Abstract
TH-302 er en hypoksi-aktivert prodrug kjent for å aktivere selektivt under hypoksiske betingelser som vanligvis finnes i solide tumorer. Det blir nå vurdert i kliniske studier, inkludert to forsøk i bukspyttkjertelen Ductal adenokarsinomer (PDAC). Den aktuelle studien ble gjennomført for å evaluere bilde biomarkører for prediksjon og svar overvåking av TH-302 effekt i xenograft modeller av PDAC. Dynamisk kontrastforsterket (DCE) og diffusjon vektet (DW) magnetic resonance imaging (MRI) ble brukt til å overvåke akutte effekter på tumor blodkar og cellularity hhv. Tre humane xenografter PDAC med kjente differensial responser på Th-302 ble fotografert før, og ved 24 timer og 48 timer etter en enkelt dose av TH-302 eller kjøretøy for å bestemme om bildedannende endringer fem år foran endringer i tumorvolum. DW-MRI ble utført på fem B-verdier for å generere tilsynelatende diffusjonskoeffisient av vann (ADC) kartene. For DCE-MRI, en standard klinisk tilgjengelige kontrast reagens, Gd-DTPA, ble anvendt for å bestemme blodstrømmen inn i tumoren regionen av interesse. TH-302 indusert en dramatisk nedgang i DCE overføringskonstant (K
trans) innen 48 timer etter behandling i sensitive tumorer, Hs766t og Mia PACA-2, mens TH-302 hadde ingen virkning på perfusjon virkemåten av resistent SU .86.86 svulster. Tumor cellularity, estimert fra ADC, ble betydelig økt 24 og 48 timer etter behandling i Hs766t, men ble ikke observert i Mia Paca-2 og SU.86.86 grupper. Spesielt ble veksthemming av Hs766t observert umiddelbart (dag 3) etter behandlingsstart, men ble ikke observert i MiaPaCa-2 svulster inntil 8 dager etter behandlingsstart. Basert på disse prekliniske funn, er DCE-MRI tiltak av vaskulær perfusjon dynamikk og ADC tiltak av celletetthet foreslått som potensielle TH-302 respons biomarkører i kliniske studier
Citation. Zhang X, Wojtkowiak JW, Martinez GV, Cornnell HH, Hart CP, Baker AF, et al. (2016) MR Biomarkører for å overvåke Tidlig respons på hypoksi-Aktivert Prodrog TH-302 i kreft i bukspyttkjertelen xenografter. PLoS ONE 11 (5): e0155289. doi: 10,1371 /journal.pone.0155289
Redaktør: Roger Chammas, Universidade de São Paulo, Brasil
mottatt: 11 juni 2014; Godkjent: 27 april 2016; Publisert: May 26, 2016
Copyright: © 2016 Zhang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen, og dens saksdokumenter filer er tilgjengelige gjennom Figshare (https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.3179140)
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av: US National Institutes of Health: R01CA125627, R01CA077575 og U54CA143970; www.nih.gov; finansieringen ovenfor ble brukt i studien design, datainnsamling og analyse; Moffitt Cancer Center Lie Animal Imaging Laboratory, et CCSG finansiert kjernefasilitet, CCSG Grant Nummer: P30-CA76292; www.moffitt.org; midlene ovenfor ble anvendt for en del av små dyr avbildning. Terskel Pharmaceuticals gitt støtte i form av lønn for forfatteren CPH, men ikke har noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser.: Charles P. Hart er ansatt og en aksjonær av Threshold Pharmaceuticals. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
De fem års overlevelse for bukspyttkjertelen adenokarsinom (PDAC) er mindre enn 6% og de fleste overlevende er pasienter med en kirurgisk alternativ. [1-5] de fleste tilfeller av bukspyttkjertelkreft behandles systemisk med kjemoterapi, vanligvis gemcitabin (GEM), i kombinasjon med andre legemidler. Spesielt, har konkrete målrettede terapier og biologiske som cetuximab, trastuzamab eller bevacizumab vist liten effekt mot PDAC. En diett som kombinerer 5-Fluorouracil, folinsyre, irinotecan og oxaliplatin (FOLFIRINOX) økte median total overlevelse (OS) til 11,1 måneder, sammenlignet med 6,8 måneder for GEM alene [6] Nylig fakke-paclitaxel (ABI-007,. Nanopartikkel-albumin -paclitaxel; Abraxane) har vist betydelig overlevelse fordel i kombinasjon med GEM, og blir ansett for front-line status [7, 8] Selv da, er fremdeles respons bare flyktig og dermed er alternative terapeutiske tilnærminger nødvendig.. En lovende vei er å målrette kreft fenotype, slik som hypoksi, som ofte er observert i pankreas-kreft [9] Dette ble undersøkt i fase I /II (NCT01833546; NCT02047500). Utprøving av TH-302 i kombinasjon med GEM, som er komplett og en fase III (NCT01746979) studie av TH-302 + GEM dublett er i gang. Videre er en fase I /II opptrapping forsøksdose på TH-302 + GEM + Abraxane lett kombinasjon er nylig blitt åpnet (NCT02047500).
