Abstract
Medlemmer av den tidlige vekstrespons (EGR) familie av transkripsjonsfaktorer spiller forskjellige funksjoner som respons på mange cellulære stimuli, inkludert vekst, stress og inflammasjon. Egr3 har gått relativt unstudied, men her gjennom bruk av spesifikasjonene (strategiske partnere for bedømmelse av Predictive Signaturer av prostatakreft) Affymetrix hele genomet genuttrykk database vi rapportere at Egr3 mRNA er betydelig over uttrykt i prostatakreft sammenlignet med normal prostata vev (5 ganger). The Human Protein Atlas (https://www.proteinatlas.org), en database med microarray merket med antistoffer mot over 11 000 humane proteiner, ble brukt til å kvantifisere Egr3 protein uttrykk i normale prostata og prostata kreftpasienter. Etter avtale med SPECS data, fant vi at Egr3 protein er betydelig økt i prostatakreft. Spesifikasjonene database har fordelen av omfattende klinisk oppfølging for pasienter med prostatakreft. Analyse av Egr3 mRNA-ekspresjon i forhold til tilbakefall status viser at Egr3 mRNA-ekspresjon økes i tumorceller av ikke-tilbakevendende prøver (n = 63) sammenlignet med normale prostataceller, men er betydelig lavere i tilbakefall prøver (n = 38) sammenlignet til ikke-tilbakefall. Observasjonene ble bekreftet ved en uavhengig datasett. En liste av gener som korrelerer med denne unike uttrykk mønsteret ble bestemt. Disse Egr3-korrelerte gener ble beriket med Egr bindingsseter i sine arrangører. Genet Listen inneholder inflammatoriske gener så som IL-6, IL-8, IL1β og COX-2, som har omfattende forbindelser til prostatakreft
relasjon:. Pio R, Jia Z, Baron VT, Mercola D, UCI NCI SPECS konsortium av strategiske partnere for bedømmelse av kreft signaturer, prostatakreft (2013) Tidlig Vekst Response 3 (Egr3) er svært over-Uttrykt i Non-Relapserende prostatakreft, men ikke ved relapsing prostatakreft. PLoS ONE 8 (1): e54096. doi: 10,1371 /journal.pone.0054096
Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 13 desember 2011; Godkjent: 10 desember 2012; Publisert: 14 januar 2013
Copyright: © 2013 Pio et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av USPHS gir U01 CA1148102 (NIH /NCI SPECS konsortium) og U01 CA152738 (NIH /NCI EDRN), og ved University of California i Irvine fakultet Career Development Award (Dr. Z. Jia). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. D. Mercola er en aksjonær i Proveri Inc. i San Diego, et bioteknologisk start -up selskap som utvikler prostatakreft relaterte tester. Dr. Baron er en konsulent for PellFiCure Pharmaceuticals, Inc., en start-up selskap som utvikler en kombinasjonsbehandling for prostatakreft. Det er ingen markedsført produkter å erklære. En patentsøknad er: Michael McClelland, Yipeng Wang, Daniel Mercola: Materialer og metoder for å bestemme diagnose og prognose av prostatakreft. September 2011: US 20110236903. Proveri utvikler et multipleks immunhistokjemi prostatakreft diagnose test basert på materialet i påvente av patent. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. Alle de menneskelige vev array-data sitert i dette manuskriptet er tilgjengelig for allmennheten som det refereres til i teksten.
Innledning
Den tidlige vekstrespons (EGR) transkripsjonsfaktorer har lenge vært innblandet i flere cellulære prosesser som er viktige for kreft, inkludert apoptose, differensiering, proliferasjon, veksthemming, og inflammasjon [1] – [5]. EGR transkripsjonsfaktorer induseres hurtig og forbigående i respons til forskjellige stimuli slik som vekstfaktorer, cytokiner, forbolestere (TPA) og ioniserende stråling, og regulere et variert utvalg av gener som respons på disse stimuli [1], [6] – [ ,,,0],8]. EGR familien består av Egr1, Egr2, Egr3, og Egr4 [9] og alle familiemedlemmer bindes til det samme EGR respons DNA-element (ERE), GCGG /TGGGCG, gjennom tre konserverte sink finger DNA-bindende områder [10].
