Abstract
I løpet av kjemoterapi, resistens forårsaket av autofagi er fortsatt en stor utfordring for vellykket behandling av kreftpasienter. Hensikten med denne studien er å vise at ulinastatin (UVI), en trypsin inhibitor, kan redusere motstanden i leveren kreftceller til kjemoterapeutisk middel epirubicin (EPI). Vi oppnådde denne konklusjonen ved å analysere effekten av EPI alene eller UTI pluss EPI på SMMC-7721 og mhcc-LM3 lever kreftceller. Vi har også generert en EPI-resistente leverkreft cellelinje (mhcc-LM3er celler), og fant ut at UTI kan bevisstgjøre de LM3er celler til EPI. Autofagi fungerer vanligvis for å beskytte kreftceller under kjemoterapi. Vår studie viste at UTI hemmet autofagi indusert av EPI i leverkreftceller, som fremmet apoptose, og derfor reduserte motstanden i kreftcellene til EPI. Videre undersøkelser viste at UTI-mediert inhibering på autofagi ble oppnådd ved å hemme transkripsjonen faktor nukleær faktor-kB (NF-kB) signalveien. Hvis du vil kontrollere våre resultater in vivo, injisert vi mhcc-LM3 leverkreftceller eller EPI-resistente LM3er celler i mus, og fant ut at EPI kan bare effektivt hemmer veksten av svulsten i mhcc-LM3 celle-injisert mus, men ikke i LM3er celle -injected mus. Imidlertid, når UTI ble også administrert, veksten av tumoren ble inhibert i de mhcc-LM3er celle-injiserte mus i tillegg. Våre resultater tyder på at UTI kan bli anvendt i kombinasjon med anti-kreft medikamenter, såsom EPI, for å forbedre resultatet av kreftterapi
relasjon:. Song B, Bian Q, Shao CH, Li G, Liu AA , Jing W, et al. (2015) Ulinastatin Reduserer Resistance of Liver kreftceller til å Epirubicin ved å hemme Autophagy. PLoS ONE 10 (3): e0120694. doi: 10,1371 /journal.pone.0120694
Academic Redaktør: Ying-Jan Wang, National Cheng Kung University, TAIWAN
mottatt: 27 september 2014; Godkjent: 26 januar 2015; Publisert: 27 mars 2015
Copyright: © 2015 Song et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
finansiering:.. forfatterne fikk ingen spesifikke midler til dette arbeidet
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Autophagy er en viktig cellulær prosess ansvarlig for degradering av skadde og dysfunksjonelle cellulære organeller og protein aggregater. Dette er en prosess konservert blant gjær, plante og dyreceller, og er viktig for å tilveiebringe energikilder som reaksjon på nærings stress og på kritiske tidspunkt i utviklingen [1]. Generelt er autophagy et tumor-undertrykkelse mekanisme i normale celler og i løpet av tidlig onkogene transformasjon, men kan også fungere som en kritisk overlevelsesreaksjonsveien for etablerte tumorer. Utvikling og etablerte svulster har høye metabolske krav som følge av økt spredning og høye apoptotiske terskler. I dette tilfelle tjener autophagy som en mekanisme for å overleve i mange tumorceller, slik at de kan unnslippe apoptotisk død som følge av metabolsk krise. Mange anti-kreft medikamenter er utviklet for å etterligne kjemisk næringsmangel og sult, men autophagy ofte er oppregulert i respons til behandlingen ved å fjerne den skadede organ å unnslippe død, og derfor frembringer terapeutiske motstand [2-4]. Det er blitt vist at ved å øke produksjonen av reaktive oksygenarter i mitokondriene, kjemoterapeutiske midler slik som histondeacetylase inhibitorer [5] og cisplatin [6] tale autophagy, og i mange tilfeller er det autophagic respons til disse behandlingene CYTO-beskyttende [ ,,,0],5]. Nylig har det blitt foreslått at ved å kombinere med midler som forstyrrer autophagy, kan effekten av anti-kreft legemiddel økes [5].
