Abstract
Synaptonemal komplekse protein 3 (SCP3), et medlem av Cor1 familie, er oppregulert i ulike kreftceller; Men dets onkogene potensial og klinisk betydning har ennå ikke blitt karakterisert. I denne studien undersøkte vi onkogene rolle SCP3 og sitt forhold til fosforylert AKT (Pakt) i livmorhalsen neoplasier. Den funksjonelle rollen SCP3 uttrykk ble undersøkt ved overekspresjon eller knockdown av SCP3 i murine cellelinje NIH3T3 og menneskelivmorhalskreft cellelinjer CUMC6, Siha, CaSki, og HeLa både
in vitro Hotell og
in vivo
. Videre undersøkte vi SCP3 uttrykk i vevsprøver fra 181 livmorhalskreft og 400 livmorhalsen (CIN) pasienter ved immunhistokjemi og analysert sammenhengen mellom SCP3 uttrykk og clinicopathologic faktorer eller overlevelse. Overekspresjon av SCP3 fremmet AKT-mediert tumorigenesis både
in vitro Hotell og
in vivo
. Funksjonelle studier som anvender NIH3T3-celler viste at den C-terminale region av human SCP3 er viktig for AKT-aktivering og dets onkogene potensiale. Høy uttrykk for SCP3 var signifikant assosiert med tumorstadium (
P
= 0,002) og tumor Karakter (
P
0,001), mens SCP3 uttrykk var positivt assosiert med Pakt protein nivå i livmor neoplasier . Overlevelsestiden for pasienter med livmorhalskreft overekspresjon både SCP3 og Pakt (median, 134,0 måneder,
n
= 68) var betydelig kortere enn for pasienter med lavt uttrykk av enten SCP3 eller Pakt (161,5 måneder, n = 108) som bestemmes av multivariat analyse (
P
= 0,020). Våre funn tyder på at SCP3 spiller en viktig rolle i utviklingen av livmorhalskreft gjennom AKT signalveien, støtter muligheten for at SCP3 kan være en lovende ny kreft mål for livmorhalskreft terapi
Citation. Cho H, Noh KH, Chung JY, Takikita M, Chung EJ, Kim BW, et al. (2014) Synaptonemal Complex Protein 3 Er en prognostisk markør i livmorhalskreft. PLoS ONE 9 (6): e98712. doi: 10,1371 /journal.pone.0098712
Redaktør: Eric Asselin, University of Quebec i Trois-Rivieres, Canada
mottatt: 28 september 2013; Godkjent: 06.05.2014; Publisert: 06.06.2014
Copyright: © 2014 Cho et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av National Research Foundation of Korea (2012R1A2A2A01007527, 2012R1A6A3A01010537, 2011-0005230, 2011-0010286, og 2011-0007146), Korea Healthcare Technology R D Project (A121387, A110057 og A062260), og fakultetet forskningsmidler fra Yonsei Høgskolen of Medicine (3-2010-0072, 6-2011-0073, og 6-2013-0106). Denne forskningen ble støttet delvis av egenutført Research Program fra NIH, National Cancer Institute, senter for kreftforskning. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft~~POS=TRUNC celler~~POS=HEADCOMP vise en rekke antigener inkludert unormalt uttrykk for kreft /testis assosierte antigener (CTA). CTA er begrenset i normale vev til kjønns celler i testis, med leilighetsvis ekspresjon i kvinnelige forplantningsorganer, og er uttrykt i histologisk forskjellige typer av maligne humane tumorer [1] – [4]. Svulsten begrensede ekspresjon mønster av CTAs gjør dem til interessante mål for immunterapeutiske metoder [3], [5]. Rollen til CTA-ekspresjon i tumorceller er fortsatt uklart, og således er et område med aktiv forskning. Likeledes kan våre resultater på uttrykk for CTAs og deres molekylære mekanismen i tumorceller gi bedre innsikt i tumorigenesis.