Egr1 er best studerte medlem av transkripsjonsfaktor familien. Tallrike studier har detaljert dets tumorsuppressorgener funksjoner og dermed dens ned-regulering i bryst, lunge, og glial-kreft [11] – [13]. Interessant nok Egr1 har vist seg å virke som et onkogen i prostata kreft. Flere etterforskere har rapportert over-uttrykk for Egr1 mRNA og protein i prostata kreft [14] – [15]. De tramp og CR2-T-Ag musemodeller av prostata cancer ble anvendt for ytterligere å undersøke den funksjonelle rolle av Egr1 i initiering og progresjon av sykdommen. Egr1-null mus som ble crossbred med enten kreft modellen viste en forsinket progresjon fra prostata intraepitelial neoplasi (PIN) til invasiv kreft [16].
Til tross for godt karakteriserte funksjonene Egr1, er langt mindre kjent om andre transkripsjon faktorer i EGR familie som Egr3. Flere studier detalj funksjonen av Egr3 i neural utvikling, spesielt utviklingen muskel spindel, sympatisk nervecellen differensiering, og responsen mot miljøbetinget spennings (lyd, håndtering, og nye situasjoner) [17] – [20]. Egr3-mangelfull mus vise sympatisk dysautonomia og alvorlige sanse ataksi [17], [20], mens Egr1-mangelfull mus utviser ingen åpenbar atferds eller utviklings problem [21]. Egr3 knockout mus har ennå ikke blitt benyttet for å studere rollen til transkripsjonsfaktoren i kreft, men nylige rapporter har brukt cellekulturmodeller og genuttrykk data for å studere Egr3 funksjon på flere områder viktig for kreft. Således Egr3 blir oppregulert etter vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) i humane umbilikalvene endotelceller (HUVECS) [22], [23], og knockdown av Egr3 i disse celler resulterer i en reduksjon av VEGF-indusert proliferasjon, migrering og tubulogenesis [23]. I tillegg til sin rolle i angiogenese, har flere rapporter undersøkt rollen til Egr3 i brystkreft, der det ble funnet å være en østrogen-responsive gen hvis immunreaktivitet er positivt forbundet med østrogenreseptoren α (ERα) status, lymfeknute status, og fjernmetastaser [24], [25].
Mye arbeid gjenstår, men på rakne rolle Egr3 i andre typer kreft. Basert på vår kunnskap om Egr1 og felles DNA-bindende egenskaper ved alle EGR transkripsjonsfaktorer, hypotese vi at Egr3 gjør faktisk spille en rolle i enten dannelsen eller utviklingen av prostatakreft. Her rapporterer vi over-uttrykk for Egr3 mRNA og protein i prostatakreft sammenlignet med normal prostata vev. I tillegg til å studere den over-uttrykk for Egr3, vi brukte også de omfattende prostata genuttrykk datasett fra University of California-Irvine SPECS program for å undersøke uttrykk mønster av Egr3 i prostatakreftpasienter med kjent tilbakefall status, og funnet ut at Egr3 uttrykk i tumorceller er lavere i tumorer som tilbakefall sammenlignet med tumorer som ikke tilbakefall. Dette uttrykket mønster: lav Egr3 mRNA i normal prostata versus høy ekspresjon i kreft, og skillet mellom tilbakefall og ikke-tilbakefall, ble bekreftet med uavhengig prostatakreft genekspresjon datasettet fra University of Pittsburg [26] – [28]
Ved hjelp av human protein Atlas, vi også detalj en unik in-silico metode for å undersøke over uttrykk for Egr3 protein i prostatakreft. De kombinerte resultatene indikerer at Egr3 er en biomarkør for dårlig resultat prostatakreft. Videre en kohort av høyt korrelerte gener har en lignende uttrykk mønster, og medlemmene av denne gruppen er kandidat Egr3-regulert gener.
