Abstract
Penis kreft (Peca) er en relativt sjelden svulst enhet, men besitter høyere sykelighet og dødelighet, spesielt i utviklingsland. Til dags dato, de konkrete sykdomsfremkallende signalveier og kjerne machineries som er involvert i tumordannelse og progresjon av Peca fortsatt ikke klarlagt. Flere studier antydet mirnas, som modulerer genekspresjon på posttranskripsjonelt nivå, var ofte mis-regulert og abnormt uttrykt i kreft hos mennesker. Imidlertid har miRNA profilen i human PECA ikke vært rapportert tidligere. I denne studien ble miRNA profilen innhentet fra 10 friske penis kreft vev og matchet tilstøtende ikke-kreft vev via neste generasjons sekvensering. Som et resultat ble totalt 751 og 806 kommenterte mirnas identifisert i normale og kreft penile vev, henholdsvis. Blant annet, ble 56 mirnas med vesentlig forskjellige uttrykk nivåer mellom parede vev identifisert. Deretter ble flere kommenterte mirnas valgt tilfeldig og validert ved hjelp av kvantitativ real-time PCR. Sammenlignet med tidligere kunngjøringer angå til endrede mirnas uttrykk i ulike kreftformer og spesielt urin (prostata, blære, nyre, testis) kreft, den mest flertallet av deregulerte mirnas viste lignende uttrykk mønsteret i peniskreft. Videre analyser av bioinformatikk antydet at de antatte målgener av forskjellig uttrykt mirnas mellom kreft og matchet normale penis vev var tett forbundet med celle krysset, spredning, vekst samt genomisk ustabilitet og så videre, ved å modulere Wnt, MAPK, p53, PI3K -Akt, Notch og TGF-β signalveier, som var alle veletablerte å delta i kreft initiering og progresjon. Vårt arbeid viser en global visning av forskjellig uttrykt mirnas og potensielt regulatoriske nettverk av sine mål gener for å avklare patogene transformasjon av normal penis til Peca, som forskningsressurs gir også ny innsikt i fremtidige undersøkelser rettet til å utforske i dybden mekanismer mirnas og andre små RNA inkludert piRNAs i penile kreft regulering og effektiv target-spesifikke theragnosis
Citation:. Zhang L, Wei P, Shen X, Zhang Y, Xu B, Zhou J et al. (2015) mikroRNA Expression profil i Peniskreft avslørt av Next-Generation små RNA sekvensering. PLoS ONE 10 (7): e0131336. doi: 10,1371 /journal.pone.0131336
Redaktør: Yu Xue, Huazhong University of Science and Technology, KINA
mottatt: 10 februar 2015; Godkjent: 01.06.2015; Publisert: 09.07.2015
Copyright: © 2015 Zhang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All rå sekvense filer er tilgjengelig fra ArrayExpress databasen (tiltredelse nummer~~POS=HEADCOMP: E-mtab-3087)
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation of China (No.81401518, nr 31430028 National, http: //www.nsfc.gov.cn/) (LZ); Foundation National Natural Science of China (No. 81170698, nr 81370856, https://www.nsfc.gov.cn/) (CZL); Foundation National Natural Science of China (No. 31370983, https://www.nsfc.gov.cn/) (DHZ); Anhui Provincial Natural Science Foundation (No.1408085QH180, https://www.ahkjt.gov.cn/) (LZ), Clinical sentrale temaer Program of Ministry of Public Health of China (Urologi, http: //www.nhfpc .gov.cn /) (CZL), dyrking prosjekt for NSFC på Anhui Medical University (No. 2013KJ14, https://www.ayfy.com) (LZ) og Key-prosjektet av den kinesiske utdanningsdepartementet (No. 212080, https://www.moe.edu.cn/) (DHZ). Finansiører hadde ingen roller i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
