Abstract
lysofosfatidisk syre (LPA) er et bioaktivt lipid som forbedrer eggstokkreft celleproliferasjon, migrasjon og invasjon
in vitro Hotell og stimulerer peritoneal metastaser
in vivo
. LPA er generert ved virkningen av autotaxin eller fosfolipaser, og degradering begynner med lipid fosfat phosphohydrolase (LPP) -avhengig fjerning av fosfat. Mens effekten av LPA for progresjon av kreft i eggstokkene er klare, har virkningene av LPA metabolisme i svulsten mikromiljøet på peritoneal metastase ikke blitt rapportert. Vi undersøkte bidrag av lipid fosfatase aktivitet for å eggstokkreft peritoneal metastase ved hjelp av mus som mangler LPP1 uttrykk. Homozygot sletting av LPP1 (LPP1 KO) resulterer i forhøyede nivåer og redusert omsetning på LPA
in vivo
. Innen 2 uker etter intraperitoneal injeksjon av syngene mus eggstokkreft kreftceller, observerte vi forbedret tumor seeding i LPP1 KO mus sammenlignet med villtype. Men tumorvekst plateaued i LPP1 KO mus ved 3 uker mens svulster fortsatte å vokse i villtype mus. Den reduserte tumorbyrden ble ledsaget av økt apoptose og ingen endring i spredning eller angiogenese. Tumorvekst ble restaurert og apoptose reversert med eksogene administrasjon av LPA. Sammen utgjør disse observasjonene viser at forhøyede nivåer av LPA per se i LPP1 KO mus ikke hemme tumorvekst. Snarere dataene støtter forestillingen om at enten forhøyet LPA konsentrasjon eller endret LPA metabolisme påvirker andre vekstfremmende bidrag av svulsten mikromiljøet
Citation. Nakayama J, Raines TA, Lynch KR, Slack-Davis JK (2015 ) Redusert Peritoneal Eggstokkreft Vekst i mus som manglet Expression of Lipid Phosphate Phosphohydrolase 1. PLoS ONE 10 (3): e0120071. doi: 10,1371 /journal.pone.0120071
Academic Redaktør: Tanya V. Kalin, Cincinnati Children Hospital Medical Center, UNITED STATES
mottatt: 08.09.2014; Godkjent: 03.02.2015; Publisert: 13 mars 2015
Copyright: © 2015 Nakayama et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health /National Cancer Institute stipend CA142783 støttet JKS-D og KRL, som også ble støttet av National Institutes of Health Generelle Medical Sciences gi GM067958-09. TAR ble støttet av et mangfold supplement til CA142783. JN ble støttet av University of Virginia gynekologisk onkologi Fellowship Program. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lysophsphatidic syre (LPA) er et bioaktivt lipid som regulerer flere cellulære funksjoner kritiske for tumordannelse og metastase inkludert spredning, overlevelse, cytoskeletal omorganisering, migrasjon, invasjon og cytokin produksjon [1-5]. Betydningen av LPA til progresjon av kreft i eggstokkene ble etablert når det ble identifisert som en vekstfaktor i ondartede ascites [6]. LPA stimulerer cellulære aktiviteter via minst tre (LPA1, LPA2, og LpA3) og kanskje så mange som 6 (LPA4-6) G-protein koblede reseptorer. LPA1 uttrykkes på normal eggstokk overflaten epitel; ekspresjonen av LPA2 og LpA3 induseres i kreftcellene [2]. Ved å binde dets reseptor, LPA stimulerer ovariecancer celleproliferasjon gjennom aktivering av Gα12 [4]. Alle tre reseptorene regulere eggstokkreft celle migrasjon og invasjon direkte ved å aktivere pro-trekkende Rac og Rho-avhengige signalveier [1,7]. I tillegg fremmer LPA eggstokkreft vekst og metastase indirekte ved å stimulere produksjonen av proteaser (MMP og urokinase-plasminogen-aktivator) [8,9] og cytokiner (IL-6 og IL-8), som spiller en rolle i eggstokkreft invasjon og metastase [10]. LPA binding til LPA2 eller LpA3 øker produksjonen av IL-6, IL-8, og VEGF. Faktisk knockdown av LPA2 eller LpA3 minsker IL-6-produksjon, og deres over-ekspresjon fører til økte serumnivåer av IL-6 og VEGF, økt tumorbyrde og forkortede overlevelsestider i en musemodell av eggstokkreft peritoneal metastase; modulering av LPA1 hadde ingen signifikant effekt i denne studien [11].
