon av PAR4 (TFF2) til GAPDH i tumorvevet. Identiteten til RT-PCR og real-time PCR produktene ble bekreftet ved DNA-sekvensering.
Tissue immunhistokjemi
Tissue immunhistokjemi ble utført som tidligere beskrevet [12]. I korthet, ble antigen gjenfinning utføres ved oppvarming i en autoklav ved 121 ° C i 5 min. Avvoksede seksjoner ble pre-inkubert med blokkerende serum og deretter inkubert ved 4 ° C over natten med anti-humant PAR4 antistoff (C-20, 1: 1200, Santa Cruz Biotechnology, California, USA) og den anti-humant TFF2 antistoff (P -19, 1: 800, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), henholdsvis. Spesifikk binding ble påvist ved en streptavidin-biotin-peroksidase analysesett (Maxim, Fujian, Kina). Seksjonen ble kontra med Harris hematoxylin. Direkte mikroskopiske mikrobilder ble tatt med en Leica DFC320 kamera styrt av Leica IM50 programvare (Leica, Tyskland). Seksjoner ble inkubert med normalt geite IgG ble tjente som en negativ kontroll. Spesifisiteten av antistoffene for PAR4 og TFF2 ble bekreftet ved pre-inkubering over natten ved 4 ° C med sine respektive antigener (Santa Cruz) i en 20-gangers molart overskudd av antigen til antistoffer. Pre-inkubasjon med PAR4 og TFF2 antigenet resulterte i et fravær av immunolabeling.
Immunhistokjemisk farging ble bedømt semikvantitativt ved å måle både intensiteten av fargingen (0, 1, 2 eller 3), og graden av farging (0, 0%, 1, 0-10%, 2, 10-50%, 3, 50-100%). Poengene for intensiteten og omfanget av farging ble multiplisert for å gi en vektet score for hvert tilfelle (maks mulig, 9). For den statistiske analysen ble de vektede skårer gruppert i to kategorier der score til 0-3 ble ansett som negativt og 4-9 positiv [20].
Western blot
Vevsprøver ble homogenisert i Radioimmunoprecipitaion Assay Buffer (Sigma) inneholdende cocktail av proteaseinhibitorer (Sigma). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved et proteinanalysesett (Bio-Rad). Prøver (inneholdende 30 ug protein) ble applisert på en SDS-polyakrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE) gel og deretter overført til en PVDF-membran. Membranene ble deretter blokkert med 3% bovint serumalbumin (BSA) og inkubert med passende Par4 og TFF2 primære og sekundære antistoffer, henholdsvis. Proteinene ble visualisert med Super Signal reagenser (Pierce, Rockford, IL, USA).
Bisulfite sekvense
Genomisk DNA fra kolorektal kreft og ikke-neoplastiske vev ble isolert med Universal Genomisk DNA Extraction Kit (Takara) og sulfitt-omregnes til CpGenome Fast DNA Modification Kit (Chemicon). Par4 promotor-sekvenser ble amplifisert fra bisulfitt-omdannet DNA ved hjelp av PCR, renset fra agarosegeler og subklonet inn i pMD19-T-vektor (TAKARA). For hver prøve ble 19 individuelle kloner sekvensert for å identifisere denaturert cytosinrestene. PCR primer sekvenser (forover og bakover) for PAR4 var 5′-TTTAAGGGTGATTTTAGGAAAGGTTTAGAG-3 «og 5′-ACTATAACCTCAAACTTCCTACCTC-3».
Cell kultur
Menneske kolorektal kreft cellelinjer LoVo og HT- 29 var fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Lovo celler som overuttrykker PAR4 (LoVo-PAR4) og cellene transfektert med en mock plasmid (LoVo-mock) ble valgt av 800ug /ml G418 i henhold til våre tidligere studier [17]. LoVo-celler ble dyrket i Hams F12-medium supplert med 10% (v /v) bovint føtalt, 100 U /ml penicillin og 100 U /ml streptomycin, og ble dyrket i en fuktig atmosfære med 5% CO
2 ved 37 ° C. For behandling med 5-aza-2′-deoksycytidin (5-Aza-dC; Sigma, St. Louis 95, MO, USA), ble cellene sådd ut i en tetthet på 1 x 10
6 i en 60 mm skål . Etter 24 timer ble cellene behandlet med 10 pM av 5-Aza-dC. DMSO ble behandlet i parallell som en kontroll. Totalt celler ble samlet etter 72 timer med tillegg 5-Aza-DC og utsatt for RT-PCR og Western blotting-analyse.
