Abstract
tioredoksinreduktase 1 (TR1) er en stor redoks regulator i pattedyrceller. Som en viktig antioksydant selenoprotein er TR1 antatt å delta i å forebygge kreft, men er også kjent å være overuttrykt i mange kreftceller. Tallrike kreftlegemidler hemme TR1, og dette proteinet har blitt foreslått som et mål for cancerterapi. Vi har tidligere rapportert at reduksjon av TR1 nivåer i kreftceller snudd mange maligne egenskaper som tyder på at mangel på TR1 funksjon er antitumorigenic. Den molekylære basis for TR1 rolle i utviklingen av kreft, men er ikke forstått. Heri, har vi funnet at blant selenoproteins er TR1 entydig overuttrykt i kreftceller og dens knockdown i en musecancercellelinje som drives av onkogene
K-ras
ført til morfologiske forandringer som er karakteristiske for foreldre (normal) celler, uten signifikant effekt på cellevekst under normale vekstbetingelser. Når vokst i serum-mangelfull medium, TR1 mangelkreftceller mister selvforsyning av vekst, manifestere en defekt progresjon i sin S-fasen og en redusert uttrykk av DNA polymerase α, et enzym viktig i DNA replikasjon. Disse observasjonene gir bevis for at TR1 er avgjørende for selvforsyning i vekstsignaler av ondartede celler, som TR1 fungerer i stor grad som en pro-kreft protein, og det er faktisk en primære målet i kreftbehandling
Citation. Yoo MH Xu XM, Carlson BA, Patterson AD, Gladyshev VN, Hatfield DL (2007) Targeting tioredoksinreduktase en reduksjon i kreftceller Hemmer selvforsynt Vekst og DNA replikering. PLoS ONE 2 (10): e1112. doi: 10,1371 /journal.pone.0001112
Academic Redaktør: Mikhail Blagosklonny, Ordway Research Institute, USA
mottatt: 25 september 2007; Akseptert: 12. oktober, 2007; Publisert: 31 oktober 2007
Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Public Domain erklæring som fastslår at en gang plassert i det offentlige rom, dette arbeidet kan fritt kopieres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av egenutført Research Program av National Institutes of Health, National Cancer Institute, Senter for Cancer Research, og ved NIH tilskudd CA080946 og GM065204 til VNG. ADP ble sponset av PRAT Fellowship, NIGMS, NIH
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kost selen har potente kreftforebygging aktivitet [1] og både selen-inneholdende proteiner (selenoproteins) [2,3 og referanser deri] og lavmolekylære selenholdige forbindelser (selenocompounds) [2 og referanser deri] har vært implisert i denne aktiviteten. Den store rolle selen i å gi helsemessige fordeler er sannsynlig gjennom handling av selenoproteins [1]. Tioredoksinreduktase 1 (TR1) er en av 24 kjente selenoproteins i gnagere [4], er en viktig antioksydant og redoks-regulator i pattedyrceller [5,6 og referanser deri], og har en viktig rolle i utvikling pattedyr [7]. Imidlertid synes dette enzymet for å ha motsatte virkninger i kreftutvikling som det har blitt implisert i kreft både forebygging [8] og kreft fremme [9] – [12]. For eksempel støtter TR1 p53-funksjon og har andre tumor suppressor aktiviteter, og satsingen ved kreftfremkallende, elektro forbindelser argumentere for sin rolle i kreftforebygging [13]. Alternativt blir TR1 overuttrykt i mange kreftceller [9] – [12] og dens inhibering av en rekke potente kreftlegemidler endrede kreft-relaterte egenskaper av mange tumorer og ondartede celler tyder på at dette enzymet er et mål for cancerterapi [9] -. [12], [14], [15]
Det er ikke klart om TR1 kreft-forebygge eller kreftfrembringende egenskaper større innflytelse på kreft, enten disse kontrasterende effekter operere samtidig eller er spesifikke for forskjellige stadier av kreftutvikling, og hvordan disse egenskaper kan utnyttes i kreft forebygging og /eller terapi. For å løse disse problemene, vi først undersøkt hvilken rolle TR1 i en mus lungekreft cellelinje og en mus dyremodell og observert at reduksjon av TR1 nivåer snudd mange maligne egenskaper, inkludert tumorigenecity [16]. Heri, undersøkte vi TR1 funksjon og rolle i kreftutvikling i en ondartet musecellelinje som den tilsvarende foreldre (normal) cellelinje var tilgjengelig, og ytterligere bekreftet funnene i flere humane kreftcellelinjer.