LPA er produsert av en rekke celler i tumoren mikromiljøet, inkludert blodplater, mesothelial celler, adipocytter, endotelceller og eggstokkreft celler [12,13 ], og i fravær av kreft, konsentrasjonene er tett holdes under 1 pM. Nivåer av LPA er signifikant forhøyet i plasma og ascites (opp til 50 uM) av kvinner med eggstokkreft [14], og øket plasma LPA har vært foreslått som en biomarkør for eggstokkreft [15]. Medlemmer av fosfolipase A
1 (PLA
1) og PLA
2 familier fjerne en fettsyrekjeden fra fosfatidsyreinnhold å danne LPA. Autotaxin (ATX), et ekstracellulært lysophospholipase D genererer også LPA etter fjerning av kolin fra lysofosfatidylcholin. PLA
2 og autotaxin er forhøyet i eggstokkreft pasienter [16,17], og eksisterer en positiv feedback loop mellom vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og ATX produksjon av eggstokkreft celler [18].
LPA katabolisme er initiert av lipid fosfat phosphohydrolases (LPPs), type 1, 2 og 3, som fjerner den fosfat å generere monoacylglycerol (MAG). MAG blir ytterligere spaltet av monoacylglycerol lipase for å frigjøre fettsyrekjeden fra glycerol. LPP1 og LPP3 uttrykk er redusert i menneske eggstokkreft i forhold til normal eggstokkvev [19], mens tvunget over-uttrykk for enten LPP1 eller LPP3 reduserer tumorigenesis av eggstokkreft celler i musemodeller antagelig fra reduserte nivåer av LPA [19,20].
i tillegg til å regulere eggstokkreft celleproliferasjon, overlevelse, migrasjon og invasjon
in vitro
, evne til LPA å fremme eggstokkreft invasjon og vekst har blitt vist i musemodeller av peritoneal metastaser; daglig injeksjon eller implantering av pumper produserer høye konsentrasjoner av LPA økt tumorbyrde i immun kompromittert og syngene musemodeller [21,22]. Imidlertid har effekten av LPA metabolisme i svulsten mikromiljøet på peritoneal metastase ikke blitt rapportert. Vi ønsket å finne ut om svekket LPA fosfatase (spesielt LPP1) aktivitet påvirket eggstokkreft peritoneal metastasering. I stedet for å målrette LPP1 aktivitet i tumorcellene, undersøkte vi effekten av LPP1 tap i svulsten mikromiljøet ved hjelp av mus som mangler LPP1 uttrykket etter innsetting av en ekson-felle (LPP1 KO) [23] og syngen mus eggstokkreft celler [24] . Lipid-fosfatase-aktivitet i LPP1 KO mus markert redusert (35-95%) i flere vev, inkludert de som finnes inne i bukhulen. I tillegg er plasma LPA metaboliseres 4 ganger saktere enn villtype mus, og plasmakonsentrasjonen av LPA er signifikant forhøyet i LPP1 KO mus [23]. Her rapporterer vi at peritoneal eggstokkreft vekst i LPP1 KO mus ble hevet så tidlig som 2 uker etter oppstart i forhold til villtype kontroller; imidlertid, mens tumorbyrden fortsatte å øke i villtype-mus, det plateaued etter 3 uker i mus som mangler LPP1 uttrykk. Den reduserte tumorbyrden ble ledsaget av økt apoptose og ingen endring i spredning eller angiogenese. Data fra en matrigel pluggen angiogenese analysen har ikke avdekket feil i LPP1 KO mus. Videre eksogene administrasjon av LPA stimulert kreft vekst eggstokkreft i like stor grad i villtype og LPP1 KO mus. Sammen utgjør disse observasjonene støtter forestillingen om at LPP1 KO mus mangler enten et kritisk vekstfremmende faktor eller produsere en hemmer av kreft vekst eggstokkene, som kan overvinnes ved å øke LPA følgende eksogene administrasjon.