Materialer og Metoder
Prostata vevsprøver
Prostata prøvene ble kjøpt opp av informert samtykke i henhold til University of California, Irvine Institutional Review Board (IRB) -godkjent og HIPAA-kompatible protokoller. Tissue Oppkjøpet var en del av NCI-SPECS program ved University of California, Irvine. Prostata kreft vev ble samlet ved prostatektomi, anmeldt av en patolog, og snap-frosset i flytende nitrogen. Tissue sporing ark ble opprettholdt for å registrere medgått tid fra operasjon til frysing (gjennomsnittlig 2,8 timer). Normal prostata prøvene var enten hurtigfrosset i flytende nitrogen fra ferske biopsi kjerner eller snap-frosset etter samling fra den raske obduksjon programmet på Sun Health Research Institute (Sun City, AZ), en SPECS konsortium medlem. Dataene består av 19 normale prostataprøver fra 13 individer (12 fra normal biopsi og 7 fra rask obduksjon) og 108 prostatakreftprøver fra 84 individer (Tabell 1). Resultatparametre og relevante kliniske data inkludert en omfattende historie ble akkumulert over en 11 års periode og vedlikeholdes i SPECS relasjonelle data base med data ordbok på over 250 elementer. Utfallet parameter «tilbakefall» refererer til biokjemisk tilbakefall, økningen i PSA-nivåer over 0,2 ng /ml etter en tidligere post-op PSA som var under terskelen for testen. Non-tilbakefall betyr at ingen biokjemisk tilbakefall ble observert i pasienten under klinisk oppfølging tidsramme. Merk at alle tumorprøver ble oppsamlet på tidspunktet for prostatektomi, så tilbakefall status ble bestemt etter at prøvene var allerede oppsamlet. Relevante kliniske og demografiske verdier er oppsummert i tabell 1.
Affymetrix Gene Expression Arrays og statistisk analyse
RNA fra prostata vevsprøver ble analysert ved hjelp av Affymetrix genuttrykk arrays. RNA ble fremstilt fra friskt frosset vev ved seksjonering vevsblokker med en cryostat og rensing av total RNA direkte fra de akkumulerte frosne snitt. Renset RNA ble hybridisert til enten Affymetrix U133 Plus2.0 eller U133A genekspresjon matriser og arrays ble behandlet i henhold til Affymetrix protokollen. Intensiteten data som brukes her er tilgjengelig fra offentlige kilder (GEO GSE17951 og Geo GSE8218, henholdsvis).
Normalisert Affymetrix intensitetsverdier ble brukt for å sammenligne Egr3 (Affymetrix sonde ID 206115_at) uttrykk i hele prøver av normal prostata og prostata kreftvev. Normaliserte verdier for de to prøvetypene ble sammenlignet ved bruk av en student t-test. LIMMA (lineære modeller for mikroarray data) analyse fra Bioconductor ble implementert i R miljøet å oppdage differensielt uttrykte gener [29].
For å analysere celletype spesifisitet uttrykk for Egr3 og samkjøre gener, brukte vi en multippel lineær regresjon (MLR) modell for å beskrive forholdet mellom den observerte Affymetrix genekspresjon nivå og celletype preparat for fire celletyper i residiverende og ikke-tilbakefall tilfeller: (1) der er skjæringspunktet, er prosentandelen av celletypen j som bestemt av et panel av patologer, er koeffisienten for bidraget fra celletype, er avviket eller endring av celletypen for når sykdommen tilbakefall. er indikatorvariabel for tilbakefall status. hvis motivet gjennomgår tilbakefall og ellers. er tilfeldige feil med antatt fordeling. Denne MLR-modell ble anvendt for å tilpasse dataene for å beregne uttrykket koeffisientene, og der er den celletype-spesifikk ekspresjon koeffisient og γ er forskjellen i celletype-spesifikk ekspresjon mellom tilbakefall og ikke-tilbakefall tilfeller. Dermed
β
j måler uttrykket av et gen av celletype j av ikke-residiverende tilfeller og
γ
j er endringen i
β
j i tilbakefall tilfeller. For MLR, β
0 er gjennomsnittet av ekspresjon av alle gener for alle celletyper og resultatet status (RS). Derfor β
j koeffisienter 0 indikerer at ekspresjon av genet j i en gitt celletype er mindre enn den midlere β
0, mens β
j koeffisienter 0 indikerer økt ekspresjon i forhold til p
0. Tilsvarende γ
j 0 indikerer at uttrykket av genet j er redusert i residiverende prostatakreft sammenlignet med ikke-residiverende prostatakreft mens γ
j 0 indikerer at uttrykket av genet j økes i residiverende prostatakreft sammenlignet med ikke-residiverende sykdom. Betydningen av γ
j ble bestemt ved t-test, basert på feil σ
j av γ
j. Nøyaktigheten av celletypespesifikke uttrykk bidrag koeffisienter, β, er validert [30].