Ulinastatin (UTI) er et glykoprotein som inneholder glykosaminoglykaner og N-bundne glykaner . Det hemmer aktivitetene til et bredt spekter av enzymer, inkludert trypsin, chymo-trypsin, kallikrein, plasmin, etc [7]. Klinisk er UTI i hovedsak brukes til å behandle akutt pankreatitt, kronisk residiverende pankreatitt og akutt sirkulasjonssvikt [8, 9]. Nyere studier har vist at UTI hemmer veksten av mange typer kreft, inkludert gastrointestinal kreft og brystkreft, og kan indusere celledød hvis det brukes sammen med andre terapeutiske midler [10-12]. I våre foreløpige undersøkelser, ble UTI funnet å ha hemmende effekt på autofagi. Siden autofagi spiller en viktig rolle i legemiddelresistens i mange typer kreftceller [13, 14], vi derfor en hypotese at UTI kan redusere legemiddelresistens i kreftceller ved å hemme autofagi.
Epirubicin (EPI) er et antracyklin medikament mye brukt i cancerkjemoterapi [15]. Det oppnår behandlingen ved å indusere apoptose i kreftceller. Imidlertid, i det minste i MCF-7 brystkreftceller, EPI induserer også autofagi som beskytter kreftcellene ved å forårsake resistens [15]. I denne studien undersøkte vi effekten av UTI på autophagy indusert ved EPI i leverkreftceller. Vi genererte en EPI-resistente leverkreft cellelinjer (mhcc-LM3er celler) og studert reguleringen av autophagy i disse cellene. Vi har også studert virkningen av UTI på autophagy og medikamentresistens hos disse kreftceller, og bekreftet resultatene in vivo. Det er blitt funnet at UTI trykkes autofagi indusert av EPI, som ble oppnådd ved å inhibere transkripsjonsfaktor nukleær faktor-kB (NF-kB) signalveien. Våre data antyder at UTI kan anvendes som et terapeutisk middel for å hjelpe til behandling av kreft ved å redusere legemiddelresistens i cancerceller.
Materialer og metoder
antistoff, cellelinjer, plasmider og andre materialer
mus anti ACTB, kanin anti p-IKKα, p-Nemo antistoffer (Santa Cruz, USA) ble brukt på 1: 200 fortynning. Kanin anti LC3, mus anti IKKα, mus anti Nemo, og kanin anti PARP, ATG5, ATG7, SQSTM1, BECN1 antistoffer (cellesignalisering, USA) ble brukt på 1: 1000 fortynning. HRP-merket kanin anti mus EnVision merkeordning var fra Shanghai Changdao Biotech Inc.
Leveren kreft cellelinjer SMMC-7721 og mhcc-LM3, og normale leverceller var gaver fra Second Military Medical University, Shanghai. PcDNA3.1-GFP-LC3 ble hentet fra Øst Hepatobiliær Surgery Hospital, Second Military Medical University, Kina. De kreftcellelinjer som brukes i studien ble kjøpt fra Cell Bank of Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences, Shanghai Institute of Cell Biology, Chinese Academy of Sciences, hvor de ble preget av cellen vitalitet deteksjon, DNA-fingerprinting, isoenzym deteksjon og mycoplasma deteksjon. Disse cellelinjene ble umiddelbart utvidet og frosset, slik at de kan startes på nytt hver 3 til 4 måneder fra en frossen hetteglass med samme batch av celler.
EPI (Eastern Hepatobiliær Surgery Hospital, Second Military Medical University, Kina) ble anvendt ved en konsentrasjon på 2,5 uM. UTI (Techpool Bio-Pharma, Guangdong, Kina) ble brukt ved konsentrasjonen av 1000 u /ml. Pyrrolidin ditiokarbamat (PDTC) (Beyotime Inc., Shanghai) ble anvendt ved en konsentrasjon på 10 uM. Klorokin (CQ, 10 pM) og 3-metyladenin (3-MA, 10 mM) (Sigma-Aldrich, USA) ble anvendt for hemning av autophagy. Musene ble vedlikeholdt og ivaretatt i henhold til universitetets retningslinjer og bruk av dyr protokoller ble godkjent av etikk Styrene i Surgery Hospital Øst Hepatobiliær.