Materialer og metoder
Cellekultur og Transfeksjon
ID8 celler ble generøst gitt av Dr. K. Roby (University of Kansas) [24] og dyrket i DMEM supplert med 4% føtalt bovint serum, 100 enheter /ml penicillin , 100 ug /ml streptomycin, 5 ug /ml insulin, 5 pg /ml transferrin og 5 ng /ml natriumselenitt. De ble passert to ganger gjennom C57BL /6-mus for å øke tumor ta og redusere vekstkinetikk. Den resulterende cellelinje, ID8ip2, ble omformet med lentivirus uttrykker luciferase (GeneCopoeia, Rockville, MD), og stabilt uttrykker populasjoner (ID8ip2Luc) ble oppnådd etter puromycin (2 mikrogram /ml) utvalg i 2 uker.
Mus ovarian kreft peritoneal metastase
Alle dyreforsøk ble utført etter godkjenning fra Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Virginia. Seks til åtte uker gamle hunnvilltype (C57BL /6) eller LPP1 hypomorphic (LPP1 KO) mus ble injisert intraperitonealt (IP) med 10
6 ID8ip2Luc celler i 200 ul PBS. Eksperimenter ble utført med grupper av 3-5 mus pr genotype og /eller behandling; det totale antall mus analysert (n) er angitt i figuren forklaringen. Musene ble observert 2-3 ganger per uke ved laboratoriepersonell og overvåkes for tegn på stress (dvs. endringer i utseende, respirasjon, aktivitet, etc.) og veies; mus som viser tegn på stress eller å miste mer enn 15% av kroppsvekten ble avlivet og undersøkt for svulst. LPA (18: 1, Sigma-Aldrich) ble suspendert i 0,5% fettsyrefritt bovint serumalbumin i fosfatbufret saltvann (PBS) ved en konsentrasjon på 100 umol /L, og 200 ul ble levert IP en gang daglig med start en dag etter startfasen, og fortsatte i 6 uker. Daglig administrasjon av kjøretøy tjente som negativ kontroll. Tumor byrde ble overvåket ukentlig ved å måle lyset utslipp følgende IP luciferin administrasjon som en indikasjon på luciferase aktivitet ved hjelp av IVIS Imaging System (Molecular Imaging Core, University of Virginia). Totale fluks (fotoner /sek) ble bestemt for hele bukhulen. Ved eksperimentell avslutning ble musene avlivet og tumorbelastning evaluert ved obduksjon ved å telle antall tumorknuter, og veiing av det omentum (primærside tumorimplantering) og eventuelle ytterligere tumorknuter. Formalinfiksert, parafininnstøpte vev ble seksjonert og H . E farget (University of Virginia Forskning Histologi Core) for å evaluere mikroskopisk tumorbyrde, omfanget av peritoneal invasjon, og mitotisk indeks
Immunohistochemistry
En del av svulsten som inneholder omentum per mus ble utsatt for immunhistokjemi for Ki67 (1:. 500, kanin monoklonalt, Epitomics, Cat # 4203-1), kløyvde caspase 3 (1: 500, kanin polyklonale, Cell Signaling, Cat. # 9661), CD31 (endotelceller, 1:.. 4, kanin polyklonale, Abcam, Cat # ab28365), eller VCAM-1 (1: 800, kanin polyklonale, Abcam, Cat # ab134047) (University of Virginia Biorepository Tissue Forskning Facility). Kort fortalt seksjonene ble kokt i lav pH (Ki67, CD31) eller høy pH (kløyvde caspase 3, VCAM-1) EnVision FLEX Target Retrieval Solution (Dako) og farget med de angitte konsentrasjoner av hvert antistoff. Antigen-antistoff-komplekset ble oppdaget ved hjelp av Envision Dual Link (Dako) etterfulgt av inkubasjon med 3,3′-diaminobenzidintetrahydroklorid (DAB +) kromogen (Dako) og kontra med hematoksylin. Ki67, og kløyvet caspase 3 farging ble kvantifisert ved å summere antall positivt og negativt farget kreftceller i 5 kraftige (400X forstørrelse) felt per seksjon (en seksjon per mus) til å beregne prosent positive celler. Utstrekningen av fartøyet dannelse ble bestemt ved å telle antall CD31 farget fartøy og normalisering den til det totale tumorområdet (beskrevet og beregnet ved hjelp av ImageJ) per 200X felt (5 felt avdeling, en seksjon per mus). Prosentandelen av mesothelial celler som uttrykker membran VCAM-1 ble scoret positivt på . 50%