Resultater
Generering av de ondartede og foreldrecellelinjer og analyse av deres TR1 nivåer sammen med flere kreft menneskelige cellelinjer
DT celler, som koder onkogene
k-ras product: [17] , [18], og foreldre NIH3T3 (kontroll) celler ble merket med
75Se, og de resulterende proteinekstrakter elektroforese for å undersøke nivået av TR1 og andre selenoproteins (fig. 1A, øvre venstre panel). Det 55 kDa TR1 er en av de store selenoproteins, sammen med andre selenoproteins, merket i denne figuren. Åpenbart DT celler har høyere mengder av TR1 enn kontrollceller. TR1-nivåer ble også undersøkt i kontroll og DT-celler ved western blotting (fig. 1A, nedre venstre panel), som bekreftet økte nivåer av TR1 i DT-celler. Interessant nok forhøyet TR1 ekspresjon var på bekostning av andre selenoproteins, som var på reduserte nivåer i DT-celler sammenlignet med kontrollceller.
angitte cellen linjene ble metabolsk merket med
75Se, de resulterende proteincelleekstrakter elektroforese og gelene eksponert for en PhosphorImager (se Metoder). Selenoproteins identifisert tidligere i celleekstrakter [25], [26] er angitt med en pil og navn på høyre side av hvert panel. TR1 ble også identifisert ved western-blotting i proteinekstrakter av hver cellelinje som er vist i de nedre paneler. (A, venstre panel) Control (foreldre, NIH3T3) og DT celler. (A, panel høyre) NIH3T3 (kontroll, foreldre celler til produksjon av DT celler), LLC1 (mus Lewis lunge cellekreft), ACHN (human nyre nyrecellekarsinom), A549 (human lunge ikke-småcellet karsinom), HCT116 ( menneskelige kolon celle adenokarsinom) og SNB19 (human celle glioblastom). NIH3T3 ble brukt som en indikator cellelinje for sammenligning av TR1 nivåer i en normal cellelinje til de ondartede cellelinjer. (B) DT /pU6-m3 og DT /siTR1. DT (oppnådd ved overekspresjon av mutant
k-ras
i NIH3T3) celler ble stabilt transfektert med pU6-m3 (kontroll) vektor eller siTR1 knockdown vektor, henholdsvis (se Methods).
I tillegg ble muse Lewis lungekarsinom (LLC1) celler [16] sammen med fire humane cellelinjer, sammen med, merket med
75Se og selenoprotein uttrykk analysert (fig. 1A, høyre øvre panel). Selv om det ikke finnes tilsvarende kontrollceller var tilgjengelig for disse ondartede cellelinjer, sammenlignet vi deres selenoprotein merkingsmønstrene til de av normale NIH3T3-celler. Den eneste merket selenoprotein som syntes å være overuttrykt i hver av de kreftcellelinjer var TR1. Western blot-analyse viste også høye nivåer av TR1 i de humane og muse maligne cellelinjer (Fig. 1A, høyre panel lavere).
Stabil transfeksjon av DT og kontrollcellene med et siRNA-TR1 knockdown vektor og deres karakterisering
DT-celler ble stabilt transfektert med den siRNA-TR1 knockdown (betegnet DT /siRNA) eller kontroll-vektor (betegnet DT /pU6-m3) (fig. 1B, øvre panel). TR1 var nesten fraværende i DT /siRNA transfekterte celler som demonstrert av metabolsk
75Se merking og western blotting (Fig. 1B, nedre panel).
fenotyper av de to transfekterte DT cellelinjer ble undersøkt og sammenliknet til de av utransfekterte DT og kontrollceller (fig. 2). Kontrollceller vokste i monolaget og tett festet til kulturskålen som er egenskapene til normale celler, mens DT /pU6-m3 og DT-celler vokste i flerlags og løst knyttet til kulturskålen som er kjennetegn ved maligne celler (Fig. 2A). Imidlertid, DT /siRNA-celler hadde en betydelig redusert evne til å vokse i flerlags og var mer tett festet til kulturskålen enn enten DT /pU6-m3 eller DT-celler.