Humant protein Atlas
immunhistokjemi bildene ble lastet ned fra offentlig tilgjengelig Humant protein Atlas (HPA) ( https://www.proteinatlas.org). HPA versjon 8.0 er en database med vev microarray (TMA) bilder merket med antistoffer mot 11.250 humane proteiner [31]. De microarray består av seksjoner fra 46 normale menneskelige vev og 20 forskjellige typer kreft hos mennesker. Det er maksimalt 24 prostatakreftbilder (fra 12 pasienter) og 3 normal prostata-bilder (fra 3 donorer) per antistoff, selv om bilde antallet kan variere, avhengig av antistoffet analysert. HPA bildene analysert var prostata seksjoner merket med enten Egr3 (HPA006206), PSMA (CAB001451, Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland), eller PRLH (HPA014768) antistoffer.
HPA bildene ble analysert og merking intensiteten ble kvantifisert med Aperio ImageScope programvare (Vista, CA) (Tall S1 og S2). Den positive Pixel Count Algoritme versjon 9.1 ble brukt til å kvantifisere mengden av antistoff binding og for å få pseudocolored TMA bilder. For å kvantifisere merking av bestemte strukturer som stroma eller tumor acini ble intensitets grenseverdier som er satt av Aperio programvaren som brukes, i henhold til produsentens forslag.
Pixel intensitet er definert som et mål på lysheten av pixel, eller mengden av lys som overføres gjennom sleiden. Jo lavere intensitetsverdi er, jo mørkere flekker skyldes økt absorbans A = -log I
obs /I
ref, hvor I
obs indikerer overført lys intensitet og I
ref er innfallende lysintensitet. Intensitet terskler ble satt til 220, 175, 100, og -1 for de svake, medium, sterk og «negative» piksler, henholdsvis. Pseudocolors av blått, gult, oransje og rødt ble brukt til negative, svak, middels og sterk piksler, henholdsvis.
Normal prostata og prostatakreft vev ble analysert med den positive pikselantallet algoritme. For å sammenligne tettheten til farging i normale og prostata kreftvev ble NSR (antall sterke positive bildeelementer forhold) anvendt. Antallet sterkt merkede positive bildeelementer blir dividert med det totale antall positive bildeelementer for å normalisere hver prøve til området under behandling, for derved å gi merking intensiteten av en utvalgt celletype per arealenhet av vevet.
den positive bildeelement count algoritme ble også brukt til å sammenligne protein ekspresjon i stromale og epiteliale komponenter av prostatavevet. En mus-guidet penneverktøyet ble brukt til å skissere 10 stromal og 10 kjertel områder per TMA delen. De 10 utvalgsområdene ble valgt tilfeldig når det er mulig, innenfor rammen av vev størrelse og sammensetning
Begrensninger i vev størrelse:. Det totale vev området ble bare 1 mm i diameter, og kantene av hver vev seksjon ble unngått fordi farging i disse områder har en tendens til å bli påvirket av behandlingen av TMA. I tillegg brukte vi utvalgs områder som ikke berører hverandre
Begrensninger i vev sammensetning:. Noen vevssnitt inneholdt mange kjertler, og når dette var tilfellet prøvetakingsområdene ble valgt tilfeldig. Andre deler inneholdt mye færre kjertel områder, redusere vårt valg å kjertler som var til stede. De stromale seksjoner, på den annen side, ble alle valgt tilfeldig siden vevssnittene hadde mange stromale områder.