Matrigel plugg angiogenese analysen
vekstfaktor-redusert matrigel (BD Biosciences) ble blandet med ID8ip2Luc celle betinget medium (1: 1) eller med 1 ug /ml FGF, 20 ug /ml VEGF [25] og injisert subkutant i 10 villtype eller 8 LPP1 KO mus. Hver mus mottok en matrigel pluggen med kondisjonert medium og ett med FGF /VEGF. Etter 10 dager ble musene avlivet, og Matrigel plugger ble gjenvunnet, fiksert i 10% formalin, innleiret, seksjonert, og farget for CD31 å markere fartøy. Det totale antall CD31 positive fartøy i fem 200X forstørrelse felt per pluggen ble regnet. Plugger ble ikke gjenopprettet fra alle mus; antall plugger for hver genotype og angiogenic stimulus er indikert i figuren legende.
Statistical Analysis
Alle data ble analysert ved hjelp GraphPad Prism 6 programvare. Luminescens data ble analysert ved bruk av to-veis analyse av varians (ANOVA) etterfulgt av Tukey multippel sammenligninger test. Enveis ANOVA etterfulgt av Tukey største multiple sammenligninger test ble brukt til å analysere omentum vekter og vev-farging fra mus behandlet med LPA eller kjøretøy. Forekomsten av invasive svulster eller VCAM-1 farging ble analysert ved hjelp av Fishers Exact test. De resterende data ble analysert med en uparet t-test eller Wilcoxan-Mann-Whitney test avhengig av om dataene var para.
Resultater
Økt tumor seeding av bukhinnen i LPP1 KO mus
Mens bidraget fra LPA til eggstokkreft vekst og fremgang har blitt studert inngå [1,2,4,7-11], effekten av LPA metabolisme på kreft progresjon er dårlig forstått. Vi undersøkte effekten av redusert LPA omsetning på metastatiske peritoneal kreft i eggstokkene vekst og progresjon ved hjelp mus som mangler lipidet fosfatase, LPP1 (LPP1 KO) og en syngenisk mus ovarian cancer-cellelinje, ID8ip2Luc.
In vivo
avbildning av mus etter intraperitoneal (IP) injeksjon av ID8ip2Luc celler avslørt økt luminescens i LPP1 KO mus sammenlignet med villtype innen 2 uker (Fig. 1a). Fysisk undersøkelse av bukhulen ved obduksjon 2 uker etter tumorstart viste ingen tegn på tumorknuter (data ikke vist), og ingen forskjell i vekt av det omentum (primærside tumormetastase) mellom genotypene (S1 fig.), Eller fra ikke- tumorbærende mus (data ikke vist). Imidlertid evaluering av H LPP1 KO n = 12) ble fotografert ukentlig etter startfasen for å overvåke tumorvekst. Data representerer gjennomsnitts totale fluks (fotoner /sekund) ± std err og ble analysert ved to-veis ANOVA, etterfulgt av Tukey multippel sammenligninger test. (B) Det totale antall mikroskopiske tumorknuter ble tellet i et individ, tilfeldig valgt, H LPP1 KO n = 8). Data representerer gjennomsnitt ± std feile; p = 0,0069 bestemmes av t-test. (C) Prosentandelen av villtype eller LPP1 KO (fra (B)) mus med invasive (fylte søyler) eller ikke-invasiv (inneholder ingen svulst; stiplede søyler) tumorer 2 uker etter tumorstart. Antall mus pr resultat er indikert. Betydning bestemmes av Fishers Exact Test. (D) Prosentvilltype eller LPP1 KO (fra (B)) mus med (positive, sorte stolper) eller uten (negativ, stiplede søyler) mesothelial VCAM-1-farging av IHC 2 uker etter tumorstart. Antall mus pr resultat er indikert. Betydning bestemmes av Fishers Exact Test.