Tumor hypoksi, preget av redusert oksygenkonsentrasjoner, er en vesentlig faktor kjøring svulst fysiologi og motstand mot behandling av kreft. [10] den største forskjellen fra normalt vev er uregelmessig strukturert vaskulaturen matrise som finnes i faste tumorer. Mikrovaskulaturen er karakterisert ved store åpninger i endotelet og fravær av glatt muskulatur sjikt, som fører til forbedret permeabilitet og retensjon (EPR) av makromolekyler. Disse faktorene fører til en ubalansert tilførsel av oksygen og næringsstoffer. Dette forverrer spiring og ineffektiv vekst av nye skip, noe som fører til en redusert tumor-oksygenering. [11, 12] Selv om flere kreftformer er kjent for å være hypoksisk, bukspyttkjertel kreft er kjent for å være dypt så [13] og intratumoral hypoksi er relatert til et dårlig resultat. [14-16] Dette kan være på grunn av den økte nivåer av overlevelsesfaktor, HIF-1α [15-18], eller utvalg for defekter i apoptotiske maskineriet. [17] Videre, effekten av hypoksi kan ikke være formidlet utelukkende av kreftcellene, men kan også innebære stroma. Kreft i bukspyttkjertelen er preget av overdreven desmoplastic fibroblaster (stel celler), som migrasjon, type I kollagen uttrykk, og vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) produksjon er alle indusert av hypoksi. [18] I utgangspunktet hypoksi resultater fra en ubalanse mellom oksygentilførsel og kreve. Hypoksiske tumor regionene er generelt motstandsdyktig mot cytotoksisk kjemoterapi. Dette er delvis på grunn av de direkte effektene av hypoksi i oppregulering celle overlevelse veier, men kan også skyldes regionale perfusjon underskudd, noe som resulterer i både hypoksi og sub-terapeutisk legemiddellevering. [14-16, 19, 20] Videre hypoksiske tumorceller har en tendens til å være stillestående, som også fører til resistens overfor terapi som er rettet til celledeling. [21] På grunn av forholdet mellom hypoksi og dårlig respons, en løsning for hypoksi -relaterte kreft introduserer hypoksi-aktivert prodrugs (HAP), som selektivt aktiveres under ekstrem hypoksi og leverer høydose cellegift inn i hypoksiske områder av svulsten med minimal skade på friskt vev.