Cor1 familiemedlemmer som X-bundet lymfocytt regulert protein (XLR), XLR-relaterte meiose regulert protein (XMR), og synaptonemal sammensatt protein 3 (SCP3) er typiske CTA [1]. De er involvert i DNA-bindende proteiner og en strukturell komponent av synaptonemal komplekset, som medierer SYNAPSIS, sammenkoblingen av homologe kromosomer under meiose av kimceller [6]. Spesielt, hannmus mangelfulle for SCP3 er sterile som et resultat av massiv apoptotisk celledød i testiklene under meiotisk prophase [6], [7]. Selv om SCP3 er uttrykt strengt i testikkel og eggstokk i normalt vev, er ekspresjonen av SCP3 hyppig observert i forskjellige humane kreftceller, slik som akutt lymfoblastisk leukemi og ikke-småcellet lungekreft [8], [9]. Vi har tidligere gjennomført en liten pilotstudie, og funnet ut at SCP3 er uttrykt i ulike livmorhalskreft cellelinjer og et lite antall livmorhalskreft vev [10]. Men ingen av disse studiene har gitt overbevisende bevis for onkogene potensialet SCP3.
For å belyse hvilken rolle SCP3 i tumorigenesis, undersøkte vi hvilken rolle disse medlemmene som potensielle teinene ved å gjennomføre en rekke
in vitro Hotell og
in vivo
eksperimenter med både en murine cellelinje (NIH3T3) og menneskelivmorhalskreft cellelinjer (CUMC6, Siha, CaSki, og HeLa). Her rapporterer vi at overekspresjon av SCP3 induserer fenotypiske endringer karakteristisk for transformasjon både
in vitro Hotell og
in vivo
. Videre analyserte vi mønstre av SCP3 og Pakt uttrykk ved immunhistokjemi i livmor vevsprøver fra pasienter med livmorhalsen (CIN) eller invasiv livmorhalskreft. Forholdet mellom protein uttrykk og clinicopathological parametre /overlevelse av livmorhalskreftpasienter ble også analysert, og viste at SCP3 uttrykk er en prognostisk faktor for pasienter med livmorhalskreft.
Materialer og metoder
Mus og cellelinjer
seks til åtte uker gamle Balb /c Nude mus ble kjøpt fra Daehan Biolink (Chungbuk, Korea). Alle dyr prosedyrer ble utført under en protokoll godkjent av Universitetet i Korea Institutional Animal Care og bruk Committee (KUIACUC-2009-126). Den murine fibroblast cellelinje NIH3T3 og humane cervikale kreftcellelinjer CUMC6, Siha, CaSki, og HeLa ble anskaffet fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) i nærvær av 10 % føtalt bovint serum (FBS). Alle celler ble dyrket i 5% CO
to balanserte luft ved 37 ° C. Identiteten til cellelinjer ble bekreftet av kort tandem repeat (STR) profilering av IDEXX Laboratories Inc. og brukes innen 6 måneder for testing.
Pasienter og tumorprøver
Primære vevsprøver ble oppnådd mellom 1996 og 2010 fra 181 tilfeller av livmorhalskreft, 301 tilfeller av høy klasse cervikal intraepitelial neoplasi (CIN), og 99 tilfeller av lav karakter CIN gjennomgår primær kirurgi ved Gangnam Severance Hospital, Yonsei University School of Medicine. Alle pasienter ga muntlig og skriftlig informert samtykke. Parafinblokker for noen av pasientene ble gitt av Korea Gynekologisk kreft Bank gjennom Bio Medisinsk Technology Development Program for departementet for utdanning, vitenskap og teknologi, Korea (https://www.kgcb.or.kr). Alle tumorvev ble histologisk vurdering og bare prøver med en tilstrekkelig mengde av tumorceller ble inkludert i vevet microarray konstruksjon. Staging ble utført i henhold til International Federation of gynekologi og fødselshjelp (FIGO) iscenesettelse system. Primær behandling for invasiv livmorhalskreft besto av en type 3 radikal hysterektomi med bekken lymfeknute disseksjon. Samtidig Platinum-basert chemoradiation ble gitt i tilfeller med økt risiko for tilbakefall, slik som positive reseksjonskanten, positive lymfeknuter, eller parametrial invasjon. Medisinske journaler ble gjennomgått for å skaffe data inkludert alder, kirurgisk prosedyre, overlevelse, og overlevelse status. Behandlingsrespons ble vurdert i henhold til de Response evalueringskriterier i solide tumorer (RECIST, versjon 1.0), enten ved computertomografi eller magnetisk resonans imaging [11]. Data om tumorstørrelse, celletype, svulst klasse, og lymfeknutemetastase ble oppnådd ved å gjennomgå patologi rapporter. Studien protokollen ble godkjent av Institutional Review Boards (IRBs) av Gangnam Severance Hospital og Riks mennesker forskning ved National Institutes of Health (NIH).