Redusert tumorvekst og økt apoptose i LPP1 KO mus
Mens mikromiljøet av LPP1 KO mus favoriserer svulst implantering i bukhulen, villtype mus viste tilsvarende tumorbelastning angitt med luminesence innen 3 uker etter oppstart (fig. 1a). Mer påfallende, robust tumorvekst fulgte i villtype mus som vist ved økt luminescens over tid mens svulster plateaued i LPP1 KO mus i 3 uker (Fig. 2A og 2B). I tillegg villtype mus hadde økt antall av makroskopiske tumorknuter spikerslag bukhulen og økt tumorvolum bestemt ved å veie omentum og tilhørende tumorer (Fig. 2C og 2D). For å avgjøre om mangelen på tumorvekst i LPP1 KO musene var på grunn av mindre spredning eller økt apoptose, ble svulster farget for den proliferative Ki67 eller kløyvet caspase 3, som en markør for apoptose. Tumorer avledet fra villtype og LPP1 KO mus hadde ekvivalente nivåer av proliferasjon (fig. 3A). Imidlertid svulster fra LPP1 KO mus hadde 3 ganger flere celler farging positivt for spaltede caspase 3 sammenlignet med villtypen (fig. 3B) som indikerer en betydelig økning i apoptose. Derfor, mens tap av LPP1 i svulsten mikromiljøet forenkler tumor såing, er det ikke tilstrekkelig å opprettholde tumorvekst over tid på grunn i det minste delvis til en økning i apoptose.
Etter intraperitoneal injeksjon av ID8ip2Luc celler, mus ble fotografert ukentlig for å overvåke tumorvekst kinetisk. (A) Representative luminescens bilder av villtype og LPP1 KO mus med svulst tatt på to ukers mellomrom. (B) Kvantifisering av total fluks (fotoner /sekund) ble bestemt ukentlig i villtype (n = 10) og LPP1 KO (n = 12) mus. Data representerer gjennomsnitt ± std feile; p 0,001 bestemt ved to-veis ANOVA, etterfulgt av Tukey multippel sammenligninger test. (C) Data representerer antall makroskopiske tumorknuter per mus bestemt 8 uker etter tumorstart. Mus med for mange knuter å telle ble tildelt en verdi på 200. Data representerer median med
th 25 og 75
th persentiler; p = 0,02 bestemt ved bruk av Wilcoxan-Mann-Whitney test. (D) Tumorvolumet ble bestemt ved å veie den omentum (primære stedet for tumordannelse) og alle tilhørende tumorknuter 8 uker etter tumorstart; hvert punkt indikerer en individuell mus. Data representerer median med
th 25 og 75
th persentiler; p = 0,0031 bestemmes av t-test.
Svulster samlet 8 uker etter oppstart ble seksjonert og farget for Ki67 (A) eller kløyvet caspase 3 (B). Farging ble kvantifisert ved å telle antallet av positive og negative celler fra 5 kraftige felt (400x forstørrelse) av tumor pr mus, 5 mus pr gruppe. Dataene er presentert som prosent positive. Box og værhår plott viser minimum 25
th persentil, median, 75
th persentilen og maksimumsverdier. * P 0.001, t-test.