Et øyeblikksbilde ble tatt av hver prøve tilfeldig valgt og anvendt for å verifisere at de anvendte prøver for analyse var representative for hele seksjonen.
resultatene ble i gjennomsnitt og brukes for bestemmelse av signifikante forskjeller i forhold til normal prostata vev.
Egr3-korrelerte Gener
Pearsons korrelasjonskoeffisient (R ) og den tilhørende sannsynlighet og skråningen ble beregnet i R miljø for korrelasjonen av ekspresjon av hvert gen på Affymetrix array plattform med uttrykk for Egr3. Genene med
p
verdier ≤0.001 basert på Pearsons korrelasjonsanalyse og en Pearson korrelasjonskoeffisient ≥0.45 ble valgt som definerer Egr3-korrelerte gener. Egr3-korrelert gener for hoved SPECS Affymetrix U133 Plus2.0 datasett (127 prostataprøver) som brukes i denne studien, og Egr3-korrelert gener for en ekstra SPECS genuttrykk datasett (136 prostataprøver) basert på Affymetrix U133A-plattformen, ble beregnet . Den overlappende gener mellom datasett som møtte betydningen cutoff-verdier ble tatt som den endelige listen over Egr3-korrelerte gener. Helningen på regresjonslinjen ble også brukt for å karakterisere etterlevelse av hver korrelasjon til Egr3 uttrykk og er rapportert i tabell S1.
Statistiske Simulering
Flere simuleringer ble utført for å vurdere tilfeldig hendelse. Generelt frekvensen av forekomsten av kandidatsondesett i en gruppe ble sammenlignet med frekvensen av forekomsten ved tilfeldig valg av et likt antall av sondesett fra resten av matrisen, dvs. fra alle sondesett med unntak av kandidatsondesett ved å bruke R program. Tilfeldig utvalg ble gjentatt 10.000 ganger og den gjennomsnittlige tilfeldige frekvensen av forekomsten i forhold til den observerte frekvensen av kandidatsondesett ble brukt til å fastslå sannsynligheten for tilfeldig forekomst.
transkripsjonsfaktorbindingssetet og Gene Network Analysis
Genomatix (Munchen, Tyskland) MatInspector programvare ble benyttet for å bestemme transkripsjonsfaktorbindingsseter for promotorområdene 1500 baser oppstrøms til 1000 baser nedstrøms fra transkripsjons-startsetet (TSS). Transkripsjonsfaktor bindingsseter (vekt matriser) bibliotek og virveldyr generell kjernepromotorelementer (0,75 /Optimized) matrise gruppen ble brukt til å beregne bindingssteder for hver promoter. Basert på MatInspector bakgrunn modell for forekomster av V $ EGRF (Transfac annotering for virveldyr Egr Familiemedlemmer Egr1, Egr2, Egr3, CKROX, og WT) bindingsseter, en 10 000 × simulering ble utført i R miljøet å sammenligne bakgrunnen prosent (62,7%) av V $ EGRF bindingssteder som bestemmes av MatInspector til den observerte prosentandel (99%).
p
verdi = antall ganger forventet var større enn den observerte /10000 hjelp Genomatix. Simuleringen
p
-verdi gir et anslag på falske funn.
MetaCore (Thomson Reuters, New York, New York) pathway analyse programvare ble brukt til å analysere sammenhenger mellom Egr3-korrelerte gener. Transkripsjonsfaktor berikelse analyse og protein funksjon berikelse analyse ble beregnet ved MetaCore hjelp av falskt funnrate (FDR) på 0,05 og en bakgrunn modell av rapporterte protein-protein eller protein-DNA interaksjoner. Alt
p
-verdier rapportert for MetaCore analyse kommer direkte fra MetaCore beregninger basert på en hypergeometrisk fordeling. Den web-baserte gen ontologi program DAVID [32], [33] (https://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) ble også brukt til å analysere funksjonelle forbindelser mellom Egr3-korrelerte gener.