knockdown av PAR4 i HT-29 celler
Lentivirus uttrykker shRNA ble generert av co-trans PAR4 shRNA plasmider med pCMV-dR8.2 dvpr og pCMV-VSVG emballasje plasmider inn 293ft celler. HT-29-celler transfektert med pGIPZ-shPAR4 eller tom vektor pGIPZ ble valgt med 5 ug /ml puromycin å generere HT-29-shPAR4 og HT-29-pGIPZ, respektivt. Cellene ble dyrket i DMEM supplementert med 10% (v /v) føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin og 100 U /ml streptomycin.
Cell invasjons
bølgen aktivitetene til LoVo- mock og LoVo-Par4 celler, og HT-29-pGIPZ og HT-29-shPAR4 celler in vitro ble målt ved anvendelse av Matrigel invasjonen assay [21]. Den InnoCyte Cell Invasion Assay Kit (8 mikrometer pore, Calbiochem, Merck) ble brukt i henhold til produsentens protokoll. I korthet, 5 x 10
4 celler av LoVo-mock, LoVo-PAR4, HT-29-pGIPZ og HT-29-shPAR4 ble henholdsvis tilsatt til det øvre kammer, og medium inneholdende rekombinant TFF2 ble tilsatt til det nedre kammer. Etter inkubering 24 timer ved 37 ° C, ble cellesuspensjonen fjernet og det øvre kammer innskudd ble forsiktig plassert i cellen fargeløsning i 30 minutter. Etter det nedre kammer cellene inneholdende de løsnede celler ble inkubert i ytterligere 30 minutter under de samme betingelser. Endelig 200 ul de løsnede celler ble overført dobbelt til brønnene i en 96-brønners plate, og målte fluorescens ved en eksitasjonsbølgelengde på 485 ± 10 nm og en emisjonsbølgelengde på 520 ± 10 nm. I mellomtiden ble det nedre kammeret cellene fotografert gjennom konfokal laser fluorescens mikroskopi.
Statistisk analyse
Alle statistiske analyser ble utført av SPSS 11.0 programvare (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) . Den chi kvadrat test (tabell 1 og 2) og Mann-Whitney U tekst ble brukt for betydningen av sammenhenger mellom PAR4 og TFF2 uttrykk og kliniske patologiske parametere. Forskjeller i de numeriske data mellom de sammenkoblede gruppene ble evaluert ved hjelp av paret Students test. Nivået av statistisk signifikans ble satt på nivå med
p
. 0,05
Resultater
Uttrykket nivåer av PAR4 og TFF2 mRNA økt i kolorektal kreft vev
uttrykk for PAR4 og TFF2 mRNA i kolorektal vev ble undersøkt ved RT-PCR. Som vist i figur 1A, ble RT-PCR utføres på matchet normale og kreftprøver tilfeldig utvalgte fra fire pasienter og resultatene viste Par4 og TFF2 mRNA nivåer betydelig økt i kreftformer vev sammenlignet med matchede normalt vev.
(A) De samsvarende normale (normale) og kreft (kreft) vev fra hver pasient er valgt tilfeldig, ble analysert ved RT-PCR ved anvendelse av PAR4- og GAPDH- spesifikke primere (n = 4). Etter at prøvene var normalisert til GAPDH-nivåer, ble mRNA-nivåer av PAR4 og TFF2 betydelig øket i kreft sammenlignet med normale vev; (B) Western blot av vev lysatene fra fire tilfeller av tykktarmskreft (kreft) og relevante tilstøtende ikke-neoplastisk slimhinnen (normal). Ekspresjonen av aktin ble tjente som en kontroll. Den betydelige oppregulering uttrykk for PAR4 ble observert i kreftvevet i motsetning til sine matchet normalt vev (n = 4).