Angiogenese er ikke endret i LPP1 KO mus
Økt apoptose i LPP1 KO mus kan oppstå som et resultat av mangel på næringsstoffer til tumoren på grunn av defekt angiogenese, fravær av et pro-overlevelsesfaktor eller nærvær av en induser av celledød. Faktisk, mus mangler LPP3 uttrykk er i sin spede dødelig på grunn av en defekt i angiogenese [27]. For å avgjøre om angiogenese var defekt i LPP1 KO mus ble svulster farget for endothelial markør CD31. Som vist på fig. 4A, svulster fra villtype og LPP1 KO mus hadde tilsvarende nivåer av CD31 flekker. Til mer objektivt vurdere om det var en egenverdi endring i angiogenese, utførte vi en matrigel pluggen analysen. Kort, Matrigel embedded med tumorcelle kondisjonert medium eller FGF og VEGF ble implantert i flankene av villtype eller LPP1 KO mus for å stimulere angiogenese (S2 fig.). Tumorcelle kondisjonert medium stimulert et tilsvarende antall skip i villtype og LPP1 KO mus (Fig. 3B). FGF /VEGF-stimulert kar dannelse i større grad i LPP1 KO-mus sammenlignet med villtypen (fig. 3C). Sammen utgjør disse observasjonene tyder på at økt apoptose og medfølgende nedgang i tumorbyrde i LPP1 KO mus var ikke på grunn av en defekt i angiogenese.
(A) Svulster fra mus 8 uker etter oppstart ble seksjonert og farget for CD31, og det totale antall CD31 positive fartøy pr tumorområdet fra 5 høy drevet felt (HPF; 200X forstørrelse) per mus av villtype (WT, n = 5) og LPP1 KO (n = 5) mus er plottet. Det totale antall CD31 positive fartøy observert i fem HPF av Matrigel plugger som inneholder betinget media fra ID8ip2Luc celler (B) eller FGF /VEGF (C) er plottet (se Materialer og metoder). Data er presentert med Box og værhår plott som beskrevet for fig. 3. * p = 0,0083, t-test.
Eksogene vekstfaktor administrasjon seirer svulst undertrykkelse i LPP1 KO mus
Redusert tumorvekst i fravær av feil i angiogenese er veiledende av mangel på et vekstfremmende miljø i LPP1 KO mus. Et slikt miljø kan omfatte et mangfold av komponenter, inkludert mangel på en vekstfremmende (pro-overlevelse) faktor, nærværet av en inhibitor av vekst (induserer celledød), den manglende evne til å rekruttere hjelpeceller er nødvendig for å fremme vekst, upassende celle-celle-interaksjoner i svulsten eller en hvilken som helst kombinasjon av disse eller andre effekter. Vi antok at eksogene administrasjon av høye konsentrasjoner av en vekstfaktor ville overstyre de negative konsekvensene av den veksthemmende miljø. LPA er en veletablert stimulator av eggstokkreft cellevekst [2,4]. Daglig administrering av LPA er blitt rapportert å stimulere veksten av humane eggstokkreft celler i immun kompromitterte mus [21] og tumorer i mus ID8 eggstokkreft modell [22]. Derfor ble det undersøkt muligheten av LPA til å stimulere ID8ip2Luc tumorvekst i LPP1 KO sammenlignet med villtype-mus. Daglig administrasjon av LPA tumorvekst i villtype mus betydelig økt startet 4 uker etter initiering og kulminerte i 3 ganger mer luminescens i forhold til villtype mus uten eksogene LPA (Fig. 5A), i samsvar med tidligere observasjoner [22]. LPA også stimulert tumorvekst i LPP1 KO mus i samme grad observert hos villtype-mus behandlet med LPA (Fig. 5A). I begge tilfeller økes LPA tumorcelle-proliferasjon (fig. 5B). Påfallende, redusert LPA antallet celler som farget positivt for spaltet for caspase 3 til nivået funnet i tumorer fra villtype mus med eller uten LPA (fig. 5C). Dataene indikerer at levering av økte konsentrasjoner av LPA reverserer den negative vekst miljø som finnes i LPP1 KO mus.