Konstruer av SCP3 og dens sletting mutante ekspresjonsvektorer
hSCP3 fulle og delesjonsmutanter ble opprettet med en PCR-basert strategi fra en human testikkel cDNA bibliotek (Clontech, Moutain View, CA) med følgende primere: hSCP3 en frem 5′-GCTCGAGATGGTGTCCTCCGGAAAAAAG-3 «; hSCP3 81 fremover 5»-CCCTCGAGACCATGATTAACAAGGCTCTTCTT-3 «; hSCP3 131 fremover 5»-GGCTCGAGATGGATATGCAGAAAGCTGAG-3 «; hSCP3 80 reverse 5»-CGAATTCTCAGTCAACTCCAACTCCTTCCA-3 «; hSCP3 130 reverse 5’CGAATTCTCAGAAACTGCTGAGAATAT-3 «; hSCP3 236 reverse 5»-CGAATTCAGTCTTATTGTACCTAACTTCTCTG-3 «. hSCP3 1-236 (full), 1-80, 1-130, 81-236 og 131-236 fragmenter ble subklonet inn i pMSCV-puro vektor (Clontech) på
Xho
jeg og
EcoRI
I restriksjonsseter. Rekombinante pMSCVs koder SCP3 eller dets delesjonsmutanter ble bekreftet ved DNA-sekvensanalyse.
Konstruer av shSCP3 vektorer
For å generere Scp3 kort hårnål RNA (shRNA) exoression konstruere menneske Scp3-shRNA glødet frem 5 «GATCCGGAGAAGAATCATGATAATTCAAGAGAT TATCATGATTCTTCTCCTTTTTTGGAAA-3» (
Bam
HI-kompatibel) og omvendt 5’AGCTTTTCCAAAAAAGGAGAAGAATCATGATAATCTCTTGAATTATCATGATTCTTCTCCG-3 «(
Hind
III-kompatible) oligonukleotider ble ligert til
Bam
HI /
Hind
III-fordøyd pSilencer 3,1-H1 puro. Den shRNA kontroll anvendt for disse studiene ble et forvrengt DNA-sekvens som ikke er rettet mot noen identifisert humane kodende sekvens (Ambion, Austin, TX).
Western blot-analyse
For hvert forsøk ble en total av 5 x 10
5-celler ble skylt to ganger med iskald PBS og tilsatt 0,2 ml av protein ekstraksjonsløsning RIPA (Elpis Biotech, Daejeon, Korea) [50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM phenylmethylsulphonyl fluorid (PMSF), 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS), 1% Nonidet P-40 (NP-40), 0,5 mM EDTA], inkubert i 30 minutter på is, og deretter ble skrapet og sentrifugert. Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved Coomassie-pluss-proteinanalyse (Pierce, Rockford, USA). 50 ug protein ble solubilisert i Laemmli-buffer (62,5 mM Tris /HCl pH 6,8, 10% glycerol, 2% SDS, 5% merkaptoetanol og 0,00625% bromfenolblått), kokt i 5 minutter, og deretter separert ved SDS-polyakrylamid gelelektroforese. Separerte gel ble overført til nitrocellulosemembraner ved 90 V i 1 time på is. Primære antistoffer mot fosfo AKT (Ser473), AKT, og fosfo ERK (T202 /Y204) ble anskaffet fra Cell Signaling (Beverly, MA) og anvendt i en fortynning på 1:1000. Likeledes ble primære antistoffer mot dobbel fosfor p38 MAPK (Stressgen, Victoria, Canada) og SCP3 (BD Biosciences, San Jose, CA) som brukes ved en fortynning på 1:1000, mens antistoffer mot β-aktin og Flag (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ble anvendt ved en fortynning på 1:10,000 i Tris-bufret saltvann (TBS) -T inneholdende 5% BSA (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ved 4 ° C over natten, etterfulgt av 3 vaskinger i TBST, 5 minutter per vask. Geit-anti-mus-IgG-HRP-anti-kanin IgG-HRP sekundære antistoffer (1:5000) (Stressgen) ble inkubert i 1 time ved romtemperatur konjugert med pepperrot-peroksydase. Immunreaktive bånd ble visualisert ved forsterket kjemiluminescens (ECL, Elpis Biotech). Densitometry ble utført ved hjelp av et bilde analysator Fujifilm LAS-4000 (Fuji, Tokyo, Japan) og Multi Gauge V3.1 bildebehandlingsprogrammer (Fujifilm Medical Systems USA, Inc., Edison, NJ). For å kvantifisere intensiteten profilen til protein bandet bildene, brukte vi Bilde J densitometry programvaren (versjon 1.6, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Bandet bildene ble skannet i gråtoner med en oppløsning på minst 600 dpi og uttrykte en prosentandel av den totale størrelsen på alle de målte topper. For å beregne en relativ verdi, ble intensiteten av hver prøve dividert med den for kontrollen. Tallene nedenfor western blots referere til de relative verdier av intensiteten normalisert til hver kontroll.