overvekt av hypoksi i PDAC gjør det til et attraktivt mål for HAPs [22], som har blitt utviklet som en familie av forbindelser i løpet av de siste to tiårene. [23] HAPs omdannes til en aktiv form i reduserte oksygenforhold, slik de er utformet for å gjennomgå en -e
– eller 2-e
– bio-reduksjoner som er reversibel i nærvær av oksygen. Disse kan være ikke-spesifikt katalysert av en rekke oxoreductases, slik som NADPH cytokrom P450 reduktase, POR, eller induserbar nitrogenoksidsyntase, iNOS. [24] Den mest vanlige klasse av HAP er basert på 2-nitroimidazoler, eksemplifisert ved TH- 302. TH-302 er en andre generasjons HAP som testes nå i 12 ulike kliniske studier fra fase I-fase III. TH-302 frigjør brom-isophosphoramide sennep (Br-IPM) under hypoksiske betingelser, å indusere DNA-alkylering og tverrbinding. Br-IPM kan også diffundere inn i nærheten av oksygen regioner for å hindre tumorprogresjon via «Tilskuereffekten». Både in vitro og in vivo eksperimenter har vist at TH-302 blir selektivt aktivert i tumor hypoksiske regioner, og er også tilstede i det omkringliggende vev, men i mindre grad i friskt vev [25]. Pre-kliniske studier tyder på at TH-302 har betydelig anti-kreft effekt når det kombineres med anti-angiogene terapier. [26]
hypoksiske områder er ofte preget av svært uorganisert, utvidede og kronglete fartøyer. [27] Dette kaotisk mønster kan resultere fra ubalanser av angiogene mediatorer så som vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og angiopoietins. Høypermeable tumorkarene kan påvirke cytokiner og angiogene faktorer, som kan dynamisk å endre strukturen av microvessel veggene. [28] Akkumulerende bevis har allerede vist at vaskulær permeabilitet er sannsynligvis forhøyet i hypoksiske områder. [27] Således bevis og empirisk overensstemmelse mellom fartøy permeabilitet og hypoksi er etablert. DCE-MRI bruker kinetisk modellering av injisert kontrast reagenser for å karakter perfusjon. [29] Det kan gi informasjon om flyten, volum, og viktigst permeabilitet av fartøy. Dermed er det egnet til å anta at DCE-MRI kan være et nyttig surrogat biomarkør for hypoksi. [30]
Diffusion-vektet MRI (DW-MRI) registrerer relativt små endringer i vevet struktur på cellenivå basert på anvendelsen av bevegelsesfølsomme gradienter som kan spore bevegelsen av vannprotoner. Mange prekliniske studier har vist at DW-MR har et enormt potensial for å overvåke tidlige endringer i tumor cellularity som kan relateres til behandlingsrespons. [31] Kombinasjon av DCE og DW-MR kan gi mer nøyaktig informasjon for tidlig diagnose og påvisning av tidlig terapeutisk respons . [32] Videre disse to avbildningsmetoder er lett utplassert i daglig klinikk protokoller. Som sådan, er det svært sannsynlig at resultatene av denne studien kan lett oversettes til flere klinikk prøvelser.
Tidligere studier har vist xenografttumorer avledet fra SU.86.86 human bukspyttkjertelkreft cellelinje er meget vaskularisert og godt perfusert sammenlignet med tumorer avledet fra Hs766t cellelinje. [33] Således hypoksiske områder observert i Hs766t tumorer er større enn de som ble observert i SU.86.86, mens tumorer avledet fra Mia PACA-2-cellelinjen er hypoksisk til et middels nivå. Som hypoksi er ansett å være en begrensende faktor for TH-302-aktivitet, er det blitt eksperimentelt vist at Hs766t-avledede tumorer er svært følsomme for TH-302, og at SU.86.86-avledede tumorer er svært motstandsdyktig, med Mia PACA-2 utstillings . middels følsomhet [34] denne studien sammenlignet effekten av TH-302 i disse bukspyttkjertelcancer xenograft modeller med målinger av tumorblodgjennomstrømning og cellularity ved hjelp av to avbildningsmetoder:. DW-MR og DCE-MRI
Material og metoder
Cell kultur
Su.86.86, Hs766t og Mia-PaCa2 celler ble kjøpt fra ATCC (Manassas, Virginia). Alle cellelinjer ble gjenopplivet fra lav passasje med alle forsøk utført med celler fra passasje nummer mindre enn 15. Su.86.86-celler ble dyrket i RPMI-1640 (Life Technologies) supplert med 10% FBS (HyClone Laboratories). Hs766t og Mia-PaCa2 cellelinjer ble dyrket i DMEM /F12 (Life Technologies) supplert med 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin løsning (Sigma, St. Louis, MO). Alle cellelinjer ble dyrket ved 37 ° C og 5% CO
2.
xenografter
Alle prosedyrer var i samsvar med Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr Resources (1996 ), National Research Council, og godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité, University of South Florida under godkjente protokollen R4033. Immunsupprimerte mus ble plassert i et rent anlegg med spesielle forhold som inkluderer HEPA filtrert ventilerte merder, autoklaveres sengetøy, autoklaveres boliger, autoklaveres vann, bestrålt mat og spesielle bur endre prosedyrer. Mus ble håndtert under aseptiske forhold, inkludert bruk av hansker, kjoler og sko gulvbelegg. Mus ble ofret ved innånding av CO
2 fra en trykktank i en mus kammer.