Deretter undersøkte vi nivåene av PAR4 og TFF2 mRNA i 38 kolorektal kreftprøver av real-time PCR. Den oppregulert av PAR4 og TFF2 i kolorektale tumorer var 58% (22 av 38) sammenlignet med den samsvarende ikke-neoplastisk mucosa. Vi videre undersøkt den kliniske betydningen av oppregulert uttrykk på klinikken patologiske data. Det var signifikante forskjeller i PAR4 og TFF2 mRNA uttrykk i lymfeknute invasive svulster versus ikke-invasive tumorer (
p
= 0,016 og
p
= 0,002, chi kvadrat tekst). Forskjellen ble også observert i dårlig differensiert tumor mot vel- /moderated- differensierte tumorer (
p
= 0,002 og
p
= 0,020, chi kvadrat tekst) (tabell 1). I detaljer, ble PAR4 mRNA økt med 2,2 (1,8, 4,7) (kvartil 25, kvartil 75) kaster på 14 lymfeknute invasive svulster og med 1,0 (0,4, 2,0) kaster i 24 ikke-invasive tumorer (
p
= 0,008, Mann-Whitney U tekst); TFF2 mRNA ble økt med 3,2 (2,2, 7,6) kaster i 14 lymfeknute invasive svulster og med 0,8 (0,3, 1,5) kaster i 24 ikke-invasive tumorer (
p
= 0,001, Mann-Whitney U tekst) (fig 2A). Videre ble PAR4 mRNA økt med 2,3 (2,0, 3,8) kaster i 16 fattige differensierte svulster og med 0,9 (0,5, 1,2) kaster i 22 godt /moderated- differensiert kreft (
p
= 0,001, Mann -Whitney U tekst); TFF2 mRNA ble økt med 2,2 (1,8, 5,8) kaster i 16 fattige differensierte svulster og med 0,8 (0,3, 1,5) kaster i 22 brønn /moderert differensiert kreft (
p
= 0,002, Mann-Whitney U Text) (figur 2B).
uttrykk for PAR4 og TFF2 ble målt i 38 pasienter med kolorektal kreft ved real-time PCR. (A) PAR4 mRNA ble økt i 86% (12 av 14) lymfeknute invasive svulster og 42% (10 av 24) ikke-invasive svulster. TFF2 mRNA ble økt i 93% (13 av 14) lymfeknute invasive svulster og 38% (9 av 24) ikke-invasive svulster. Det var signifikant forskjell på PAR4 (p = 0,008) og TFF2 (p = 0,001) mRNA uttrykk mellom lymfeknute invasive svulster og ikke-invasive svulster; (B) PAR4 mRNA ble økt i 88% (14 av 16) dårlig differensiert kreft og 36% (8 av 22) godt /moderert differensierte kreft. TFF2 mRNA ble økt i 81% (13 av 16) dårlig differensiert kreft og 46% (9 av 22) godt /moderert differensierte kreft. Dessuten er det en signifikant forskjell på PAR4 (p = 0,001) og TFF2 (p = 0,002) mRNA ekspresjon mellom dårlig differensiert og godt /moderert-differensierte kreft; Bety gangers økning i tumorvevet i forhold til ikke-neoplastisk vev kolorektal ble vist. Median (kvartil 25, kvartil 75) ble brukt til å sammenligne folder av PAR4 (TFF2) økning i lymfeknute invasive svulster og ikke-invasive svulster, og dårlig differensiert kreft og brønn /moderert differensierte kreft. De økte folder » 1″ ble definert som «økt», mens økt folder «≤1» ble definert som «ikke økt»
Protein nivåer av PAR4 og TFF2 ble økt i. de kolorektal kreft vev
Par4 og TFF2 proteiner var lav eller uoppdaget i normal kolorektal slimhinne av western blotting analyse (figur 1B). Men i pasientens vev med kolorektal kreft, etter at prøvene ble normalisert til p-actin-nivåer, en betydelig økt ekspresjon av PAR4 og TFF2 ble observert i kolorektal kreft vev sammenlignet med matchede ikke-ondartede vev (figur 1B).