Cell Culture, Transfeksjon, cellevekst Fastsettelse og generasjon av multiresistent mhcc-LM3 cellelinje
Alle leverkreftceller ble dyrket i DMEM med 10% FBS ved 37 ° C i en 7% CO
2 inkubator, og transfektert med Lipo2000 (Genechem Inc., Korea) ved samløpet av 60-70%. Cellevekst ble bestemt med en MTS kit (Promega, USA) ved å følge produsentens anvisninger. Resistent mhcc-LM3 cellelinjen ble generert som beskrevet tidligere [15]. Kort sagt ble mhcc-LM3-celler sådd ut i kulturflasker og fikk lov til å nå ~ 80% konfluens i friskt medium før den ble behandlet med EPI. Startdosen av EPI var 0,05 mikrometer, og hver følgende dose var 25-50% høyere i konsentrasjon enn forrige dose før cellene var stabile i spredning uten betydelig celledød.
Real-time PCR
Total RNA ble ekstrahert med RNeasy Mini kit og QIAshredder (Qiagen), og den første tråd cDNA ble syntetisert med First-Strand cDNA Synthesis Kit (Abigen Bioteknologi Co Ltd) ved å følge produsentens instruksjoner. Real-time PCR ble utført med LightCycler 1.5 (Roche) ved å følge produsentens protokoll, og de følgende primere ble brukt: for Beclin1: 5′-GGCTGAGGGATGGAAGGGTCTAAG-3 «og 5′-GTTTCGCCTGGGCTGTGGTAAGTA-3′; for Atg5: 5»-ATGACAGATGACAAAGATG-3 «og 5′-CTCATAACCTTCTGAAAGTG-3′; for At g7: 5»-ATGGGGGACCCTGGACTGG-3 «og 5′-GCAGAGTCACCATTGTAG-3′; for P62: 5»-ACTGATGGCTGTAACGGTCTA-3 «og 5′-GGAAGCAGATGGCACAGAGG-3′; og for GAPDH.: 5»-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 «og 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3»
Apoptose-analysen
cellene vasket med kald PBS ble re-suspendert i bindingsbuffer (Beyotime Inc. , Shanghai, Kina) og deretter supplert med 2 ul Annexin-V-FITC (20 mikrogram /ml) før de ble analysert ved flowcytometri.
autofagi Analyser
Celler på 70-80% samløpet ble transfektert med pcDNA3.1-GFP-LC3 med Lipo2000. Cellene ble deretter observert i henhold til fluorescens mikroskop og cellene med minst 3 grønne punkter ble vurdert autophagic celler. Prosentandelen av autofagi = autophagic celler /totale celler x 100%. For observasjon under elektronmikroskop, ble cellene vasket med PBS pelletert og cellepelleten ble løst i 2,5% glutardialdehyd og 1% osmic syre i 2 timer. Etter vask, pelleten ble dehydrert og innstøpt i epoksyharpiks. De ultra-tynne seksjoner (45 nm) ble farget med bly acetate, og de fargede seksjonene ble observert etter JEM-2000EX elektronmikroskop [16]. For å overvåke autophagic fluks, ble tandem mRFP-GFP-LC3 adenovirus-konstruksjonen oppnådd fra Hanbio Inc (Shanghai, Kina) anvendt i denne studien. Den viste grønt fluorescerende protein (GFP) og rød fluorescerende protein (RRP) avhengig av forskjellig følsomhet for pH å overvåke progresjon fra autophagic forandring. I korte trekk, mRFP-GFP-LC3 konstruere kapitalisert på pH forskjellen mellom det sure autolysosome og den nøytrale autophagosome å overvåke progresjon fra autophagosome til autolysosome ved hjelp konfokalmikroskopi [17].