ekstern validering datasett
offentlig tilgjengelig GEO datasett GDS2545 ble brukt som en ekstern validering av Egr3 og Egr3-korrelerte gener identifisert i sPECS datasett. GDS2545 består av 18 prøver av normal prostata fra givere, 63 prøver av normal prostata tilstøtende til tumor, 65 prøver av primær prostatakreft, og 25 prøver av metastatisk prostatakreft. Alle prøver ble hybridisert på Affymetrix U95A-arrayer. Chandran et al. [27] og Yu et al. [26] Rapporten Affymetrix Egr3 uttrykk verdier i tilleggsinformasjon og i tabeller av genekspresjon verdier. Egr3-korrelert genet analyse ble utført ved hjelp av dette datasettet. Den øverste 150 Egr3-korrelert probe sett bedømt ved Pearsons korrelasjon
p
-verdi består av 121 unike gener, som ble sammenlignet med 80 unike Egr3-korrelert gener identifisert i spesifikasjonene datasett som gir en overlapping på 43 unike gener. En 10 000 × simulering ble utført i R miljøet for å fastslå sannsynligheten for at dette overlapping oppstår ved en tilfeldighet (
p
= 0,0001).
Cell Culture
M12 human prostatakreft cellene ble holdt i serumfritt RPMI-medium supplert med L-glutamin, 10 ng /ml epidermal vekstfaktor, 0,1 uM deksametason, 5 ug /ml insulin, 5 ug /ml transferrin, 5 ng /ml selen, 0,05 mg /ml gentamicin og 2,5 ug /ml amfotericin B, som beskrevet i [34].
Stabil knockdown av Egr3 Ekspresjon i M12-celler
M12-celler ble sådd ut på dag før transfeksjon ved en tetthet på 750.000 celler /brønn i 6-brønns plater, i antibiotika-fritt vekstmedium inneholdende 2% føtalt bovint serum. Cellene ble transfektert med 3 mikrogram shRNA rykke plasmid (shSCR) eller shEgr3 plasmid (SA biovitenskap, Valencia CA) med 6 pl Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad CA) i henhold til produsentens instruksjoner. Puromycin (1 pg /ml) ble tilsatt i tre dager senere for seleksjon av transfekterte celler. Enkeltcellekloner ble isolert ved hjelp av standardmetoder. Stabilt transfekterte celler (shSCR-M12 og shEgr3-M12) ble deretter opprettholdt i M12-vekst-medium supplert med puromycin.
Western Blot analyse
Cellene ble vasket to ganger i fosfatbufret saltvann og lysert i RIPA buffer i nærvær av proteasehemmere. Lysatet ble ultralydbehandlet kort og fjernet ved sentrifugering ved 13 200 rpm ved 4 ° C. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved anvendelse av BioRad proteinanalyse. Proteiner ble underkastet SDS-PAGE-elektroforese etterfulgt av overføring til PVDF-membran. Membranene ble blokkert i 5% melk (w /v) i Tris-bufret saltvann som inneholdt Tween-20 0,5% (TBST) i 2 timer. Egr3 antistoff (sc-191 i Santa Cruz-Technology, Santa Cruz, CA) ble inkubert over natten ved 4 ° C, etterfulgt av 3 vaskinger i TBST. Membranene ble inkubert med HRP-konjugert antistoff i 1 time ved romtemperatur (RT). Etter 3 vasker i TBST, ble membranene inkubert med HyGlo-HRP Chemiluminescent kit (Denville Scientific, Metuchen NJ). Membraner ble strippet og reprobed med anti-aktin antistoffer (i Santa-Cruz).
Kvantitativ RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert fra shSCR-M12 (scramble kontroll) eller shEgr3-M12 celler ved hjelp RNeasy Plus-kit (Qiagen, Valencia, CA) ifølge instruksjoner, og resuspendert i vann. RNA integritet ble bestemt ved elektroforese på formaldehyd-agarosegel. Ett pg RNA ble omdannet til cDNA ved hjelp av Quanta qScript cDNA Super-blanding (5 min ved 25 ° C, 30 min ved 42 ° C, 5 minutter ved 85 ° C) i en termosykler. Real-time qPCR ble utført på ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems, Life Technologies, CA) ved hjelp av standard parametere. Hver prøve ble kjørt i fire paralleller med dissosiasjonskurve analyse. Forskjeller i mRNA nivåer ble analysert ved hjelp av 2
-ΔΔCT metode. GAPDH ble anvendt for å normalisere prøver. Primer sekvenser er gitt i Figur S4.