celleproliferasjon og kolonidannelse assays
For celle proliferasjonsanalyser, cellene (n = 3) ble dyrket i seks brønns plater ved en tetthet på 1 x 10
4 celler per brønn i 3 dager. Prosentene av levende celler ble bestemt ved hjelp av en hematocytometer etter 0,4% trypanblått farging. Målinger ble foretatt i triplikat for hver av cellelinjene og forsøkene ble gjentatt tre ganger. For soft-agar-kolonidannelsesbestemmelsen, 1 x 10
4 NIH3T3-celler, ble CaSki-celler og HeLa-celler sådd ut i 6-brønns kulturplate som en suspensjon i 2 ml DMEM inneholdende 10% FBS og 0,4% agar på toppen av basislaget på 0,7% agar inneholdende 2 ml av det samme medium. Platene ble inkubert ved 37 ° C i 2 uker inntil kolonier ble dannet. To uker senere 2 mm kolonier ble tellet med en okulær mikrometer på et mikroskop. Alle forsøkene gjentas minst to ganger.
siRNA behandling
Synthetic liten interfererende RNA (siRNA) som er spesifikt for grønt fluorescerende protein (GFP) og mus AKT ble innkjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, CA). De følgende sekvenser ble anvendt: GFP (ikke-spesifikk målstyrings) 5′-GCAUCAAGGUGAACUUCAA-3 «(sense), 5′-UUGAAGUUCACCUUGAUGC-3′ (antisense); AKT, 5»-GACAACCGCCAUCCAGACU-3 «(sense), 5′-AGUCUGGAUGGCGGUUGUC-3» (antisens). For
in vitro
levering, NIH3T3 celler på en seks-brønns fartøyet ble transfektert med 300 pmol av de syntetiserte sirnas bruker Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. SiRNA-behandlede celler ble samlet 48 timer etter transfeksjon for western blot analyse, celleproliferasjon analysen, og kolonidannende analysen.
Svulstdannelse
De transfekterte NIH3T3 celler (1 x 10
5 celler /mus), CaSki celler (1 x 10
6 celler /mus), eller HeLa-celler (1 x 10
6 celler /mus) ble injisert subkutant i Balb /c nakne mus. Tumorstørrelse ble målt to ganger per uke i 24 dager etter tumorcelle-injeksjon. Hver enkelt tumorstørrelse ble målt med en skyvelære, og tumorvolumet ble beregnet ved anvendelse av følgende formel: Tumor volum (mm
3) = [bredde x lengde
2] /2 [12]
Immunofluorescent merking av kreft vevssnitt
tumor vevsprøver ble fiksert og innebygd i Tissue-Tek OCT forbindelse (Sakura Finetechnical, Tokyo, Japan) i former. For immuno-analyser, ble 10-um frysesnitt lagt ut på poly-L-lysin-belagte objektglass, fiksert i 4% paraformaldehyd, og blokkert i PBS med 10% normalt geiteserum (NGS) (NGS /PBS). Vevssnitt ble inkubert med Pakt antistoff (1:100; Cell signalering) for natten ved 4 ° C. Etter vasking ble snittene inkubert med det sekundære Alexa555-konjugert geit-anti-kanin-IgG (1:1000 i NGS /PBS; Molecular Probes, Eugene, OR) og deretter montert i Fluorescerende monteringsmedium (Dako, Glostrup, Danmark) på glassmikroskop lysbilder. Alle bildene ble anskaffet ved hjelp av en Zeiss LSM 5 Pascal konfokal mikroskop (Carl Zeiss, Jena, Tyskland). For å kvantifisere intensiteten profilen til Pakt fluorescens bilde i tumor vev seksjoner, brukte vi ImageJ densitometry programvare. De tumorvev på lysbilder ble skannet i gråtoner med en oppløsning på minst 600 dpi. Tumor områder på skannede bilder ble valgt mer enn 10 ganger fra hver gruppe med frihånd verktøy og målte gjennomsnitts grå verdi. For å beregne en relativ verdi, ble intensiteten av hver prøve dividert med at av tomme lysbilder (uten primære antistoff).