molekylær forskning har dukket opp som et lovende verktøy for dyptgående forståelse i kreftutvikling, med sine cellulære komponenter, signalveier og farmasøytiske mål i kreftbehandling. Dessverre har den bemerkelsesverdige fremskritt ikke omfattet alle krefttyper. Peniskreft (Peca) er en slik relativt sjelden svulst enhet i de utviklede landene i verden, ble bare ca 1640 penile kreft tilfeller nylig diagnostisert og 320 kreftrelaterte dødsfall ble anslått i 2014 i USA nasjonalt [1]. Mens de sykelighet og dødelighet av Peca i de fleste utviklingsland var betydelig høyere, sto for en 3-10 ganger økning i satsene for utviklede land i løpet av de siste tiårene [2]. Peniskreft er assosiert med flere etablerte risikofaktorer som humant papillomavirus (HPV) infeksjon, dårlig hygiene, fimose med kronisk betennelse, røyking og noen epigenetiske alter inkludert histone metylering modifikasjoner [3,4]. Dessuten har noen gener under kreftutvikling, spredning, invasjon og metastasering av Peca blitt identifisert. For eksempel, p53, cyklin-avhengig kinase inhibitor 2A (CDKN2A) og matrise metallopeptidase 9 (MMP-9) ble påvist å spille viktige roller i PECA kreftfremkallende ruter og epitelial-mesenkymale overgang (EMT), henholdsvis [5]. Likevel, som nevnt ovenfor, mer omfattende undersøkelser for å ytterligere belyse de eksakte mekanismene av molekylære endringer ligger til grunn for initiering, utvikling og progresjon av Peca er viktig for oss å utforske nye og verdifulle forebyggende, tidlig oppdagelse, målrettet terapi og prognose prediksjon innfallsvinkler for dette genitourinary lidelse.
Moden microRNAs (mirnas) er en gruppe av endogent uttrykt, evolutionally konservert, enkelt-strandet og ikke-kodende små RNA (smRNAs, ca 19-23 nukleotider i lengde) som fungerer som posttranskripsjonelt regulatorer av genet ekspresjon i et bredt spekter av organismer [6]. Hittil har mer enn 1000 mennesker mirnas blitt identifisert og enorm observasjoner er oppnådd i å koble de alternative og avvikende uttrykk nivåer av miRNAs med initiering og progresjon av menneskelige sykdommer, spesielt for ulike typer krefttyper [7-9], som ikke mindre enn halvparten miRNA gener er lokalisert i kreft-assosiert regioner eller skjøre områder i hele genomet [10]. miRNA deregulering i tumorbiologi ble først observert i miRNA-15a og miRNA-16-1 innenfor locus 13q14, begge de to mirnas som målrettede B-cellelymfom 2 (BCL-2) mRNA ble slettet eller nedregulert i de fleste flertallet av kronisk lymfatisk leukemi (KLL) tilfeller, noe som resulterer i tumorigenesis ved å redusere apoptotiske aktiviteter [11]. For tiden har det blitt allment akseptert at distinkte typer kreft, scener, regresjon karakterer eller differensieringstilstander kan ha individuelle miRNA uttrykk profiler, som holder store løftet i å opptre som pålitelige molekylære biomarkører for kreftdiagnose, og kan også avsløre nye patogene signalveier korrelert med kreftutvikling og progresjon for målrettede molekylære therapeutics [12]. Helt siden, en rekke teknikker har blitt innført for å gjennomføre miRNA profilering. For eksempel, kvantitativ revers-transkripsjon polymerase chain reaction (QRT-PCR) analyser, Northern blotting analyser og mikromatriser noen gang har vært mye brukt for miRNA profilering studier [13]. Nylig har en nyutviklet teknologi kalt neste generasjons sekvensering (NGS) fått mye oppmerksomhet i små RNA (smRNA) profilering på grunn av sin unike fordeler i test spesifisitet, sensitivitet og romanen smRNAs identifikasjon [14-16]. Der, kan vi oppdage nesten alle smRNAs som kjente og nye mirnas selv med ekstremt lav overflod, små cytoplasmatiske RNA (scRNAs), kjernefysiske RNA (snRNAer), nukleolære RNA (snoRNAs) og Piwi-samspill RNA (piRNAs) [17] .