Kvinne SCID-mus alder 5-6 uker ble inokulert med SU.86.86, Hs766t eller Mia-PaCa2 celler (5×10
6) subkutant på venstre bakbein. Tumorene fikk vokse i et gjennomsnitt på tre uker til en gjennomsnittlig størrelse på ~ 150 mm
3, som beregnes ved hjelp av elektroniske calipers og tumorvolumer beregnes som π /6 [(korte aksen i mm)
2 x ( lange akse i mm)]. Mus ble deretter randomisert og plassert i kullene og behandlet med saltløsning (kontroll) eller TH-302 (50 mg /kg) injisert intraperitonealt. Mus ble avbildet som beskrevet i det magnetiske resonansavbildningsmetoder delen. Totalt 34 mus gjennomgikk MR imaging studier. Den SU.86.86 gruppe besto av fem TH-302 behandlede og 5 kontrolldyrene; Mia-PaCa2 besto av 6 TH-302 behandlede og fem kontrolldyrene; Hs766t besto av syv TH-302 behandlede og 6 kontrolldyrene. Ingen signifikant dyr vekttap ble observert i løpet av studien. Dyrene ble avlivet når tumorer nådde 2000 mm
3.
Imaging
Både DCE-MRI og DW-MR ble utført 24 timer før (302 TH-eller kjøretøy) behandling, DW-MRI ble planlagt for 24 timer og 48 timer etter behandling. For å sikre tilstrekkelig tid for kontrastmidlet utvasking og fysiologisk gjenvinning, ble DCE-MRI bare utført 48 timer etter behandling. Alle MRI-eksperimenter ble utført med en Varian 7 T MR-skanner utstyrt med en maksimal gradient amplitude på 400 mT /m. Alle dyr ble bedøvet ved inhalert isofluran (1,5% i O2) ved 2,0 LPM og kanylert ved halevenen. En Trykkgiver ballong tapet til dyrets bryst ble brukt til å kontinuerlig overvåke pusterytme. De kroppstemperatur ble kontinuerlig overvåket ved hjelp av en rektal fluoroptic termometer (Sall
®, SA Instruments, Stony Brook, New York). En ekstern varmeanordning ble anvendt for å opprettholde kroppstemperatur ved 37,0 ± 0,2 ° C og lufthastigheten ble overvåket i et område på 60-90 åndedrag pre minutt i løpet av imaging eksperimenter. Dyret ble forsiktig festet i en plastholder og lastes inn i en 35 mm ID small-animal avbildning Litz pole (Doty Scientific, Columbia, SC, USA). MR sesjon for både DCE- og DW-MR-undersøkelse var omtrentlige 1,5 timer; 0,5 timer for DW-MR bare delen.
DCE-MRI-protokollen omfatter T
2-vektede bilder for anatomisk visning av svulst, parametrisk kart endogen T
en tid for avslapping og en rekke T
1 vektet bilder som spor dynamisk endring av kontrastmiddel inkludert AIF og vaske-og utsjekking innen svulst nettstedet. T
2-vektede bilder ble anskaffet ved hjelp av en rask spin ekko (FSE) pulssekvens med et ekko faktor på 4, noe som gir en effektiv TE på 72 ms. Metningsutvinningsmetode for T
en kartlegging med fem forskjellige utvinning tid (TR) verdier ble ervervet før injeksjon av kontrastmiddel (TR = 5000, 2000, 800, 300, 150 ms, TE = 7,2 ms, FOV = 35 x 70 mm, matrix = 128 x 256, romlig oppløsning = 273 x 273 mm). Ni 1 mm tykke koronale skiver ble orientert over svulsten og arterien for å sikre en gyldig arteriell inngangsfunksjon (AIF). Dyret ble godt sikret med tape for å unngå bevegelsesartefakter. Før, under og etter bolus administrasjon av en enkelt dose av CA (0,15 mmol /kg Gd-DTPA), en dynamisk serie av spin ekko T
1-vektede bilder (TR = 150 ms, TE = 7,2 ms) ble anskaffet for 35minutes. DCE-MRI data ble behandlet av en generell kinetisk modell som beskrevet av Tofts et al. En fullstendig beskrivelse av disse fremgangsmåter er blitt beskrevet tidligere. [29, 35]
DW-MRI ble utført for å måle de kvantitative ADC-verdier med samme geometri som DCE-MRI. Sekvensparametre inkluderer fem b-verdier: 12, 50, 500, 800, 1500, s /mm
2 med TR = 1500 ms og TE = 35; Seks gjennomsnitt ble anvendt for å redusere bevegelsesartifakter. ADC kartene ble generert av en hjemmelaget Matlab program som passer b-verdier til Stejskal-Tanner ligningen, S = S
0 * EXP (-b * ADC), hvor S
0 er signal amplitude uten diffusjon vekting og S er signal amplitude med diffusjon vekting.