ID8ip2Luc eggstokkreft celler ble injisert IP inn i villtype (WT, n = 19) eller LPP1 KO (n = 20) mus. Mus fikk daglig injeksjoner av LPA (n = 6 WT, n = 7 LPP1 KO) eller vehikkel (n = 13 for begge genotyper) som starter dagen etter tumor injeksjon. (A) Mus ble fotografert ukentlig etter startfasen for å overvåke tumorvekst. Data representerer gjennomsnitts totale fluks (fotoner /sekund) ± std feile; * P 0,001, 2-veis ANOVA, etterfulgt av Tukey multippel sammenligninger test. Svulster ble samlet 6 uker etter oppstart, seksjonert og farget for Ki67 (B) eller kløyvet caspase 3 (C). Kvantifisering av Ki67 og spaltet caspase 3 ble oppnådd ved å bestemme prosentandelen av positivt fargede celler i 5 kraftige felt (400x forstørrelse) pr mus, 5 mus pr gruppe. Data er presentert med Box og værhår plott som beskrevet for fig. 3. ** p 0,0001, to-veis ANOVA etterfulgt av Tukey sin multiple sammenligninger test.
Diskusjoner
LPA er en viktig regulator av eggstokkreft vekst og metastasering. I tillegg til de økte nivåene funnet i ascites, som er ledsaget av økt ATX aktivitet, svulstene selv har de novo uttrykk for LPA reseptorer (LPA2 og LpA3) [2] og redusert uttrykk for LPP1 og LPP3 [19,20]. Her, undersøkte vi bidraget av LPA metabolisme i ikke-kreftceller i svulsten mikromiljøet på etablering og vekst av eggstokkreft i bukhulen. Tap av LPP1 uttrykk innen svulsten mikromiljøet førte til økt tumor seeding følgende IP-injeksjon av eggstokkreft celler; imidlertid påfølgende vekst ble hemmet, som ble ledsaget av økt apoptose og ingen defekter i tumorcelle-proliferasjon, angiogenese eller makrofag og lymfocytt rekruttering (data ikke vist). Disse observasjoner tyder på at tapet av LPP1 skaper et miljø som er tilstrekkelig til å understøtte tumorvekst kanskje på grunn av mangel på pro-overlevelsesfaktorer eller tilstedeværelse av veksthemmere.
LPP1 KO mus er karakterisert som å ha økt plasmanivåer og LPA redusert LPA omsetning [23]. LPA stimulerer mange aspekter av eggstokkreft cellebiologi, inkludert spredning, overlevelse, migrasjon og invasjon [2,4]. Faktisk, observerte vi en økning i mesothelial invasjon og tumor seeding tidlig etter startfasen i LPP1 KO mus. LPA er blitt rapportert å stimulere mesothelial invasjon i cellekulturmodeller [13] og
in vivo product: [22], selv om en mekanisme ikke er definert. Tidligere viste vi en rolle for VCAM-1 uttrykt på mesothelium i reguleringen av eggstokkreft invasjon in vitro og in vivo [26]. Interessant, LPP1 KO-musene hadde en høyere forekomst av mesothelial VCAM-1-ekspresjon som tilbyr muligheten for at LPA kunne regulere VCAM-1-ekspresjonen for å fremme mesothelial invasjon. Ytterligere studier er nødvendig for å finne ut om dette er tilfelle.