i denne studien, vi tar sikte på å fylle gapet i informasjon om miRNA profil i menneskelig peniskreft og evaluert en mulig sammenheng mellom differensierte miRNA uttrykk nivåer med tumorigenesis og progresjon. Ved å bruke neste generasjons sekvensering (NGS) -teknologi, utførte vi smRNA-seq for ti paret fersk-frosne eksemplarer av penile plateepitelkarsinom og matchet histologisk normale penis vev som var ved siden av kreft. Vi har adressert generell informasjon av miRNA uttrykket profiler i begge de sammenkoblede penile vev og spesielt fant at en rekke miRNAs ble abnormt uttrykt i peniskreft sammenlignet med matchede normalt vev. Spesielt genet ontologi (GO) analyse av potensielle miRNA målgener indikerte at deregulerte mirnas i beriket biologiske prosesser, molekylære funksjoner og cellulære komponenter ble involvert i cellevekst, celle form, axonogenesis, protein aktivitet regulering og angiogenese, som sammen deltok i transformasjon av normale celler til maligne lesjoner. Dessuten kyoto leksikon av gener og genomer (KEGG) pathway analyse hell beriket flere tett kreft-assosiert trasé som var alt godt dokumentert til å delta i kreft initiering, utvikling, invasjon, metastaser og lover også terapi. Våre resultater gir en verdifull forskning ressurs til ytterligere belyse de regulatoriske roller mirnas i penile tumorigenesis og progresjon, som også har store løftet til rette for utvikling av nye diagnostiske biomarkører og effektive terapeutiske strategier for Peca.
Materialer og Metoder
Etikk uttalelse
informert samtykke ble signert av alle de tretten pasientene selv med penile plateepitelkarsinom som hadde fått delvis penectomy og etterforskningen ble vurdert grundig, og deretter godkjent strengt i henhold til regelverket ved etiske komiteer på menneskelig forskning av First Affiliated Hospital Anhui Medical University (Godkjenning nr PJ20140906).
kliniske prøver samling
Penis kreft og matchet ikke-maligne prøver ble samlet inn fra totalt 13 pasienter som gjennomgikk delvis penectomy 2013-2015 ved Institutt for Urologi, First Affiliated Hospital Anhui Medical University. Umiddelbart etter operasjonen, kreft og matchede normale penile vev ble separat lagret i RNAlater oppløsning (Ambion, USA) og frosset ved -80 ° C i henhold til en sop (SOP) styres av uropathologist. Kort sagt ble tumorvev som inneholder mer enn 80% tumor lesjoner inkludert for videre analyser. På tilsvarende måte ble de samsvarende normale tilstøtende vev oppnådd fra hvor i det minste 1,0 cm bortsett fra de synlige tumorøse vev i penis. Hver kreft og ikke-maligne vev ble diagnostisert histopathologically av Hematoxylin-eosin (HE) -staining.
SmRNA bibliotek konstruksjon og dyp sekvense
Total RNA ble samlet inn fra ti par av fersk frosset penile kreft og matchet histologisk normale penis vev ved hjelp TRIzol reagens (Life Technologies, USA). Kvalifisert RNA med A260 /A280-forhold mer enn 1.8 ble deretter vurdert for RNA integritet ved å gjennomføre DNA-chip analysen. To smRNA bibliotekene ble konstruert av sammenslåtte og integrerte RNA av ti personer i hver gruppe (kreft og matchet normale penile vev) ved hjelp av en smRNA prøve prep kit (Illumina, USA) etter standard protokoller med bestemte endringer [15]. I korthet, de egnede fraksjoner varierte fra 18 til 28 nt nt ble fraskilt, renset ved 15% (vekt /volum) denaturerende polyakrylamidgel-elektroforese og deretter koblet til RNA-adaptere (5′-GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC og 3′-TCGTATGCCGTCTTCTGCTTG) etterfulgt av RT-PCR forsterkning. Deretter PCR-produktene ble videre renset på agarosegel for å etablere bibliotekene. Til slutt ble de to bibliotekene som konstruert av ti kreft penile vev (sammenslåtte og homogenisert i et bibliotek) og ti matchet tilstøtende normal penis vev (sammenslåtte og homogenisert til et annet bibliotek) sekvensert ved å bruke Illumina Hiseq 2000 (Illumina, USA) ved Beijing Genomics Institute (Shenzhen, Kina) strengt følgende standard protokoller [18].