Xenotransplantat i Nude Mice
Herre nakne mus (4-6 uker gamle og 15-20 g i vekt, kjøpt fra Institute of Material Medical Shanghai, Chinese Academy of Medical Sciences) ble opprettholdt ved 25 ~ 27 ° C med 45 ~ 50% luftfuktighet . Nakne mus ble opprettholdt og ivaretatt i henhold til universitetets retningslinjer og bruk av dyr protokoller ble godkjent av etikk Styrene i Surgery Hospital Øst Hepatobiliær. Mhcc-LM3-celler og mhcc-LM3er medikamentresistente celler ble høstet og resuspendert i PBS til 5 x 10
6 celler /0,2 ml PBS. For hver mus ble 200 ul av cellesuspensjonen injiseres under huden på høyre skulder. EPI (5 mg /kg) og UTI (20000 /mus) ble injisert inn i svulsten etter 3 days.30 dager senere ble musene avlivet for videre forskning. Tumorstørrelser ble beregnet ved hjelp av formelen V = ab
2/2 (a: lengste diameter av svulsten, b: korteste diameter)
RESULTATER
UTI hemmer Autophagy Induced. ved EPI
EPI har blitt rapportert å indusere autofagi i brystkreftceller og forårsaker resistens [15]. Å Verity om den har lignende effekt i lever kreftceller, behandlet vi SMMC-7721 celler med EPI ved forskjellige konsentrasjoner for å fastslå omfanget som EPI kan effektivt indusere autofagi [15, 18]. Som vist i figur 1A, økt autophagy i en EPI konsentrasjonsavhengig måte. Ut fra dette resultatet, valgte vi en moderat konsentrasjon på 2,5 uM for etterfølgende studier. Deretter sjekket vi at om EPI indusert autofagi i andre leverkreftceller. EPI kan betydelig forbedre autofagi i SMMC-7721, Huh-7 og HCC-LM3 celler og mildt i 97h celler (fig 1b). Det har vist seg at CQ kunne hemme infusjon av autophagosomes og lysosomer, noe som resulterer i akkumulering av autophagosomes og LC3-II-ekspresjon. I mellomtiden, hemmer 3-MA klasse I, så vel som klasse III-PtdIns3Ks, noe som er nødvendig for dannelsen autophagosomes [16]. Med de to autofagi hemmere validert vi at EPI kunne forbedre hele autofagi prosessen, inkludert autophagosomes og autolysosomes dannelse (Fig 1 C). Deretter ønsket vi å vite om EPI-indusert autofagi kan bli hemmet av UVI. For dette formål, behandlet vi SMMC-7721 og mhcc-LM3 celler med EPI eller EPI + UTI, økningen av LC3-II og reduksjon av SQSTM1 ble betydelig inhibert av EPI + UTI behandling, noe som tyder på at EPI-indusert autofagi ble hemmet av tilsetning av UTI (fig 1 D). Dette resultatet ble også støttet av den observasjon at ATG7, ATG5 og BECN1 uttrykk redusert og SQSTM1 uttrykk økt både på mRNA-nivå (Fig 1E) og proteinnivå (figur 1F) i celler som blir behandlet med EPI + UTI sammenligne med cellene blir behandlet med EPI alene. I cellene transfektert med pcDNA3.1-GFP-LC3, uttrykket av GFP-LC3 (grønne prikker) ble også betydelig redusert i cellene som blir behandlet med EPI + UTI sammenligne med det i cellene blir behandlet med EPI alene (Fig 1G ). Videre sammenligning med cellene blir behandlet med EPI, mengden av autophagic vesikler i celler som behandles med EPI + UTI er også redusert betydelig som observeres i henhold til elektronmikroskop (Fig 1 H). For å bekrefte funksjonen til UTI på autophagic flux videre, sjekker vi antall autophagosomes og autolysosomes i mhcc-LM3 celler behandlet med enten EPI eller EPI + UTI, UTI kunne redusere autophgic fluks (Fig 1I). Sammen utgjør disse resultatene sterkt at UTI inhiberer EPI-indusert autophagy i leverkreftceller.
(A) Ekspresjon av LC3-II ble påvist i lysater av SMMC-7721-celler behandlet med forskjellige doser av EPI. (B) Den LC3 nivået ble påvist i forskjellige leverkreftceller behandlet med EPI (2.5μM) eller ikke i 24 timer. (C) Western blot viste nivået på LC3-II på SMMC-7721-celler behandlet med EPI (2.5μM) med /uten CQ (10 uM) /3-MA (10 mM) ved forskjellige tidspunkter. (D) indikerte molekyler ble oppdaget med immunoblotter i SMMC-7721 og mhcc-LM3 celler behandlet med EPI /EPI + UTI for angitte tider. (E) Real-time PCR viser mRNA nivåer av autofagi relaterte gener i mhcc-LM3 og SMMC-7721 celler behandlet med EPI eller EPI + UTI. (F) Western blot viser protein nivåer av autofagi relaterte gener i mhcc-LM3 og SMMC-7721 celler behandlet med EPI /EPI + UTI i 24 timer. (G) EPI /EPI + UTI ble lagt til mhcc-LM3 celler i 24 timer etter at GFP-LC3 transfeksjon. Øvre panel, GFP-LC3 flekker; nedre panel, graf viser brøkdel av autophagic celler. (H) elektronmikroskop av autophagic vesikler i mhcc-LM3 celler behandlet med EPI + EPI + UTI. Den forstørrede høyoppløselige bilder av de firkantede områder ble vist. (I) mhcc-LM3 celler infisert med GFP-mRFP-LC3 adenovirus for 24 timer, deretter behandlet withEPI /EPI + UTI. Representative bilder og grafer ble vist. Forsøket ble gjentatt 3 ganger. (* P 0,05, ** P 0,01).