(A) Spenning (NIH3T3, foreldre) , DT, DT /pU6-m3 og DT /siTR1 celler. Celler ble dyrket på kulturplater og fotografert under eksponentiell vekst (se Metoder). (B) Anchorage-uavhengig vekst av kontroll, DT, DT /pU6-m3 og DT /siTR1 knockdown celler. Ett tusen celler ble suspendert i myk agar, og dyrkes i to uker. Platene ble deretter farget med INT natten og fotografert. Detaljer er gitt i Methods. (C) en vekstrate på kontroll, DT /pU6-m3 og DT /siTR1 celler under normale og serum-mangel forhold. Control, DT /pU6-m3 og DT /siTR1 celler ble sådd (2 × 10
5 celler /60mm parabol) og dyrket under normale vekstforhold (venstre panel) og DT /pU6-m3 og DT /siTR1 cellene seeded (5 × 10
5 celler /60 mm skål) og dyrket i (høyre panel) serummangel medium. Vekstrater i serum-manglende medium ble sammenlignet med dem som ble oppnådd under normale vekstbetingelser.
Siden mange kreftceller kan vokse unanchored i myk agar, men de fleste normale celler kan ikke, evne til kontroll, DT, DT /pU6-m3 og DT /siTR1 celler til å vokse i soft agar ble undersøkt (fig. 2B). DT og DT /pU6-m3 celler vokste i soft agar, mens kontroll- og DT /siTR1 celler vokste dårlig under disse betingelser. Vekst egenskaper i bløt agar av to humane cellelinjer, A549 og HCT116, etter transfeksjon med det korresponderende humane TR1 knockdown vektor og vektoren mangler kontroll siTR1 ble også undersøkt (se fig. S1 og figur legende). Interessant, begge cellelinjer som koder siTR1 mistet sin evne til å vokse i myk agar.
Selvforsyning i vekstsignaler
Selvforsyning i vekstsignaler har blitt foreslått som en av seks ervervede egenskapene kreft fenotyper og Ras-Raf-MAPK signalkaskade er kjent for å være involvert i dette ervervet evne ved å etterligne vekstsignaler [19]. Vi undersøkt effekten av TR1 reduksjon på denne fenotype ved dyrking av kontroll, DT /pU6-m3 og TR1 knockdown celler i regelmessig og serum-manglende media (Fig. 2C). Under normale vekstbetingelser, både DT og DT /siTR1 celler vokste mer enn det dobbelte av frekvensen av NIH3T3 celler, mens DT /siTR1 celler vokste bare omtrent 10% mindre effektivt enn DT /pU6-M3-celler (venstre panel, fig. 2C). Dermed gjorde TR1 knockdown ikke redusere veksten av DT celler, eksklusive effekter forbundet med TR1 vesentlighet for cellevekst. Så mange ondartede celler vokse mer effektivt enn normale celler når de ble dyrket i serum-manglende medium, undersøkte vi evnene til de to transfekterte cellelinjer til å vokse i serum-manglende forhold (høyre panel). DT /siTR1 cellene vokste på omtrent halvparten av hastigheten som DT /pU6-m3 celler, videre tyder på at kreftrelatert egenskaper celler ble spesielt påvirket av TR1 knockdown.
Cellesyklus analsis
cellesyklusanalyse av kontroll, DT /siTR1 og DT /pU6-m3 celler, når dyrket i serum-manglende medium, ble utført for å belyse scene påvirket av reduksjonen i TR1 ekspresjon resulterer i veksthemming (fig. 3). De tre cellelinjer ble dyrket i fullstendig medium over natten og deretter anbrakt i serum-manglende medium for 0, 24 og 48 timer. Celler ble inkubert med 5-brom-2-deoksyuridin (BrdU) og farget med BrdU-antistoff for å vurdere DNA-replikasjon og ble inkubert med 7-amino-actinomycin (7-AAD) for å vurdere genomisk DNA. Disse cellene ble deretter analysert ved hjelp av FACS (Fig. 3A) og de aktuelle områdene kvantifisert (Fig. 3B). De tre cellelinjene hadde et stort antall celler i både G0-G1 og S-faser når de blir analysert umiddelbart etter aktiv vekst i komplett medium, selv om DT /siTR1 hadde flere celler i S-fasen, mens de andre to cellelinjene hadde flere celler i G0-G1 fase (se Tid 0 i fig. 3A og B). Kontrollcellelinjen hadde omtrent 90% av dets celler tilbakeholdt i G0-G1 fase gjennom hele vekst i serum-manglende medium. Denne observasjonen helt sikkert indikerer at mesteparten av kontrollcellene blir holdt tilbake i hvile (G0) tilstand som er forenlig med deres manglende evne til å vokse under disse vekstbetingelser. En stor forskjell skjedde i de mengder av celler i DT /pU6-m3 og DT /siTR1 cellelinjer på 24 timer med vekst i G0-G1 og S faser i at DT /pU6-m3 cellene hadde en mye høyere andel av sine celler i S-fasen og lavere prosentandel i G0-G1 fase enn gjorde DT /siTR1. Innenfor S-fasen, DT /pU6-m3 hadde ca 1,5 ganger flere celler i tidlig enn sent S, mens DT /siTR1 hadde ca 3 ganger flere celler i tidlig enn sent S. Selv om mengder av celler i begge transfekterte cellelinjer i G0-G1 og S-faser mer tilnærmes hverandre etter 48 timer med vekst, den store divergens var fortsatt til stede mellom de tidlige og sene S faser i disse to cellelinjer. Disse funnene tyder på at DNA-replikasjon ble arrestert i begynnelsen av S-fasen i DT /siTR1 celler. Det bør også bemerkes at DT /siTR1 celler har høyere mengder av deres cellepopulasjon tilbakeholdt i G2-M-fase enn enten kontroll eller DT /pU6-m3 celler under vekst analyse tyder på at flere celler i DT /siTR1 befolkning har problemer med overgangen inn i mitose. Den mulige feilen forårsaker større forsinkelse av DTsiTR1 celler i G2-M fase garanterer videre etterforskning, men ble ikke fulgt opp i denne studien som det ikke ser ut til å påvirke den generelle reduksjonen i DT /siTR1 vekst sammenlignet med DT /pU6-m3 i serum-manglende medium (se fig. 2C).