NGS dataanalyser og nye mirnas identifikasjon
smRNA sekvense data ble analysert videre henviser til metodene som er beskrevet i tidligere publikasjoner [15-18]. Konkret etter å ha slettet 5 «adapter og trimming 3» akseptor sekvenser, tilsølte og lav kvalitet leser (Q 10, ble kvaliteten verdi beregnes ved Q = ASCII tegnkode-64) som leser uten innsats fragment eller inneholder poly ( A) strekker, kvalifiserte unike koder ble kartlagt til GRCh37.p5 ved å innføre SOAP2.0 lynraske verktøy (https://soap.genomics.org.cn) [19]. Tags med ikke mer enn en mismatch ble plukket ut for senere analyser. De bevarte kjente mirnas ble identifisert ved å justere de kartlagte koder til miRBase verktøy (versjon 18.0) i
Homo sapiens product: [20], og kodene ikke matchet i miRBase ble ytterligere justert mot sekvensene av andre ikke-kodende RNA (rRNAs, tRNAs, snRNAer, snoRNAs) presenteres på Rfam database (https://www.sanger.ac.uk/resources/databases/rfam.html) [21], gjentar database samt Pirna database [22]. I betraktning av noen få smRNA koder kan tilordnes til mer enn én kategori, vi fulgte de prioriterte reglene som er beskrevet i forrige publisering for å garantere at hver unike smRNA ble kartlagt til unike merknad som følger: miRNA, Rfam, gjentar, Pirna og mRNA (122,228 .158.106 /mr2_dev) [23].
etter å ha identifisert de kjente mirnas, de gjenværende sekvensene fra alle kreft og matchede normale penile prøver ikke er merket med de ovenfor nevnte databaser ble plukket ut fra de to bibliotekene som skal innrettes med det integrerte menneske transkriptomet for å forutsi nye miRNAs. Alle hårnål-lignende strukturer som inneholder Uklassifisert smRNA koder som består av ikke mindre enn 45 leser ble beregnet med klassisk pre-microRNAs prediksjon verktøyet Mireap (https://sourceforge.net/projects/mireap/) [24] strengt i henhold til følgende regler: 1) Lengde av miRNA sekvenser varierer 18-26 nt; 2) Gratis energi av en miRNA forløper er mindre enn -18 kcal /mol; 3) Bulge tillatt for miRNA og sammenkoblede forløper miRNA * er mindre enn 4; 4) Mellomrom mellom miRNA og sammenkoblede forløper miRNA * er ikke mer enn 35 nt. I mellomtiden, RNA Fold (https://rna.tbi.univie.ac.at/RNA/RNAfold.html) [25], beregner et program minimum fri energi (MFE) og logger ikke kan lages en optimal sekundærstruktur, ble lånt ut til å forutsi alle de essensielle sekundære strukturer av potensielle miRNA forløpere. Alle rådata generert av neste generasjons sekvensering har blitt deponert i de utpekte database ArrayExpress (Tiltredelse Nummer: E-mtab-3087).
Bioinformatikk analyser for forskjellig uttrykt mirnas
Den tilnærminger beskrevet i vår forrige publisering for bioinformatikk analyser ble innført for å utføre målgener prediksjon i denne studien [17-18]. Kort fortalt ble målrettede gener forskjellig uttrykt mirnas fra kreft og matchet normale penis vev beregnet med mikrokosmos Targets, tidligere kalt miRBase mål (https://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/) [26-27 ], TargetSpy (https://targetspy.org/) [28] og Miranda (https://www.microrna.org) [29]. De konkrete spådommer ble strengt i henhold til reglene beskrevet som følger: 1) noen mismatch bør ikke bli funnet på frøet regionen; 2) Den fri energi av miRNA /target-dupleks bør være mindre enn -20 kcal /mol; 3) Den totale poengsummen for en miRNA-mRNA par bør overstige 140 [17-18].