Regions av interesse (Rois) ble bestemt ved T
2w bilder med nøyaktig samme geometri DCE- og DW-MR oppkjøpet. Disse ROIs ble lagt over DCE- og DW-MR data for å minimere variant av menneskeskapt faktor. Distribusjons histogrammer ble oppnådd for hver svulst ROIs av DCE- eller DW-MR. Data er presentert som gjennomsnittet og standardfeilen. Student t tester, ANOVA ble brukt der det er hensiktsmessig. P 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Immunohistochemistry
Etter gjennomføring av terapeutiske og MRI bildebehandling protokoller, pimonidazole hydroklorid. (60 mg /kg; Hypoxyprobe Inc.) ble injisert I.P. en time forut for fjerning av svulster, deretter fiksert i 10% formalin, parafin innleiret, og viderebehandles for immunhistokjemi. Tumor tverrsnitt ble farget med en kanin primært antistoff mot gamma-H2AX (Novus Biologicals, Littleton, CO) og Ventana OmniMap anti-kanin sekundært antistoff (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). Pimonidazole positiv vev ble oppdaget ved hjelp av kaninantiserum mot pimonidazole hydroklorid (2627; Hypoxyprobe Inc.). Deteksjonssystemet som ble brukt var Ventana ChromoMap Kit. Lysbilder ble kontra med hematoksylin eosin og skannet med Aperio ScanScope XT.
Resultater
De kinetiske parametere av DCE-MRI for å kvantifisere svulst perfusjon var estimert til en piksel-messig basis ved å påføre Tofts modell som beskrevet i [ ,,,0],35]. Representative K
trans-kart for hver tumortype er vist i figur 1. Tumor ROIs (regioner av interesse) ble identifisert med T
2-vektede bilder på alle skiver, og som brukes til å avgrense piksler for histogrammet analyser. Som vist av histogrammer, K
trans generert fra representative Hs766t og Mia-Paca-2 svulster var dramatisk redusert 48 timer etter TH-302 behandling, sammenlignet med verdier før behandling. Det var ingen signifikante endringer observert for en SU.86.86 svulster på samme tidspunkt (fig 1). Selv om en person i SU.86.86 gruppen hadde en betydelig nedgang etter TH-302 behandling (48 h), var de gjennomsnittlige endringene mellom sammenligningsgruppene var ikke statistisk signifikant. Time-kurs av normalisert gjennomsnitts K
trans verdier er vist i figur 2 (a). Middelverdiene for normaliserte K
trans redusert 69,2% for TH-302-behandlede mus i Hs766t tumorer, redusert 46,1% for Mia PACA-2 tumorer og økte 4,9% i SU.86.86 tumorer. Begge endringene for Hs766t og Mia Paca-2 behandlingsgruppene var statistisk signifikant (
P
0,01) sammenlignet med sin egen kontrollgruppe. I motsetning til dette, den midlere verdi for økningen SU.86.86 gruppe var ikke statistisk signifikant (
P
= 0,15). Disse endringene i vaskulær perfusjon korrelerte med hverandre cellelinjer terapeutisk respons til TH-302 [36].