Deretter utførte vi immunhistokjemisk farging å analysere protein uttrykk nivåer av PAR4 og TFF2
in vivo
. Det var nesten ingen ekspresjon av PAR4 og TFF2 i ikke-neoplastiske kolorektale epitelceller, men ekspresjon ble betydelig økt i maligne kolorektale epitelceller. Videre ble de fleste av PAR4 og TFF2 flekker i maligne kolorektal kreft prøver lokalisert i cytoplasma (figur 3). I 66 analyserte prøvene, ble PAR4 uttrykk oppregulert i 57 (86,1%) med kolorektal kreft prøvene sammenlignet med det tilpassede normal slimhinne. TFF2 uttrykk ble oppregulert i 46 (69,7%) kolorektal kreft prøver. I tillegg til forskjellene i PAR4 og TFF2 protein uttrykk mellom fattig-differensiert og godt /moderated- differensierte svulster var signifikant (
p
= 0,017 og
p
= 0,022, chi kvadrat tekst) (tabell 2).
(A) immunhistokjemisk farging for PAR4. (A) normal tykktarmsslimhinne; (B) kolorektal kreft vev av nummer én pasient. (C) colorectal cancer vev av nummer to pasient; (B) immunhistokjemisk farging for TFF2. (D) normal tykktarmsslimhinne; (E) colorectal cancer vev av nummer en pasient; (F) colorectal cancer vev av nummer to pasient. Bar, 100 mikrometer for hvert panel, og 50 mikrometer for innfellinger.
Overuttrykte PAR4 økt invasjon aktivitet av LoVo celler indusert av TFF2
Våre tidligere resultater har vist at TFF2 fremmer celle migrering via PAR4 [17]. For å undersøke hvilken rolle PAR4 i TFF2-indusert celle invasjon, undersøkte vi effekten av TFF2 på LoVo-mock og LoVo-Par4 celler invasjonen aktiviteter. Som vist i figur 4A, fikk 200 nM TFF2 ikke indusere invasjon aktivitet i LoVo-mock celler ved Matrigel analysen. Imidlertid, det økte invasjon aktivitet i LoVo-celler Par4 betydelig. Den konfokal mikroskopi viste også at invasjonen aktiviteten av LoVo-celler ble Par4 to bretter høyere enn LoVo-mock-celler når stimulert av TFF2 (figur 4B).
(A) Celle invasjon stimulert ved TFF2 ble testet ved anvendelse av en InnoCyte celle invasjon analysen. Invasion of LoVo-mock og LoVo-Par4 celler stimulert ved 200nm TFF2 ble testet, med BSA og 10 nM EGF som kontroller. Resultatene viste signifikant forskjell på 200nm TFF2 på LoVo-mock og LoVo-PAR4 celler invasjon aktivitet. Resultatene ble presentert som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05; (B) Invasjonen av LoVo-mock og LoVo-Par4 celler stimulert ved 200nm TFF2 ble undersøkt ved Confnocal laser fluorescens mikroskopi.
PAR4 knockdown i HT-29 celler ble redusert celle invasjon aktivitet i reagerer på TFF2
Vi bestemmes ved effekten av TFF2 på celler invasjon aktivitet i PAR4- knockdowned HT-29 celler. Som vist i figur 5A, 200 nM TFF2 betydelig økt invasjon aktiviteten av HT-29-celler ved pGIPZ Matrigel assay, men hadde ingen effekt på PAR4-knockdowned celler. Konfokalmikroskopi Resultatene viste også at invasjonen av HT-29-pGIPZ er mer enn 3-4 folder av HT-29-shPAR4 celler når cellene blir stimulert av TFF2 (figur 5B). Resultatene antydet at TFF2-indusert invasjon var PAR4 avhengig.
(A) Celle invasjon stimulert ved TFF2 ble testet ved anvendelse av en InnoCyte celle invasjon assay. Invasjon aktivitet av HT-29-pGIPZ og HT-29-shPAR4-celler ble behandlet med 200 nM TFF2 å vurdere invasjon aktivitet, ble BSA og 10 nM EGF anvendt som kontroller. Det var signifikant forskjell på 200nm TFF2 på HT-29-pGIPZ og HT-29-shPAR4 celler invasjon. Data ble presentert som betyr ± SD av tre uavhengige eksperimenter, * p 0,05; (B) Invasion cellene i HT-29-pGIPZ og HT-29-shPAR4 stimulert av 200nm TFF2 ble undersøkt ved Confnocal laser fluorescens mikroskopi.