Senere har beriket Go Krav (https://www.geneontology.org) [30] og KEGG trasé ( https://www.genome.jp/kegg/) [31] analyser ble gjennomført for de antatte målgener av forskjellig uttrykt mirnas fra normale og kreft penis prøver. Konkret etter kartlegge potensielle målgener til datasettet av GO merknader og KEGG trasé, sortere ut de beriket biologiske prosesser og signalveier gjennom hypergeometriske og Fisher tester, de berikelse forholdstall og p-verdier for GO og KEGG ble beregnet via innføre identisk formelen nevnt i vår forrige rapport [17], så False Discovery Rate (FDR) justering ble utført for å bedømme betydningen av forskjeller i multippel testing [32]. Etter hvert ble de viktigste GO vilkår og veier kun identifisert under forhold som berikelse ratio≥2.0 og FDR p-verdi 0,05 samtidig
QRT-PCR bekreftelse for endret miRNA uttrykk
Eldre miRNAs. kvantifisering ble utført av rutine kvantitativ real-time PCR ved hjelp av en Applied Biosystems StepOne real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA) og en SYBR premix Ex-Taq II kit (Takara, Japan) med optimalisert reaksjonsbetingelser og bruke de spesifikke primere oppført i S1 tabell. Kort fortalt ble total RNA ekstrahert fra 13 parvise kreft og matchet normale penis vev. Blant som ble hentet RNA fra de samme ti pasienter påføres NGS samlet og validert, mens hver total RNA fra et annet tre pasienter ble separat benyttet for videre analyser. Etter cDNA-syntese, ble triplikat reaksjoner utført ved 95 ° C /10 min, ble de etterfølgende 40 amplifiserte sykluser utført ved 95 ° C /15 s og 60 ° C /60 sek. I mellomtiden ble U6 snRNA lånes som en intern kontroll for å normalisere miRNA uttrykket. For dataanalyse ble terskelsyklusen (Ct) definert som brøk sykluser når fluorescensen passerte en fast terskel og videre anvendt for å beregne relative miRNA abundances (△△ Ct-Ct =
miRNA-Ctsn
RNAU6). Relativ uttrykk fold endringer ble beregnet ved hjelp av to
– △△ Ct formel [16]. Mirna konsentrasjonsforskjeller mellom kreft og normal penis vev ble analysert ved hjelp av uparede t-tester [18]. Når en p-verdi ble funnet å være mindre enn 0,05, vil det bli vurdert som statistisk signifikant.
Resultater
Oversikt over hele genom smRNA-sekvensering av data fra de sammenkoblede penis prøvene
Alle smRNAs av 18-32 nukleotider fra sammenkoblede fersk-frosne eksemplarer av penile plateepitelkarsinom (heretter referert til som «kreft vev») og matchet histologisk normale penis vev ved siden av kreft (heretter omtalt som «normalt vev» ), som har blitt diagnostisert histopathologically av HE-farging (fig 1), var dypt sekvensert for å få et helhetlig syn på smRNAs profil.
HE farging illustrert de representative tilstøtende normale penis vev (til venstre) og kreft penile eksemplarer (til høyre) fra tre pasienter, henholdsvis.
for hver prøve, 13796889 (av 15.702.009 leser) og 14051355 sekvens leser (av 15.698.197 leser) justert til det menneskelige genom sekvens datasettet var innhentet, som representerer 704 514 (av 966 914) og 787 447 (av 1,090,353) unike koder, henholdsvis (S2 Table). Blant annet, 6,898 unike koder som tilsvarer 4.795.955 leser og 7,173 unike koder som tilsvarer 3.815.482 leser ble matchet til kjente mirnas for normale og kreft vev, henholdsvis. I mellomtiden, 5877 tilsvarende 172 216 leser og 6272 tilsvarende 119 724 leser ble matchet til kjente piRNAs for normale og kreft vev, henholdsvis. Resten av sekvensene ble matchet inn i andre typer RNA, inkludert mRNA, rRNAs, sRNAs, snRNAer, snoRNAs, tRNA, gjentar og så videre (fig 2 og S2 Table). Blant annet, de gjentar i hovedsak besto av rRNA enten basert på total leser eller unike koder (S3 Table).