Som vist i histogrammet, K
trans generert fra HS766t og Mia-Paca-2 svulster ble dramatisk redusert 48 timer etter TH-302 behandling sammenlignet med verdier før behandling. Det var ingen signifikante endringer observert for en SU.86.86 mus på samme tidspunkt.
A) Time-kurs av normalisert gjennomsnitts K
trans verdier. Middelverdiene for normaliserte K
trans redusert 69% for TH-302 behandlede mus i Hs766t tumorer, redusert 46% for Mia PACA-2 tumorer og økt med 5% SU.86.86 tumorer. B) Endringer i normaliserte gjennomsnitts svulst ADC verdier over tid. En betydelig økning i forhold gjennomsnittlig ADC ble observert for TH-302 behandlede gruppe ved post- 24 og 48 timer (29% økende til 24 t, p 0,01; 17% økende til 48 t, p 0,01). MIA PACA-2 er ikke statistisk signifikant forskjellig mellom utført grupper (8% økning for 24 timer,
P
0,05; 4% økning for 48t, p 0,05). For SU.86.86, ble ingen signifikant endring oppdaget av DW-MR for både TH-302 og kontrollgruppen (3% avtagende for 24 timer, p 0,05; 0,5% økning for 48t, p 0,05). Normaliserings ble beregnet ved den gjennomsnittlige av differansen av pre- og post-behandling i Th302 gruppen sammenlignet med gjennomsnitt av differansen av pre- og post-behandling i kontrollgruppen. Feil stolpene står for standardavvik.
DW-MRI ble anvendt for å kvantifisere cellularitet, og ble også brukt til å påvise responsen av alle tre tumorxenografter til Th-302. Seks gjennomsnitt av DW-oppkjøp ble brukt i denne studien for å redusere potensialet for bevegelsesartefakter. ADC-kart fra representative dyr ved forskjellige tidspunkter av pre- og post-behandling er vist i figur 3. Som med DCE-data, ble T2 bilder anvendes for å avgrense tumor ROI, og avgrensede piksler deretter brukt til å generere histogrammer. Endringer i normaliserte midlere tumor ADC-verdier over tid er presentert i figur 2 (b). En betydelig økning i forhold gjennomsnittlig ADC ble observert for de TH-302 behandlede Hs766t tumorer ved 24 timer og 48 timer etter behandling (29% økning i 24 timer, s 0,01; 17% økning i 48 t, p 0,01). For SU.86.86 ble ingen signifikante endringer oppdages av DW-MR for både TH-302 og kontrollgrupper (3% nedgang for 24 timer, p 0,05; 0,5% økning for 48t, p 0,05). Selv om det viste seg at det var en økning i ADC av MiaPaCa-2 på 24 timer i forhold til kjøretøyet gruppen (8%, P 0,05), disse endringene var ikke statistisk signifikant forskjellig fra kjøretøykontroller
En dramatisk. økt ADCs observert i HS766T, men ikke i de to andre krefttyper.
statistisk signifikante endringer i K
trans ble observert i Hs766t og Mia Paca-22 svulster behandlet med TH-302 for 48 timer etter behandling som bestemt ved DCE-MRI. K
trans uendret i SU.86.86 svulster (fig 1). Den aktive effektor av TH-302 er et DNA-tverrbindingsmiddel som tidligere vist å øke atom γ-H2AX, en nøkkel biomarkør for DNA-skade reaksjonsveier, in vivo etter så lite som 6 timer etter TH-302 behandling i pankreatiske tumormodeller [ ,,,0],37], noe som tyder på tidlige forandringer i vaskulær permeabilitet observert i denne studien, kan være en konsekvens av TH-302 cytotoksisitet. Å trekke en sammenheng mellom permeabilitet endringer og TH-302 aktivitet, tumor tverrsnitt fra alle tre kreftgrupper ble immunhistokjemisk evaluert for γ H2AX uttrykk (Fig 4A). Nuclear γ -H2AX ble økt i TH-302 behandlede Hs766t og Mia Paca-2 svulster sammenlignet med saltvann kontroll. Ingen påviselig endring i γ-H2AX farging ble observert mellom Su.86.86-behandlet og behandlet med saltløsning svulster. Den viktigste determinant av TH-302 aktivering og effekt er svulsten hypoksi. Immunhistokjemisk påvisning av Pimonidazole, en markør for fysisk hypoksi, viste større flekker i TH-302 sensitive Hs776t og Mia Paca-2 svulster i forhold til TH-302 resistente SU.86.86 tumorer (figur 4b) som støtter γ-H2AX uttrykk mønstre etter TH-302 behandling. Disse dataene støtter tidlige endringer i Hs766t og Mia Paca-to svulst perfusjon på 48 timer kan muligens skyldes den cytotoksiske effekten av TH-302.