Restaurering av PAR4 uttrykk ved behandling av 5-Aza-doxy i kolorektal LoVo celler
Som rapportert i Zhang forskning papir, ble PAR4 ikke uttrykt i menneskelig tykktarmskreft cellelinje av LoVo [17]. For å belyse potensialet molekylære mekanismen bak PAR4 oppregulert uttrykk i kolorektal kreft vev, ble lovo celler behandlet med 5-Aza-DC, et demethylating agent. I figur 6A og 6B, RT-PCR og Western blotting viste at ekspresjonsnivået av PAR4 ble gjenopprettet etter 3 dagers behandling med 5-Aza-dC, og humane tykktarmskreft cellelinjer HT-29-uttrykkende PAR4 ble anvendt som en kontroll.
LoVo, en ikke- PAR4 uttrykkende celler, ble inkubert med 5-Aza-dC (10 uM) eller DMSO i 72 timer, og cellene ble brukt til å ekstrahere mRNA og protein. (A) Ekspresjonsnivået av PAR4 mRNA ble undersøkt ved hjelp av RT-PCR; (B) Ekspresjonsnivået av PAR4 protein ble undersøkt ved western blot. Den colorectal cancer-cellelinje HT-29 uttrykt PAR4 ble anvendt som en positiv kontroll.
Analyse metylering nivå av promotorområdet av PAR4 i kolorektal kreft vev
Fordi demetylering med 5- aza-dC fører til restaurering av PAR4 uttrykk i LoVo celler, vi sammenlignet metylering nivået PAR4 promoter mellom tykktarmskreft og matchet normalt vev. Ved hjelp av genomisk bisulfitt-sekvenseringsmetode, undersøkte vi 19 CpG områder i en 380 bp region av PAR4 promoteren. Tre kolorektal kreft prøver med høy PAR4 uttrykk vises uttalte hypomethylations, og deres gjennomsnittlige metylering priser av 19 CpG nettsteder er 22,1%. Imidlertid hypermethylation ble funnet i sammenfallende ikke-cancer vev som hadde lav ekspresjon av PAR4, og deres gjennomsnittlige metylering prisene var 41,6% (figur 7A). Høy PAR4-uttrykk HT-29 celler vises hypometylering i sin fremme mens ikke-PAR4 uttrykk LoVo celler vises hypermethylation (Fig 7B).
(A) PAR4 promoter metylering ble analysert i DNA fra tre kolorektal kreft og deres matchet ikke-neoplastiske vev. (B) PAR4 promoter metylering i DNA fra kolorektal kreft cellelinjer, LoVo og HT-29. Gjennomsnittlig metylering ved hvert analysert CpG nettstedet i PAR4 arrangøren indikeres basert på bisulfite sekvensering av 19 individuelle kloner.
Diskusjoner
Forskjellen uttrykk for PAR4 og TFF2 ble påvist i ulike tumorer , såsom pankreas cancer, lungecancer og magekreft, og denne forskjellen ekspresjon ble forbundet med tumorcellevekst, migrasjon, invasjon og angiogenese [11,22-24]. Fordi Pars spiller viktige roller i ulike kreftformer og de har blitt attraktive for utvikling av nye legemiddel mål [25]. I studien presenteres vi noen grunnleggende data som uttrykket nivåer av PAR4 og TFF2 ble betydelig økt i kolorektal kreft vev i forhold til de matchet noncancerous vev, spesielt i de metastatiske positive lymfeknuter og dårlig differensierte svulster. Flertallet av PAR4 og TFF2 i kolorektal kreft vev er lokalisert i cytoplasma som vist ved Farging. Økningen på PAR4 uttrykk i tykktarmskreft var i overensstemmelse med Gratio forskningsresultater [12], der PAR4 var fraværende i normal tarmslimhinnen og epitelceller, men høy i colon adenokarsinom vev, og 71% menneskelige kolorektal cellelinjer viser sterk farging av PAR4 [12]. Tvert imot, ble PAR4 ekspresjon ble redusert i magekreft, kreft i spiserøret plateepitel og lunge adenokarsinom vev sammenlignet med den relative normal slimhinne [17,26,27]. Resultatene indikerte at funksjonen av PAR4 var forskjellig i tumorprogresjon. Siden de ukjente faktorer kan være involvert i avvikende uttrykk for PAR4, det er mye arbeid må forstå mekanismen for PAR4 regulering før det kan være et potensielt mål medikament for kreftbehandling.