UTI Fremmer apoptose indusert av EPI
Som en kjemoterapi narkotika, EPI eliminerer kreftceller ved å indusere apoptose [19]. Siden vi har vist at UTI hemmer autofagi indusert av EPI, mistenker vi at UTI kan også fremme kreft apoptose i disse cellene. For å finne ut om UTI har noen effekt på apoptose indusert av EPI, vi først sjekket om kombinasjonen av EPI og UTI kan føre til toksisk effekt på normale leverceller. Som vist i figur 2A, var det ingen signifikant forskjell i Overlevende hastigheter mellom EPI gruppe og EPI + UTI gruppe, noe som tyder på at EPI + UTI ikke ville føre til mer celledød på normale leverceller. Deretter undersøkte vi hvor mye de SMMC-7721 og mhcc-LM3 lever kreftceller behandlet med EPI eller EPI + UTI, og funnet ut at celle tallene ble betydelig redusert hvis begge EPI og UTI ble tilsatt (figur 2B). Spaltingen av PARP, en indikator på apoptose, ble også forbedret i celler behandlet med EPI + UTI sammenligne med det i cellene behandlet med EPI alene (figur 2C). Videre er behandling med EPI + UTI resulterte i redusert nivå av apoptose inhibitor Bcl-2 og øket spaltning av caspase-3 (figur 2D). I støttende av dette resultat, Annexin V farging viste at prosentandelen av celler som gjennomgikk apoptose var høyere i celler behandlet med EPI + UTI (figur 2E). Samlet utgjør disse resultatene sterkeste at UTI fremmer apoptose når den brukes i kombinasjon med EPI, og kan potensielt øke effektiviteten av EPI i kreftbehandling.
(A) Prosent av overlevende L02 celler behandlet med EPI /EPI + UTI /UTI. (B) Prosent av overlevende SMMC-7721 og mhcc-LM3 lever kreftceller under behandlingen av EPI /EPI + UVI /UTI for angitte tider. (C, D) Western blot av angitte molekyler ble vist i SMMC-7721 og MHCC- LM3 lever kreftceller under behandlingen av EPI /EPI + UTI (behandling i D for 24 timer). ACTB ble utslettet som en lasting kontroll. (E) Annexin V-farging viser prosentandelen av celler som gjennomgikk apoptose under behandlingen av EPI /EPI + UTI for angitte tidspunkter. Venstre panel var gjennomsnittlig resultat av 3 eksperimenter; panel høyre var representativt resultat. Resultatene er gjennomsnitt på 3 uavhengige eksperimenter, (* P 0,05, ** P 0,01).