(A) Histologisk farging av γ-H2AX, en markør for DNA skade responsmekanismer, i PDAC tumorer pre- og 48 timers post-TH-302-behandling (50 mg /kg). Uttrykk for γ -H2AX ble økt i TH-302 behandlede Hs766t og Mia Paca-2 svulster sammenlignet med saltvann kontroll. Ingen påviselig endring i γ-H2AX farging ble observert mellom Su.86.86 behandlet og saltvann svulster. (B) Pimonidazole flekker som biomarkør for fysisk svulst hypoksi. Pimonidazole hydroklorid ble injisert 2t før fjerning av svulster. Omfanget av hypoksi var størst i Hs766t svulster og minst i SU.86.86 med Mia Paca-2 svulster moderat hypoksisk. Disse bildene er representative bilder av hver svulst type. Skala barer = 200 uM.
diskusjon
Effekten av TH-302 er påvirket av flere faktorer, slik som kar åpenhet og nivået av hypoksi i et gitt område. [38] Etter å ha muligheten til å måle endringer i disse parametrene over tid som svar på aktivert TH-302, er kritisk. Slike endringer kan brukes til å evaluere terapeutisk respons. Kortsiktig ikke-avbildning eller invasive metoder er begrenset for in vitro bruk, mens tenkelig biomarkører kan gi kvantitative målinger av tumorprogresjon eller regresjon, uten vesentlig å endre mikromiljøet. De to MR modaliteter brukt i denne studien, DCE-MRI og DW-MR, kan både separat tilfredsstille disse kravene basert på observerparakart, som gir informasjon om blodkar og cellularity hhv. Videre er de fleste svulster kjent for å være heterogene, og spesielt så i bukspyttkjertelkreft. Det er derfor av stor interesse som romlig informasjon kan kvantitativt vurdert på en piksel-for-piksel basis. [39] Tumor hypoksi er den sterkeste prediktor for tumor respons på HAP og kan måles hos pasienter som bruker PET avbildning av 18F-merket 2 nitroimidazol sporstoff (F-miso, FAZA, HX4). Men PET hypoksi bildebehandling fortsatt eksperimentell. I kontrast, kan MR tiltak av perfusjons-diffusjon mismatch bli kvantitativt relatert til hypoksi. [24]
Denne studien var fokusert på å identifisere og sammenligne MR biomarkører for å oppdage tidlig respons på TH-302 behandling hos følsomme og resistente PDAC tumormodeller. Før arbeid fra vår gruppe hadde vist at MiaPaCa-2 tumorer reagerte til TH-302 med en svak, men signifikant, reduksjon i K
trans, med ingen virkning på ADC [30]. Disse resultatene ble bekreftet her. Resultater fra DCE-MRI viste en klar nedgang på K
trans både Hs766t og Mia Paca-2 modeller, som er betydelig mer hypoksisk, sammenlignet med SU.86.86 svulster, som ikke reagerer på TH-302 med en endring i volum eller en forandring i K
trans. I samsvar med tidligere arbeid, ble Hs766t bekreftet av pimonidazole immunhistokjemi (fig 4) å ha den største hypoksisk brøkdel blant disse tre modeller; Mia PACA-2 var et mellomliggende hypoksiske og SU.86.86 har minimal hypoksi i forhold til de to andre. [40] Så reduksjon av permeabiliteten kan være konsekvensen av TH-302-aktivering under de lave oksygenbetingelser som resulterer i inhibering av VEGF-signalisering. Dette er det motsatte sett i ikke-hypoksiske tumorvevet. Graden av endringer i gjennomstrømningen kan direkte relateres til graden av hypoksisk region. Dette resultatet bekrefter tidligere resultater som indikerer at TH-302 er mest effektive i hypoksiske svulster [36]