Tissue microarray konstruksjon
Full-face deler av alle donor blokker ble farget med haematoxylin og eosin (H E) og gjennomgått av en patolog som merket representative tumorområder. Vevet microarray (TMA) ble bygget ved hjelp av en manuell Tissue Arrayer MTA-en (Beecher Instruments Inc., Silver Spring, MD). Fire 1,0 mm diameter vev kjerner som består av passet vevsprøver og normal epitelial prøver ble trukket ut fra utvalgte områder av hver donor blokk. Tilstedeværelsen av tumorvev på TMA ble bekreftet med H E farging. Flere 5 mikrometer tykke seksjoner ble kuttet med en mikrotom og H E farging av TMA skred ble undersøkt hver 50
th seksjon for tilstedeværelse av tumorceller
Immunohistochemistry og scoring
TMA. seksjonene ble deparaffinized og hydrert i xylen og synkende gradient alkoholløsninger. Endogen peroksidase ble blokkert ved inkubering i 3% H
2o
2 til 10 minutter. Antigen gjenfinning ble utført i en damptrykkoker (Pascal, Dako, Carpinteria, CA) med forvarmet antigen gjenfinning buffer pH 9 (Dako) ved 95 ° C i 10 minutter. For å minimere ikke-spesifikk farging ble snittene inkubert med protein blokk (Dako) i 20 minutter. Snittene ble inkubert med et anti-SCP3 antistoff (klon 25 /SCP3, BD Biosciences, fortynning 1:500) over natten ved 4 ° C eller et anti-pakt-antistoff (Cell Signaling, fortynning 1:200) i 120 minutter ved romtemperatur . EnVision FLEX + og ser + Dual Link System (Dako) ble brukt for påvisning av SCP3 og Pakt, henholdsvis. Farging ble visualisert ved hjelp av 3,3′-Diaminobenzidin (DAB) og delene ble kontra med hematoksylin. Til slutt ble platene dekket og observert under et lysmikroskop (Axioplot, Carl Zeiss, Jena, Tyskland). I denne studien ble fem konvensjonelle hel del lysbilder nøye utvalgt for å validere immunhistokjemisk farging utført for SCP3 og Pakt. Under denne prosessen ble fargemønstre grundig sammenlignes, og noen av mønstrene matchet de konvensjonelle objektglass fra det samme tilfellet. Videre er det i utformingen av denne studien, stromale celler fra de hele deler av cercival kreft ble valgt som intern positiv kontroll, mens det primære antistoff ble utelatt fra den negative kontrollen.
SCP3 og pakt fargingsresultater ble bedømt basert på (a ) intensitet [kategorisert som 0 (fraværende), 1 (svak), 2 (moderat), eller 3 (sterk)] og (b) prosentandelen av positive fargede epitelceller [skåret som 0 (0% positive), 1 (1 -25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%), eller 4 ( 75%)] (figur S1). En samlet protein uttrykk poengsum ble beregnet ved å multiplisere intensitet og positivitet score (total poengsum range 0-12). IHC Poengsummen ble deretter dikotomisert til høy uttrykket (SCP3 IHC score på 7 og Pakt score på 7, henholdsvis), og lav uttrykk (IHC score på ≤7 i både SCP3 og Pakt). Mottaker opererer karakteristikk (ROC) analyse ble benyttet ved fastsettelse av grenseverdier for SCP3 og Pakt. Sensitiviteten og spesifisiteten for diskriminerende død eller levende ble plottet ved hver IHC stillingen og cut-off-verdi ble etablert til å være punktet for ROC-kurve hvor summen av sensitivitet og spesifisitet ble maksimere [13]. To uavhengige patologer med erfaring i vevet microarray analyse undersøkt lysbildene uten kjennskap til de tilsvarende kliniske data.