UTI Fremmer EPI-indusert apoptose i Liver Cancer Cell ved å hemme Autophagy
Autophagy spiller uunnværlig beskyttende roller i EPI-indusert celledød i kreftceller [15, 20]. Å vite at UTI fremmer apoptose indusert av EPI, ønsket vi å vite om dette ble oppnådd ved å hemme autofagi som også ble indusert av EPI. For dette formål genererte vi en EPI-resistent cellelinje LM3er ved å anvende en lav dose EPI til cellekulturmedium over en tidsperiode (se Materialer og Metoder). Til både mhcc-LM3er celler og de ikke EPI-resistente (mhcc-LM3) kontrollceller, la vi EPI og fant at antall overlevende mhcc-LM3er celler var større enn de mhcc-LM3 celler, og færre MHCC- LM3er celler gjennomgikk apoptose enn kontrollcellene (figur 3A). Dette resultatet viste at EPI-resistente celler (mhcc-LM3er) ble bedre beskyttet mot EPI-indusert apoptose. For å finne ut om motstanden mot EPI skyldes økt autophagic aktivitet i mhcc-LM3er celler, undersøkte vi basal uttrykk for flere autofagi markører og fant at i mhcc-LM3er cellene, mRNA nivåer av ATG7, ATG5 og BECN1 var høyere enn at i kontrollceller (fig 3b). Vi har også undersøkt den basale nivåer av flere Autophagy-relaterte proteiner, og fant at nivåene av LC3-II, ATG7, ATG5 og BECN1 økt i mhcc-LM3er celler i tillegg, mens nivået av SQSTM1 redusert (figur 3C). Fluorescens mikroskopi viste også at å sammenligne med kontrollcellene, det var flere autophagic celler i mhcc-LM3er gruppe (Fig 3D). Videre under elektronmikroskop, fant vi flere autophagic vesikler i mhcc-LM3er celler (figur 3E). Følgelig antyder disse resultatene at EPI-resistente mhcc-LM3er celler har høyere basal autophagic aktivitet enn den i kontrollcellene. Videre fant vi at mhcc-LM3er celler kunne motstå å EPI-indusert celledød sammenligner med mhcc-LM3 celler, og hemming av autofagi med 3-MA kan fullstendig blokkere motstanden mhcc-LM3er celler til EPI. De tilsvarende resultater ble også oppnådd når UTI ble anvendt (figur 3F og 3G). Dette resultatet tyder på det sterkeste at UTI fremmer EPI-indusert apoptose i leveren kreftceller ved å hemme autofagi.
(A) Andel overlevende mhcc-LM3 og LM3er celler under behandling av EPI. Nedre panel viser prosentandelen av Annexin V-positive mhcc-LM3 eller mhcc-LM3er celler. (B) Real-time PCR viste mRNA nivåer av ATG5, ATG7 og BECN1 i mhcc-LM3 og mhcc-LM3er celler. (C) Western blot av LC3-I, LC3-II, ATG7, ATG5, BECN1 og SQSTM1 i LM3 og LM3er celler. ACTB var en lasting kontroll. (D) GFP-LC3 prikker i mhcc-LM3 og LM3er celler. Øvre panel, immunfluorescens mikroskopi viste representative bildet av GFP-LC3 prikker, og nedre panel var brøkdel av autophagic celler i mhcc-LM3 eller mhcc-LM3er celler. (E) elektronmikroskop av autophagic vesikler i mhcc-LM3 og LM3er celler. Den forstørrede høyoppløselige bilder av de firkantede områder ble vist. (F) Prosent av overlevende (øvre panel) og annexin V-positive celler (nedre panel) i mhcc-LM3 og LM3er celler under behandling av EPI /EPI + 3-MA eller EPI /EPI + UTI. Resultatene er gjennomsnitt på 3 uavhengige eksperimenter (* P 0,05, ** P 0,01).
UTI Regulerer Autophagy ved å hemme NF-kB signalveien
NF-kB signalveien positivt regulerer autophagy [14, 21, 22]. UTI kunne hemme aktiveringen NF-kB signalveien [23, 24]. Vi har derfor spekulert i at UTI kan hemme autofagi i leveren kreftceller ved å undertrykke NF-kB signalveien. For å teste denne hypotesen, behandlet vi SMMC-7721 og mhcc-LM3 celler med EPI alene eller EPI + UTI, og funnet at aktiviteten av NF-kB ble undertrykt i UTI supplert celler (figur 4A). Dette resultatet ble støttet ved hemming på fosforyleringen av IKK-α og Nemo (figur 4B). Videre har vi funnet at tilsetning av PDTC, en inhibitor av NF-kB signalveien, for å mhcc-LM3-celler inhiberte fosforyleringen av IKK-α og ekspresjon av LC3-II (figur 4C). Disse resultatene tyder på at UTI hemmer autofagi ved å undertrykke NF-kB signalveien. For å finne ut om tilsetting av narkotika, UTI eller PDTC, fremmet epirubicin-indusert apoptose i leveren kreftceller, la vi EPI, EPI + UTI, EPI + PDTC, eller EPI + UTI + PDTC til SMMC-7721 og mhcc -LM3 lever kreftceller, og observert tilsvarende andel overlevende celler i EPI + UTI, EPI + PDTC eller EPI + UTI + PDTC supplert celler. Spesielt var det ingen ekstra effekt på celledød hvis begge UTI og PDTC er lagt til, noe som tyder på at både UTI og PDTC fremme apoptose i en samme mekanisme, som er å hemme NF-kB signalveien regulerte autofagi (Fig 4D og 4E) .