De to MR metoder som brukes i denne studien er fundamentalt annerledes. Kinetiske parametere evaluert fra DCE-MRI evaluere blodkar endringer, mens ADC verdier utstyrt med DW-MR reflektere endringer celletetthet. DCE-MRI reflekterer permeabilitet (eller flow) endringer som kan resultere fra cytotoksiske effekter på hypoksiske tumorceller og redusert VEGF produksjon ved aktivering av TH-302, mens DW-MR er en indirekte måling av mobiltelefon konsekvenser som antagelig oppstår følgende vaskulaturen endringen. [30] Interessant, observerte vi at ADC endringen var signifikant bare i de mest følsomme Hs766t tumorer, men ikke i de to andre modeller. Mangelen på endringen i ADC i SU.86.86 er i samsvar med mangelen på effekten av TH-302 på tumorvekst, og den relative mangelen på hypoksi i denne modellen. Interessant, Mia PACA-2 også ikke viste en diffusjon respons på Th-302, til tross for det faktum at tumorveksten ble hemmet. Dette var i overensstemmelse med tidligere observasjoner ved hjelp av denne tumorlinjen. [30] Spesielt, effekten av TH-302 terapi på MiaPaCa-2 tumorvekst var ikke før dag 8 for behandling, mens effekten på Hs766t var umiddelbar. Derfor kan endringen i ADC kunne forløpere svulst volumendringer som oppstår en dag eller to senere, men ikke endrer 6 dager senere.
Valg av en arteriell inngangsfunksjon (AIF) påvirker direkte de kinetiske parametere generert av Tofts modell. Faktorer for AIF estimering kan indusere feil inkludert partielle volumeffekter, lav timelige og romlig oppløsning, lav kontrast til støyforhold (CNR) og i mange DCE-MRI tilfeller et dårlig valg av store arterier i synsfeltet og bevegelsesartefakter. I denne studien ble direkte måling av arterielt blod ble en utfordring, gitt den respiratoriske bevegelse under MR kjøpet. Selv om bevegelsesartefakter og lav SNR kan reduseres ved å bruke en tidsmessig spline-fit funksjon og en romlig Gaussian kernel å glatte dataene på pikselmessig analyser, spiller valget av AIF ROI en stor rolle for de endelige resultatene, som omtalt i [ ,,,0],35]. Dette har vært den mest vanlig problem som rammer reproduserbarhet av DCE-MRI, og dermed stor feil bar observert i DCE-MRI resultater. Til tross for disse begrensninger, DCE-MRI var i stand til å skjelne forskjeller i TH-302 respons, blant de tre tumortyper, på en måte som var konsistent med histologiske funn.
tumorvaskulatur er stadig skiftende delvis som reaksjon på høyt tumor-VEGF-konsentrasjonen forårsaker avvikende neo-vaskularisering [41] og fast-fase spenning som resulterer i kompresjon av skjøre blodkar [42], som begge bidrar til redusert blodtilførsel. I denne studien, målte vi tidlige forandringer i tumor perfusjon følgende TH-302 behandling. For å eliminere muligheten for at endringer i tumor perfusjon følgende TH-302 er et resultat av den normale dynamiske natur tumor vaskulatur, ble tumor tverrsnitt histologisk farget for atom γ -H2AX, et protein som er involvert i DNA-skade Response trasé [43], et måling av TH-302 cytotoksisitet. Som forventet, TH-302 sensitive svulster, Hs766t og Mia Paca-2, presentert med økt atom γ -H2AX sammenlignet med kontroll svulster. Ingen vesentlig endring i tumor perfusjon eller atom γ -H2AX ble observert i SU.86.86 svulster, TH-302 resistente. Disse data understøtter endringer i tumor perfusjon målt ved DCE-MRI kan anvendes som et tidlig respons biomarkør for TH-302 behandling.
Som konklusjon, våre studier indikerer at endringer i tumor perfusjon målt ved DCE-MRI kan ha potensial som en tidlig biomarkør for TH-302 farmakodynamikk og at DW MR er en potensiell biomarkør for eventuell svulst volum respons.