Mens LPP1 KO mus har økt tumor seeding i nærvær av forhøyede nivåer og redusert omsetning på LPA, ble påfølgende tumorvekst hemmet og ledsages av økt apoptose, en resultatet som motsier veletablert pro-vekst, pro-overlevelse effektene av LPA. Mekanismer som tap av LPP1 i svulsten mikromiljøet stopper tumorvekst er uklare. En mulighet er at forhøyede LPA som et resultat av mangel LPP1 påvirker andre cellulære komponenter i svulsten mikromiljøet for å negativt påvirke tumorvekst. Svulsten mikromiljøet inneholder en kompleks blanding av cytokiner, vekstfaktorer og flere celletyper, inkludert endotelceller og immunceller som fungerer sammen for å fremme tumorvekst [28]. Mens den økte apoptose i tumorer fra LPP1 KO-mus kan være på grunn av mangel på næringstilførsel til tumoren, observerte vi noen defekt i angiogenese. LPA er blitt rapportert å stimulere vandring og overlevelse av makrofager [29-31], lette transmigrasjon av lymfocytter [29,32] og hemme den cytotoksiske aktiviteten av T-celler og NK-celler [33,34], som alle ville forventes å fremme tumorvekst. Vi fant ingen forskjell i antallet makrofager eller lymfocytter (B, T og NK) i tumorer fra villtype og LPP1 KO-mus (data ikke vist). Det er imidlertid mulig at svulster fra LPP1 KO mus har ulike undergrupper av immunceller (dvs. mangel på pro-tumor eller overrepresentasjon av anti-tumor) og /eller endret regulering av sin virksomhet.
Effekter for tap av LPP1 på tumorvekst kan skyldes endringer i metabolismen av andre fosfoglyserider. I tillegg til LPA, virker LPP1 på andre fosfoglyserider, inkludert fosfatidinsyre og sfingosin-1-fosfat (S1P) [35], som ved høye konsentrasjoner induserer kreft i eggstokkene celledød [36]. Imidlertid observerte vi ingen forskjeller i S1P plasmakonsentrasjon mellom villtype og LPP1 KO-mus (data ikke vist). Konsentrasjonen av andre fosfoglyserider har ikke blitt målt. Det er viktig å vurdere at omsetningen av LPA og /eller andre fosfoglyserider kan være like viktig som deres absolutte konsentrasjon.
Sammen dataene presentert her indikerer at tapet av LPP1 skaper et miljø som er tilstrekkelig til å understøtte tumorvekst . Eksogen tilførsel av høyere konsentrasjoner av LPA var i stand til å overvinne den hemmende miljø for å stimulere svulstvekst og minske apoptose demonstrere at LPA stimulerer tumorcellevekst uavhengig av eventuelle potensielle negative effekter skapt av tap av LPP1 uttrykk. Ytterligere undersøkelser av mekanismer (herunder potensielle cellulære mål) som er ansvarlige for nedsatt tumorvekst i fravær av LPP1 vil gi ytterligere viktig informasjon angående virkningene av fosfoglyserider og deres metabolisme på tumormikromiljøet, så vel som komponenter i mikromiljøet som kan være viktig i fremme eggstokkreft progresjon.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 fig. Karakterisering av svulster og VCAM-1 uttrykk i LPP1 KO og villtype mus 2 uker etter startfasen. Product: (A) Kjertler ble fjernet og veid 2 uker etter startfasen fra villtype og LPP1 KO mus. Hvert punkt indikerer en enkeltperson, og dataene representerer gjennomsnittet ± std feile. (B) H pilspisser indikerer svulst. Ikke-invasive tumorer ble karakterisert som å ha en glatt grenseflate mellom tumor og underliggende vev. Invasive svulster ble scoret som de spidering gjennom og ta over det underliggende vevet, i dette tilfellet, omentfettet. (C) Kjertler fra villtype (topplaten) og LPP1 KO (nedre panel) mus ble oppnådd 2 uker etter startfasen og farget for VCAM-1 uttrykk ved hjelp IHC (se Materialer og metoder). Representative bilder skildrer mesothelium (piler) og positive VCAM-1 farging (pilspisser) i LPP1 KO mus med mangel på VCAM-en reaktivitet på mesothelium av villtype mus
doi:. 10,1371 /journal.pone.0120071 .s001 product: (TIF)
S2 fig. . Representative bilder av matrigel pluggen analysen
representative bilder av CD31 positive skip (angitt med piler) i Matrigel plugger som inneholder betinget media fra ID8ip2Luc celler (A) eller FGF /VEGF (B) er vist
doi:. 10,1371 /journal.pone.0120071.s002 product: (TIF)