Statistisk analyse
Alle data er representative for minst 2 uavhengige forsøk. Ikke-parametrisk en-veis eller to-veis ANOVA ble utført med SPSS versjon 18,0 programvare (SPSS Inc., Chicago, IL). Sammenligninger mellom individuelle datapunkter ble vurdert med t-test. Statistiske analyser av SCP3 og Pakt uttrykk ble utført med Mann-Whitney test og Kruskal-Wallis test. Den Spearman nonparametric korrelasjon test ble benyttet for å analysere forholdet mellom SCP3 og Pakt. Overlevelseskurver ble estimert ved Kaplan-Meier-analysen. Den log-rank test ble brukt for å sammenligne forskjeller i overlevelse fordeling mellom grupper. Den multivariat analyse med Cox modellen ble utført for å identifisere uavhengige prediktorer for sykdomsfri overlevelse i justering med relevante kliniske kovariater som alder, FIGO stadium, histologisk type svulst klasse, tumorstørrelse og lymfeknutestatus. Den endelige modellen ble valgt basert på resultatet av univariable analyser samt vurdering av klinisk eller biologisk betydning av variablene. Alle statistiske tester var tosidig, og
P
verdier. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Ektopisk uttrykk for hSCP3 øker spredning og tumorigenicity av NIH3T3 celler
En tidligere studie rapportert at human SCP3 (hSCP3) blir uttrykt i forskjellige kreftceller, og at dets ekspresjon i humane prøver er forbundet med onkogenese [8], [10]. Imidlertid er onkogene potensialet til SCP3 er ikke tilstrekkelig karakterisert ved enten det molekylære eller cellenivå. For å undersøke om hSCP3 kan ha cellular karsinogent potensial, vi først brukt en ikke-tumorigen murine fibroblast NIH3T3 cellelinje og etablerte cellelinjer som uttrykker hSCP3 ved hjelp av en retroviral transduksjon system (NIH3T3 /hSCP3). NIH3T3 /ingen innsats (tom vektor) celler ble også etablert som en kontroll. Ekspresjonen av SCP3 protein i NIH3T3 /hSCP3-celler ble bekreftet ved Western blot (figur 1A). Celleproliferasjon av transduserte NIH3T3-celler ble målt ved å telle antallet av levende celler etter trypan blå farging. I celle spredning analyser (figur 1B), NIH3T3 /hSCP3 celler viste en signifikant økt spredning hastighet sammenlignet med NIH3T3 /ingen sette inn celler (
P
0,005). Resultatene av en bløt agar-kolonidannelse analysen med de samme cellelinjer var i samsvar med de av celleproliferasjonsanalyse (figur 1C). NIH3T3 /hSCP3 celler viste signifikant høyere potensialer av kolonidannelse i soft agar sammenlignet med NIH3T3 /ingen sette inn celler (
P
0,005). Vi neste subkutant injisert hSCP3- eller ingen insert-uttrykke NIH3T3 celle i venstre flanke atymiske Balb /c Nude mus (figur 1D). I samsvar med vår
in vitro
data, svulsten dannende evne NIH3T3 celler ble drastisk økt med ectopically-uttrykke hSCP3 (ingen insert
vs
. HSCP3,
P
(Venstre) Representative bilder av gjennomsnittlig kolonistørrelse i hver gruppe; (Til høyre) av søylediagram som representerer antall kolonier med diameter større enn 2 mm i soft agar (Skala: 1 mm). (D) tumorgenisitet av NIH3T3 /hSCP3 celler. Balb /c naken mus (n = 5) ble inokulert subkutant med 1 x 10
5 celler /mus av NIH3T3 /nei innsats eller NIH3T3 /hSCP3 celler. Feilfelt representerer gjennomsnitt ± SD.