Reporter analysen
Den menneskelige IL8 promoter (baser -262 til -55) klonet inn i pGL3 luciferase plasmid og kontroll PRL-SV40 Renilla luciferase plasmid var en slags gave fra Dr. Carlotta Glackin (City of Hope, Los Angeles, CA) og har blitt beskrevet i Li et al. [35]. IL6-pGL3 Luciferase plasmid inneholdende den IL6-promotoren var en gave fra Dr. Steve Cole (UCLA, CA) og er blitt beskrevet i Eickelberg et al. [36]. De shSCR-M12-celler og shEgr3-M12-celler ble sådd ut i en tetthet på 20.000 celler /brønn i en hvit 96-brønn plate på dag før transfeksjon, og dyrket i antibiotika-fritt, fenolrødt-fritt vekstmedium. Cellene ble transfektert med IL6-pGL3 eller IL8-pGL3 plasmider og Renilla luciferase plasmid (å normal for effekten av transfeksjon og celle tall). Fugene transfeksjon reagens (Promega, Madison, WI) ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner med 160 ng pGL3 plasmid, 40 ng PRL plasmid og 0,6 mL Fugene. To dager senere ble Dual-Glo Luciferase-reagens (Promega) tilsatt til vekstmediet (1:01 vol /vol) og inkuberes i 10 min RT. Platene ble avlest ved hjelp av en Dynatech ML-3000 luminometer. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av Dual-Glo Stop & Co. Glo reagens, som også initierer Renilla luciferase reaksjonen, i 10 minutter ved romtemperatur før lesing. Forholdet mellom Firefly til Renilla luminescens ble beregnet for hver brønn.
Resultater
Celletype-spesifikke RNA uttrykk for Egr3 økes i Prostate Cancer
Vi analyserte Affymetrix hele genomet uttrykk data fra normal og cancerous prostata vev for å fastslå om Egr3 er uttrykt forskjellig. Den Affymetrix U133 Plus2.0 genuttrykk data består av 19 normale prostataprøver (hentet fra 13 givere) og 108 prostata tumorprøver (hentet fra 84 prostatakreftpasienter, flere prøver fra de samme pasientene var tilstede i genuttrykk datasett). Pasient demografisk informasjon for de 84 kreftpasienter og de 13 normale donorer vev er oppsummert i tabell 1. Analyse av de normaliserte uttrykk dataene fra de 127 prostata prøvene viste at Egr3 (probe set 206115_at) er betydelig over-uttrykt i prostata kreft sammenlignet med normal prostatavevet. Mean uttrykk i prostata kreft er 5.35 ganger høyere enn i normal prostata vev og en t-test (
p
= 2 × 10
-15) bekreftet at denne forskjellen har stor betydning. Analyse av median uttrykk verdier avslører også en betydelig forskjell i Egr3 uttrykk mellom normal prostata og prostatakreft prøver (data ikke vist). Et histogram av Egr3 uttrykk for alle pasienter er vist i figur 1. Egr3 ekspresjons-verdier er vist som Affymetrix intensitetsverdier i stedet plottet på en log2 målestokk for bedre å vise deres rekkevidde. Siden den gjennomsnittlige alder på tumorbærende tilfeller avvike fra de normale tilfeller (tabell 1), ble Affymetrix uttrykk forskjell for Egr3 forhold til listen over tidligere fastsatte aldersrelaterte endringer av Jia et al. [37] basert på en sammenligning av uttrykk data for 15 normale prostatabiopsiprøver med en gjennomsnittsalder på 54 år for dem for de 13 raske obduksjons prøver med en gjennomsnittsalder på 84 år. Av de 3400 probe sett noe som ga signifikante forskjeller identifisert i denne sammenligningen, ble probe sett for Egr3 ikke inkludert. Disse resultatene indikerer at den økte ekspresjon av Egr3 ikke er assosiert med aldersforskjellen mellom normale donorer og prostata kreftpasienter og er assosiert med en eller flere egenskaper som er spesifikke for tumorbærende prostatavevet.