De unike kodene og total leser justert til det menneskelige genom sekvens datasett ble oppnådd. Den kartlagt unike koder og ren leser ble merket og klassifisert som miRNA, Pirna, rRNA, Srna, snRNA, snoRNA, tRNA, gjentar, etc. basert på sammenligning med analytiske databaser, delvis koder og leser ble ikke kommentert.
De fleste av disse rene leser var 22 nt i størrelse, konsekvent etterfulgt av 23-nt og 21-nt RNA fragmenter (S1 Fig). Videre, for å forstå fordelingen mønster av alle de unike kodene på kromosomer, detaljert plasseringen av hver tag på kromosom ble evaluert. Som et resultat av kromosomfordeling mellom kreft og normalt vev var generelt de samme. Konkret i kreft penile vev, kromosom 1 næret de fleste av de unike kodene, etterfulgt av kromosom 2, 11, 12 og 17, tilsvarende de fleste av de unike kodene befinner seg på kromosom 1, 2, 17, 12, 11 i tilstøtende normale penis vev (S2 figur).
Kjennetegn på topp rikelig kjente og nye mirnas
for å analysere de mest tallrike mirnas i penis vev, vi listet opp de 20 beste høyt uttrykte mirnas med relativt mer leser teller i synkende rekkefølge ut av 751 og 806 kjente mirnas i normale og kreft penile vev, henholdsvis som uttrykk profilen ble angitt av både den absolutte leser teller og leser telle ut av per million leser teller. I normale penis vev, la-7a-5p, la-7F-5p, la-7b-5p, la-7c-5p, MIR-140-3p, la-7g-5p, la-7e-5p, MIR-103a -3p, MIR-320a, MIR-143-3p var de beste rikelig miRNAs. Tilsvarende ble de høyt uttrykte mirnas i kreft penis vev la-7F-5p, la-7a-5p, la-7b-5p, la-7c-5p, MIR-140-3p, MIR-199B-3p, la-7g -5p, MIR-199A-3p, la-7e-5p og MIR-143-3p besatt de beste rikelig uttrykk nivåer. Fra hvilke, fant vi at de høyest uttrykte mirnas i normale og kreft penile vev var omtrent den samme (tabell 1), noe som indikerer identisk histologisk opprinnelsen til de sammenkoblede prøvene gjennomgår dyp-sekvensering.
For å identifisere potensielle nye mirnas i penis vev, de uklassifiserte kodene ble videre behandlet ved hjelp Mireap verktøyet. Bare disse kodene med leser telle mer enn 50 og strengt matchende standardparameterne ble klassifisert som kandidater av nye modne miRNAs. På grunnlag av denne analysen, hver 10 miRNA forløpere (som har potensiell stammesløyfestrukturer er vist i S3 figur) som koder for de mest tallrike forutsagte roman modne miRNA kandidater med lengder varierte 22-24 nt ble identifisert separat i de to smRNA biblioteker fra penis vev. Spesielt, ble 7 rikelig uttrykt nye mirnas overlappet mellom kreft og passet tilstøtende normale penile vev (tabell 2), noe som indikerte identisk histologiske sted kromosomale lokalisering av mirnas i begge vevene igjen. I mellomtiden, disse nye mirnas stammer fra samme forløpere har også vist heterogenitet og preferanse, ved å generere relativt mer modne produkter fra 3 «endene sammenlignet med 5» endene og blant de 10 beste nye modne mirnas i enten penis vev, 9 mirnas innledet med adenin eller uridin (tabell 2), som mønstrene var i samsvar med den forrige rapporten [17].