hSCP3 fremmer tumordannelse gjennom AKT sti i NIH3T3 celler
Vi har tidligere rapportert at Pakt nivået økes i hSCP3-uttrykke livmorhalscellelinjer [10] . For å evaluere endringer i ulike signalmolekyler som kan spille en rolle i den globale kontrollen av celleproliferasjon, utførte vi Western blot-analyse for å måle nivåene av Ser 473 fosforylert AKT, Thr 202 /Tyr 204 fosforylert ERK, og Thr 180 /Tyr 182 fosforylert p38 MAP kinase i NIH3T3 celler som uttrykker hSCP3 eller ingen innsats (tom vektor). Vi har observert at ekspresjon av pakt ble betydelig øket i celler transdusert med hSCP3 sammenlignet med kontrollceller (figur 2A). Ved siden av, for å undersøke forholdet mellom hSCP3-mediert karsinogent potensial og AKT-signalering, sammenlignet vi både celleproliferasjon og bløt agar-kolonidannende evne av NIH3T3 /hSCP3-celler i nærvær av kontroll (DMSO), 10 uM API2 (en inhibitor av AKT ), 50 uM PD98059 (en inhibitor av MEK /ERK) eller 10 pM SB203580 (en inhibitor av p38-MAPK) (figur 2B og 2C). Behandling med PD 98059 og SB203580 ikke påvirke spredning og kolonidannelse kapasiteten NIH3T3 /hSCP3 celler sammenlignet med DMSO. Tvert imot, API2 behandlet NIH3T3 /hSCP3 celler oppviste en betydelig redusert formeringshastigheten sammenlignet med DMSO-behandlet kontroll (
P
0,001). Konsekvent, API2 behandlet NIH3T3 /hSCP3 celler dannes også mindre kolonier, antall som var nesten 5 ganger mindre enn kolonier dannet av DMSO-behandlet NIH3T3 /hSCP3 celler. Således er det åpenbart at både proliferasjon og kolonidannelse i disse celler er avhengig av AKT signalering. For å utelukke potensielle off-target effekter av API2, vi utførte
in vitro
celleproliferasjon og myke agar-kolonidannelse eksperimenter med siRNA-måls AKT (siAKT) for å blokkere AKT veien. siRNA rettet mot å irrelevant GFP (GFP siRNA) ble brukt som en negativ kontroll. I samsvar med API2 data, siAKT behandlet NIH3T3 /hSCP3 celler viste en redusert rate av celledeling (figur 2D og 2E) og koloni tall sammenlignet med kontroll siGFP behandlet NIH3T3 /hSCP3 celler (figur 2F). Lignende AKT avhengighet ble også observert i NIH3T3-celler som uttrykker mXLR, som viste den mest potente karsinogent potensial blant medlemmer av murine Cor1 familien (fig S3). Dermed våre data viser at SCP3 og de andre Cor1 medlemmene kunne gi tumorigene potensialer ved NIH3T3 cellen gjennom AKT veien.
(A) Western blot analyse av nivåer av Pakt, Perk, og pp38 i NIH3T3 celler ectopically uttrykker hSCP3 eller ingen innsatsen. Tallene nedenfor western blots referere til de relative verdier av intensiteten normalisert til ingen innsatsen kontroll. (B)
In vitro
vekstkurver av NIH3T3 /hSCP3 celler behandlet med DMSO eller API2 (Akt hemmer), PD98059 (Erk-hemmer), eller SB203580 (p38 inhibitor). (C) Myk agar-kolonidannende kapasitet på NIH3T3 /hSPC3 celler i nærvær av API2, PD98059, eller SB203580; (C, Høyre) Representative bilder av gjennomsnittlig kolonistørrelse i hver gruppe; (C, venstre) søylediagram som viser antallet kolonier med diameter større enn 2 mm i soft agar (Skala: 1 mm). (D) Western blot-analyse av nivåer av pakt i NIH3T3 /hSCP3 celler transfektert med et siRNA rettet mot GFP eller AKT (siGFP eller siAKT) for å bekrefte reduksjon av AKT proteinnivå. Tallene nedenfor western blots referere til de relative verdier av intensiteten normalisert til ingen innsatsen kontroll. (E)
In vitro
vekstkurver av NIH3T3 /hSCP3 celler transfektert med siGFP eller siAKT. (F) Myk agar-kolonidannende kapasitet på NIH3T3 /hSPC3 celler behandlet med siGFP eller siAKT; (Venstre) Representative bilder av gjennomsnittlig kolonistørrelse i hver gruppe; (Høyre) av søylediagram som representerer antall kolonier med diameter større enn 2 mm i soft agar (Skala: 1 mm). Feilfelt representerer gjennomsnitt ± SD.