TFF2, som en rektor cytoprotective trekløverfaktor, ble hovedsakelig uttrykt i magesekken, og uttrykket ble dysregulerte i løpet av magekreft progresjon [16,23,28]. I Jiangs studien ble TFF2 uttrykk markert redusert i magekreft, noe som tyder rollen TFF2 som en tumor suppressor i magekreftutvikling og metastasering [29]. I tykktarmen slimhinner, ble TFF2 uttrykt med lav intensitet, men et uttrykk for TFF2 i fremdriften av tykktarmskreft var ikke klar [30]. I vår forskning, var det interessant å finne TFF2 ekspresjon ble også øket i kreftvevet i forhold til den relative normal tykktarmsslimhinne. Furthermor våre resultater viste at rekombinant humant TFF2 kunne aktivere PAR4 å fremme LoVo-PAR4 og HT-29-pGIPZ celle invasjon aktivitet, men hadde ingen signifikant invasjon effekt på LoVo-mock og HT-29-shPAR4 celler. Resultatene består med vår tidligere funn at TFF2 aktivert PAR4 å fremme epiteliale cellemigrasjon via ERK1 /2 fosforylering [17]. Fosforylering av ERK1 /2 er nødvendig for cellemigrering og er sentralt for TFF mediert signalisering [14,31]. Derfor fakta at oppregulering uttrykk for PAR4 og TFF2 i tykktarmskreft, deres samlokalisert cytoplasma uttrykk patters, og TFF2 fremme celle migrasjon og invasjon via PAR4, noe som tyder på samspillet mellom PAR4 og TFF2
in vivo
og
in vitro
via ukjent mekanisme for å undersøkes nærmere.
Transkripsjonell lyddemping av arrangøren hypermethylation har nylig dukket opp som en av de viktigste mekanismene i magekreft utvikling [32]. I denne studien fant vi at 5-Aza-DC, en demethylating agent, restaurert PAR4 uttrykk i LoVo celler. Vi videre analysert metylering status av cytosin i CpG dinucleotide ligger innenfor non-CpG øyer i PAR4 promoter regionen ved hjelp av kolorektal kreft vev og cellelinjer med ulike PAR4 uttrykk nivå. Arrangøren hypermethylation ble bekreftet i normal kolorektal slimhinne med lav uttrykk for PAR4. Men arrangøren hypometylering ble funnet i kolorektal kreft vev med høy uttrykk for PAR4. Resultatene indikerte at promoteren hypometylering kan fremme transkripsjonen av PAR4. Zhang et al fant at tap av PAR4 uttrykk i mage kreft kan skyldes hypermethylation av PAR4 promoter [33]. Men PAR4 redusert uttrykk i lunge adenokarsinom var ikke relatert til arrangøren metylering [2727]. Disse fakta foreslo at arrangøren metylering nivået var bare en faktor som fører til forskjell fra PAR4 uttrykk, og uttrykket ble regulert av flere faktorer.
I konklusjonen, forskning viste at PAR4 og TFF2 uttrykk var ofte oppregulert i kolorektal kreft og økt uttrykk ble assosiert med klinisk aggressiv fenotype. DNA hypometylering fører til oppregulert uttrykk for PAR4 i kolorektal kreft vev. Vi viste også PAR4 fremmet kolorektal kreftceller «invasjon i responderer på TFF2. Disse resultatene vil hjelpe oss å forstå molekylære mekanismen av TFFs og Pars i kreftutvikling og progresjon av kolorektal kreft.
Takk
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra den kinesiske National Natural Science Foundation (81160302, 31270835 ), Chinese Academy of Sciences (KJZD-EW-L03), Yunnan-provinsen Science and Technology Department Basic Research Foundation (2011FZ109) og State Key Laboratory of genressurssenter og Evolution (GREKF11-13).