uttrykt forskjellig profiler av mirnas i peniskreft
Når sammenligne de forskjellige nivåer av miRNA overflod mellom normale og cancerøse vev, to mengdene er ofte av stor betydning: en er p-verdi som svarer til den t-test svar på spørsmålet om det kan oppnås en statistisk signifikant forskjell i ekspresjonsnivåene mellom de sammenkoblede grupper. Den andre er den fold-endring (FC) verdi, noe som kan illustrere det som er størrelsen av den miRNA overflod forskjellen mellom de parede prøver. Spesielt, kan selv svært store FC verdiene har ubetydelig p-verdier i henhold til t-test forårsaket av betydelige variabilities. På lignende måte kan forholdsvis liten størrelse av forskjellen også bety en liten p-verdi på grunn av de svært konsistente tekniske replikater innenfor hvert prøver. Dermed en nyttig visualisering metode kalt «vulkan tomt», som samtidig kan vise fold-endring og p-verdier på X-aksen og Y-aksen separat, er innført for å gjennomføre analysen. Vanligvis poeng ligger i øverste venstre eller øverst til høyre deler av tomten og merket med grønn farge bør trekke mer oppmerksomhet, som de hadde både små p-verdier (p 0,05) og høy FC verdier (FC≥2) . I denne sammenlignende studien ble det oversikt over vulkanen tomten generert av mirnas profiler i peniskreft og matchet normalt vev vist (S4 fig). Som et resultat av differensiell vesentlig ekspresjonsnivåer av 98 mirnas ble funnet mellom PECA og tilstøtende normal penis prøver etter justering for multiple testing. Ved å bruke ekstra filtrering med en streng cut-off på 50 leser telle i begge prøvene, identifiserte vi 56 mirnas besto av 30 (53,6%) mirnas som ble nedregulert (Tabell 3) og 26 (46,4%) som ble oppregulert (tabell 4) hos pasientene og kunne diskriminere peniskreft fra matchet normalt vev.
Blant som er de mest rikelig downregulated mirnas i kreft penile vev var MIR-320a, MIR-205-5p, speil 145-5p, MIR-423-5p og Mir-23b-3p. Av de oppregulert mirnas, MIR-107, MIR-223-3p, MIR-340-5p, MIR-424-5p og MIR-944 var de 5 mest rikelig uttrykt mirnas i penile kreft vev, blant annet, MIR-107 hadde et uttrykk nivå i Peca stiger 30.000 leser teller. I mellomtiden, MIR-107 var også den mest betydelig oppregulert miRNA som loggen
2 (Cancer /Normal Ratio) var 3,83708. Tilsvarende MIR-508-3p var den mest signifikant nedregulert miRNA som uttrykk for MIR-508-3p var selv ikke påvist i Peca.
Altered miRNA uttrykket i kreft penis vev validert ved QRT-PCR
For å validere endret miRNA uttrykket i Peca profilert av smRNA-seq, ble QRT-PCR utføres på peniskreft vev og matchet histologisk normalt vev. For det første, for å utelukke mulige individuelle forskjeller mellom prøvene utsatt for sekvensering, den 10 paret penile prøver fra pasienter ble også blandet som et basseng for validert metode. Deretter vi tilfeldig plukket fem oppregulert og 5 downregulated mirnas blant de forskjellig uttrykt mirnas å gjennomføre QRT-PCR analyse og uttrykket nivåer ble utarbeidet etter den normalis ganger endring av kreftvevet versus normalt vev. Resultatene viste at uttrykket nivåer og endret uttrykk tendensen av 10 deregulerte mirnas var ganske konsistent med resultatene fra NGS teknologi. Fra begge teknikker, MIR-509-3p viste størst fold-endring av downregulated uttrykk nivåer i kreft penile vev, og MIR-107 hadde den største fold-endring av oppregulert uttrykk nivåer i kreft penis vev, som sammen indikerte at uttrykket nivåer av miRNAs oppdaget av smRNA-seq sekvense var pålitelig (S5 fig). Videre å validere endret miRNA uttrykket mønster avslørt av NGS data i den enkelte pasient, plukket vi 4 deregulerte mirnas å gjennomføre den QRT-PCR analyse og uttrykket nivåer ble utarbeidet etter den normalis ganger endring av kreftvevet versus normalt vev i hver pasient hhv. Ifølge resultatet, fant vi at selv om befolkningsbaserte effekter og iboende forskjeller uunngåelig dukket opp som den forrige rapporten [33], tendensen til uttrykk mønstre var konsistent med NGS funn, som MIR-107 og MIR-223-3p viste oppregulert uttrykk nivåer i kreft penis vev, mens MIR-1247-5p og MIR-509-3p viste downregulated uttrykk nivåer i kreft penis vev, som igjen bekreftet de smRNA-seq sekvense data (S6 fig).