Affymetrix uttrykk er plottet på en lineær skala hvor anti-log
2 av hver enkelt pasients Egr3 uttrykk verdien plottes på y-aksen. Den stiplede linjen på 1292 betegner middelverdien Egr3 intensitetsverdi for alle prøvene.
Validering på proteinnivå med en ekstern datasett
Selv om Egr3 er oppregulert på mRNA-nivå , kan det være Egr3 proteinnivå som er viktig for funksjonen av Egr3 i prostata kreft. For å komplettere genuttrykk dataene vi utnyttet en
i silico
tilnærming til å analysere Egr3 protein nivåer i prostatavevet. The Human Protein Atlas (HPA) er en samling av vev microarray data for 20 forskjellige typer kreft og 46 normalt vev (https://www.proteinatlas.org). Tissue morfologi og protein uttrykk mønstre for HPA pasientprøver ble bekreftet av en bord-sertifisert patolog. HPA gir en indikasjon på protein uttrykk i kreft sammenlignet med normale vev kolleger. HPA bildene ble lastet ned for videre kvantitativ analyse. De tilgjengelige prostata vev immunhistokjemi bilder for Egr3 farging består av 20 prostatakreft prøver fra 11 pasienter og 3 normale prostataprøver fra 3 givere.
Vi brukte Aperio ImageScope positive pikselantallet algoritme for å kvantifisere intensiteten av Egr3 farging ( HPA006206). Pseudocolors ble påført som beskrevet i metode og er vist i figur 2. Selv om kun fire terskelverdier ble anvendt, de pseudocolored bildene illustrerer tydelig at Egr3 fargeintensitet separert epiteliale holdige kjertel strukturer fra andre funksjoner som stroma (figur 2), indikerer at den enkle terskel metoden tilstrekkelig adskilt kjertel elementer fra alt annet. Stroma var stort sett blottet for Egr3 farging. For både normale og tumorprøver, den dominerende anti-Egr3 fargemønster var jevnt epitel. Innenfor epitelceller, ble Egr3 farging observert i cytosol- membran kamrene og svakt i kjernen
A-B.: HPA normal prostata, pasienter som 2098 og 2472, henholdsvis. C-D: HPA prostatakreft prøvene, pasienter 3303 og 3744, henholdsvis. Alle ekstra tilgjengelige HPA tilfeller er vist i supplement informasjon. E:. Histogram av sterke positive bildeelement-forhold (NSR) for normale og prostata kreftpasienter
Selv om transkripsjonsfaktorer kan ventes å lokalisere det meste til kjernen, er dette fargemønsteret ikke er enestående for Egr3 i menneskelig Protein Atlas. Som et eksempel har vi sett på farging av et godt undersøkt transkripsjonsfaktorer, c-fos. Farging for c-fos (HPA018531) er stort sett kjernekraft, men ser også på en cytoplasma-membran lokalisering i fire av ti prostata kreft vev som farget positivt for c-fos.
Det er også mulig at Egr3 lokalisering er endret i patologiske tilstander, slik tilfellet er for transkripsjonsfaktor og tumor suppressor p53, for eksempel. Faktisk, akkumulerer villtype p53 i cytoplasma av tumorceller i inflammatorisk brystkreft eller neuroblastom, som fører til sin funksjonelle inaktivering [38] – [40]. Det kan være interessant i fremtiden, for å bekrefte det cytoplasmatiske /membran lokalisering av Egr3 og dens relevans.
For å kvantifisere Egr3 flekker vi valgt et gjennomsnitt på 10 kjertel og 10 stroma regioner i hver pasientprøve. Hver av de 10 regionene ble avgrenset ved hjelp av et musestyrt pekeren slik at kun områder av ren histologisk funksjon som kjertler og kjertellignende svulst formasjoner ble inkludert. Programvaren gjenkjent kjertel lumen og pseudolumen trofast og ekskludert piksler i disse regionene så lenge omsorg ble tatt for å utelukke lumen med rusk. De resulterende Egr3 flekker intensitetsverdier fra alle 10 områder for tumor og stroma ble normalisert seg. For dette trinnet antall svake, middels og sterkt farget piksler ble veiet (svak = 1, middels = 2, kraftig = 3).