(A) den relative NF-kB aktivitet i SMMC-7721 og mhcc-LM3 celler under behandling av EPI /EPI + UTI i 24 timer. (B) Western-blots av p-IKK a- og p-Nemo sammenlignet med totale proteininnhold på ikk alfa og Nemo, henholdsvis i SMMC-7721 og mhcc-LM3 leverkreftceller under behandlingen av EPI /EPI + UTI for 24 hr. ACTB er en lasting kontroll. (C) Western blot av p-IKK alpha, total IKK alpha, LC3-I og LC3-II i mhcc-LM3 celler under behandling av EPI /EPI + UVI /EPI + PDTC for 24 timer (D, E) Prosent av overlevende (D) og annexin V-positive celler (E) i SMMC-7721 og mhcc-LM3 celler under behandling av EPI /EPI + UVI /EPI + PDTC /EPI + UTI + PDTC i 24 timer. Resultatene er gjennomsnittet av 3 uavhengige eksperimenter (* P 0,05, ** P 0,01)
UTI også fremmer apoptose ved å hemme NF-kB signalveien-indusert Autophagy i Vivo
for å bevise vår ovenfor resultat in vivo, injisert vi mhcc-LM3 eller EPI-resistente mhcc-LM3er celler under huden på mus (n = 6), og fant at inntak av EPI kan hemme veksten av svulsten i mhcc-LM3 celle-injisert mus, men i mindre grad i mhcc-LM3er celle-injisert mus. Men når UTI ble administrert, tumorvekst i mhcc-LM3er celle-injiserte mus ble hemmet, og veksten var lik som i mhcc-LM3 celle-injiserte mus (Fig 5A og 5B). For å finne ut om UTI hemmet NF-kB signalveien in vivo, vi administreres EPI alene eller EPI + UTI til musene og analysert aktiviteten av NF-kB signalveien i svulstene. Det ble funnet at sammenlignet med kontrollmus, nivået på LC3-II, og de phosphorylations av IKKα og Nemo ble alle redusert i tumorene hos mus administrert med både EPI + UTI, noe som indikerer inhibering av NF-kB signalveien (fig 5C og 5D). Dette resultatet tyder på at UTI fremmer apoptose ved å inhibere NF-kB signalveien regulerte autophagy in vivo.
(A, B) Tumor-størrelse (A) og tumorvekst kurve (B) fra mus xenopodet med mhcc-LM3 eller mhcc-LM3er celler (n = 6) som ble behandlet med EPI /EPI + UTI. Vekstkurve ble oppnådd fra flere målinger av forskjellige mus i den samme gruppe. (C) Histoimmunochemical analyse viser uttrykket av p-IKKα og p-Nemo i xenograft mus under behandling av EPI /EPI + UTI. (D) Western blot av p-IKKα og p-Nemo i prøver fra xenograft mus under behandling av EPI /EPI + UTI. ACTB er en lasting kontroll. Resultatene er gjennomsnittet av 3 uavhengige eksperimenter (* P 0,05, ** P 0,01).
DISKUSJON
Uansett krefttype, forblir legemiddelresistens en stor utfordring å lykkes kjemoterapeutisk behandling av kreftpasienter [25]. Det er helt klart viktig å identifisere og utvikle nye terapeutiske strategier for å forbedre utfallet av kreftbehandling. Autophagy er et tveegget sverd i kreft, den fungerer som både anti- og pro-kreft mekanismer [26]. I leverkreft, kan autofagi beskytte leveren ved å undertrykke betennelse, vevsskade og genom instabilitet å hemme kreft initiering; på den annen side er det nødvendig for kreftcelleoverlevelse og kreftutvikling [26]. Mange nåværende cancer-terapier, inkludert kjemoterapi og strålingsterapi, pålegge metabolsk stress på kreftceller og induserer autophagy, som i sin tur beskytter cellene mot apoptose og forårsake medikamentresistens. Derfor kan bruk av autophagic inhibitorer i kombinasjon med terapeutiske midler spesielt forbedre den terapeutiske effekt [25, 27].