GO berikelse analyse av gener forskjellig uttrykt i kreft og normal penis vev
de essensielle biologiske funksjoner av de antatte målgener ble klassifisert via Gene ontologi system. Siden enkelte gener var knyttet til forskjellige GO vilkår, ble gensettene som viste lignende deregulerte uttrykk mønstre i flere kreftformer antas å være funksjonelt avgjørende for tumorigene prosesser [30]. For bedre å forstå de biologiske atferd av deregulerte kjente mirnas, potensielle mål gener og biologiske funksjoner målrettet av disse mirnas ble spådd ved hjelp av mikrokosmos, TargetSpy og Miranda programvare [26-29] (S1 fil). Etter justering av totalt antall gener telle kommentert av en bestemt GO term≥10, beriket ratio≥2.0 og FDR p-verdi 0,05 for å få den mest overbevisende resultat for berikelse analyse, de 10 mest beriket GO termer inkludert biologiske prosesser, mobilnettet komponenter og molekylære funksjoner ble presentert i Tabell 5. Blant som de antatte målgener av deregulerte mirnas mellom kreft og normal penis prøver syntes å være mest knyttet til de beriket cellulære komponenter besto av cytoskeletons som adherens krysset (som koblings ankere transmembrane proteiner og letter celle cytoskeletons feste), stress fiber (som består av korte actin filamenter), celle-celle-kobling (som kommuniserer knutepunkt felles forbinder tilstøtende celler). I mellomtiden, den mest beriket molekylære funksjon blant de 10 beste GO vilkårene var beta-catenin binding (som fungerer som et interaktivt atferd med beta-catenin i et selektivt og ikke-kovalent måte). Dessuten, disse antatte målgener ble tett knyttet til et bredt spekter av biologiske prosesser, inkludert vekstregulering (som i stor utstrekning modulerer organismens utvikling), celleform regulering (som fungerer som celleoverflatekonfigurasjon fartøysjefen), axonogenesis (hvilken prosess vanligvis modulerer axon sin morfogenese og form bestemmelse), cyklin-avhengig proteinkinase-aktivitet regulering (som fremgangsmåte regulerer serin /treonin-kinase-aktivitet grundig), peptidyl-serin fosforylering (som prosess medierer omdannelsen av peptidyl-serin til peptidyl-O-fosfo-L-serin) og positiv angiogenese regulering (som prosedyre letter dannelsen av blodårer).
KEGG pathway analyse av gener forskjellig uttrykt i kreft og normal penis vev
Etter GO analyse, den antatte målet gener av disse mirnas forskjellig uttrykt i kreft og normal penis prøver ble innført for å KEGG å gjennomføre en sti berikelse analyse, som til slutt viste 22 målgener som ble merket for forskjellig uttrykt mirnas og 5 KEGG trasé ble beriket. Basert på statistisk signifikant definisjon med FDR p-verdier og 0,05, ble kommenterte mest beriket pathways funnet å være tett knyttet til «dorso-ventral aksen dannelse (GRK-EGFR)» (som modulerer de viktigste effektbokser i aksen formasjon som Rho