Den C-terminale regionen hSCP3 er tilstrekkelig til å øke Pakt nivåer og forbedre tumorigenesis
Som skjematisert i figur 3A, inneholder hSCP3 en kjernefysisk lokalisering signal (NLS, rester 88-91), Gin-rike (rester 106-139) og coiled-spole (rester 131-236) motiver. For å identifisere viktige motiver involvert i hSCP3-mediert onkogenese, bygget vi fire delesjonsmutanter av hSCP3 inneholder forskjellige motiver (figur 3A). N-termini av full hSCP3 og delesjonsmutanter ble merket med et flagg epitop for visualisering av Western blot. Deretter karakterisert ekspresjon og funksjon av hSCP3 og dens mutanter i retrovirus-transdusert NIH3T3-celler. Spesielt, mutanter mangler coiled-spole motiv (hSCP3
1-80 og hSCP3
1-130) ikke klarte å øke fosforylering av AKT (figur 3B). Motsatt hSCP3
81-236 og hSCP3
131-236 mutanter som inneholder coiled-spole motiv vellykket økte nivåer av Pakt (figur 3B). I samsvar med disse observasjonene, NIH3T celler som uttrykker hSCP3
81-236 eller hSCP3
131-236 viste en økt forekomst av celleproliferasjon og antall koloni sammenlignet med dem som uttrykker hSCP3
1-80 og hSCP3
1-130 så vel som ingen innsats (figur 3C og 3D). Enda viktigere er, som vist i figur 3E-3G, lignende fenomen ble også observert
in vivo
med tumor xenograft eksperimenter. Svulsten dannende evne NIH3T3 celler ble drastisk økt etter ektopisk uttrykk for hSCP3
81-236 og hSCP3
131-236 [no sett inn
vs
. hSCP3
81-236 (
P
0,01) eller hSCP3
131-236 (
P
0,003)]. Tilsvarende ble immunfluorescens farging for Pakt økt betydelig i histologiske deler av svulster ectopically uttrykke hSCP3
81-236 eller hSCP3
131-236 [no sett inn
vs
. hSCP3
81-236 (
P
0,05) eller hSCP3
131-236 (
P
0,003)] (Figur 3G). Tatt sammen, våre data indikerer at kveil-spole-motivet som inneholder den C-terminale region er den primære bidragsyter til den AKT-avhengige onkogene potensialet av hSCP3.
(A) Skjematisk fremstilling av domenene i hSCP3. Bokser representerer NLS, Gin-rike, og kveilet-spole motiver, henholdsvis. (B) Western blot-analyse av nivåer av hSCP3 og dets delesjonsmutanter, ble den N-termini som er merket med et flagg epitop for visualisering. Tallene nedenfor western blots referere til de relative verdier av intensiteten normalisert til ingen innsatsen kontroll. (C) Myk agar-kolonidannende kapasitet på NIH3T3 som uttrykker villtype eller delesjonsmutanter av hSCP3. (D)
In vitro
vekstkurver av NIH3T3 celler som uttrykker villtype eller sletting mutanter av hSCP3. Cellene ble tellet etter trypan blue-farging for å ekskludere døde celler. (E)
In vivo
tumorigenicity av NIH3T3 celler. Balb /c naken mus (n = 5) ble inokulert subkutant med 1 x 10
5 celler /mus av NIH3T3-celler som uttrykker full lengde eller mutant hSPC3. Feilstolpene representerer gjennomsnittet ± SD. (F) Representative bilder av hudkreft (skala bar: 60 mm). (G) Bar kurve som representerer intensiteten av fluorescens pakt bilde på tumor vevssnitt ble ImageJ densitometri programvare som brukes til å kvantifisere intensiteten av bildet som beskrevet i Materialer og Metoder.