UTI er en viktig inhibitor overfor trypsin, og nylige studier har vist at den fungerer med andre kjemoterapeutiske midler for å fremme apoptose, hvilket resulterer i hemning av tumorvekst i det minste delvis på grunn av sin hemmende virkning på mange signalbaner som er involvert i veksten [10, 11, 28-30]. I våre foreløpige undersøkelser, fant vi at UTI var inhibitor til autofagi, og derfor en hypotese om at det kan også forbedre kreftbehandling ved å hemme autofagi og redusere motstand mot cellegifter i kreftceller. Ja, våre data viser at i leverkreftceller, UTI hemmet heving av autophagy indusert av EPI, et mye brukt kreft kjemoterapeutisk stoff. Når det ble brukt i kombinasjon med EPI, UTI fremmet apoptose i cellene. Dette resultatet antydet at i leverkreftceller, UTI alene hadde minimal effekt på celleproliferasjon, men når det ble brukt sammen med EPI, den forbedrede EPI-indusert apoptose, mest sannsynlig ved å hemme autofagi (figur 2B). Dette resultatet ble også støttet av den observasjon at i EPI-resistente celler, UTI var i stand til å effektivt bevisst cellene til EPI ved å hemme autofagi (fig 3).
Siden NF-kB er rapportert å positivt regulere autofagi, vi testet om UTI hemmet autofagi ved å undertrykke NF-kB signalveien. Våre resultater viste at tilsetningen av både EPI og UTI til leverkreftceller i betydelig grad hemmet NF-kB luciferase-aktivitet, og redusert fosforylering av IKK-α og Nemo har et resultat også blitt bekreftet av in vivo studier. Disse resultatene antyder sterkt at NF-kB signalveien er sperret når både EPI og UTI er brukt. For å bevise at undertrykkelsen av NF-kB signalveien ville føre til hemming av autophagy, inhiberte vi NF-kB signalveien ved å tilsette PDTC, en kjent inhibitor av NF-kB signalveien, til cellene sammen med EPI, og observert inhibering av autophagy som forventet. Dette resultatet støtter den hypotese at som PDTC, kan UTI hemme autofagi ved å hemme NF-kB signalveien. For ytterligere å bevise at både UTI og PDTC handlet på samme signalveien, snarere enn arbeidet uavhengig å regulere apoptose, la vi både PDTC og UTI sammen med EPI til kreftceller, men ikke observere noen ytterligere økning av apoptose aktivitet. Dette resultatet støtter den konklusjon at UTI og PDTC ikke jobber sammen, og UTI alene var like effektivt som PDTC i hemme NF-kB signalveien for å fremme apoptose.
Autophagy-indusert resistens i kreftceller har vært en utfordring å kreftbehandling [31]. Anti-autofagi strategier har blitt brukt i mange kliniske studier som er registrert med National Cancer Institute i USA i en rekke av kreft hos mennesker [32]. Men CQ eller HCQ (Hydroksyklorokin) ble brukt til å hemme infusjon av autophagosomes og lysosomene i de fleste kliniske studier, har bruk av andre autofagi hemmere som kan begrense dannelsen av autophagosomes i kliniske studier ikke blitt rapportert. UTI har vært brukt for behandling av andre sykdommer slik som akutt pankreatitt, og resultatene har vist at UTI kunne inhibere EPI-indusert autofagi og fremme apoptose i cancerterapi, mest sannsynlig ved å inhibere NF-kB signalveien. EPI er et mye brukt kjemoterapi mot kreft agent, men det kan også føre til resistens ved å fremkalle autofagi. Våre funn antyder at UTI kan bli anvendt i kombinasjon med anti-kreftlegemidler som EPI for å forbedre resultatet av kreftterapi. I tillegg kan resultatene også kaste lys på anvendelse av UTI i andre kliniske felt.