kontroll~~POS=TRUNC, DT /pU6-m3 og DT /siTR1 celler ble dyrket i serum-manglende medium i 0, 24 og 48 timer, og inkubert med BrdU i 6 timer. Høstede celler ble farget med anti-BrdU-antistoff for å overvåke nylig replikerte genomisk DNA og 7-AAD å overvåke hel genomisk DNA. (A) fargede celler ble analysert ved flow-cytometri og (B) ble kvantifisert i hver fase av vekstsyklusen ved FlowJo. Faser av vekstsyklusen, ble G0-G1, S-fasen (S tidlig og sent S) og G2-M er vist, og de gitte verdier representerer prosent av den totale cellepopulasjon. Detaljer om forsøkene er vist i figuren er gitt i metoder.
Analyse av DNA polymerase faktorer
For å belyse hvilken komponent (er) kan være involvert i DNA-replikasjon forårsaker en reduksjon i generelle vekstraten i serum-manglende medium i DT /siTR1 celler sammenlignet med DT /pU6-m3 celler, vi undersøkte nivåene av DNA Pol α, β, γ og ε, Cdc45 og PCNA som alle spiller en rolle i denne prosessen [20 ]. Western-analyser av disse komponentene ble utført med de tre cellelinjene ved hvert tidspunkt (Fig. 4). DNA Pol α og Cdc45 var sterkt anriket på begge transfekterte cellelinjer sammenlignet med kontrollceller ved hvert av tidspunktene. Interessant, DNA Pol α syntes å bli redusert i DT /siTR1 celler sammenlignet med DT /pU6-m3 celler ved 24 timer og mest signifikant ved 48 timer. I tillegg nivåene av DNA Pol ε ut til å være redusert i kontroll og DT /siTR1 celler sammenlignet med DT /pU6-m3 celler ved 48 timer, mens DNA Pol β ut til å være redusert ved alle tre tidspunkter i DT /siTR1 sammen enten kontroll eller DT /pU6-m3 celler. Det synes som den mest uttalt effekt av TR1 reduksjon i DT /siTR1 celler er på DNA Pol α som resulterer i redusert vekst av disse cellene i serum-manglende medium. Imidlertid kan TR1 reduksjon også føre til å redusere nivåene av DNA Pol β, mens de reduserte nivåer av DNA Pol ε i 48 timer i kontroll og DT /siTR1 celler kan resultere fra det serummangelfull vekstmedium.
ekspresjonsnivåene av DNA-polymerase komponenter, DNA Pol α, β, δ og ε, Cdc45 og PCNA, kontroll, DT /pU6-m3 og DT /siTR1 celler ble analysert ved western blotting. Celler ble dyrket i serum-manglende medium for 0, 24 og 48 timer, høstet, protein celleekstrakter fremstilt og underkastet elektroforese som beskrevet i Metoder.
diskusjon
TR1 har mange cellefunksjoner og er bredt involvert i cellulære prosesser som er regulert av Redox [9] – [12]. For eksempel har TR1 roller i celleproliferasjon, angiogenese, transkripsjon, DNA-reparasjon og tjener i antioksidantforsvar og redoks-regulering av cellesignalisering (se vurderinger [9] – [12]). Dens hovedfunksjon er antatt å opprettholde cytosolisk tioredoksin (TRX1) i den reduserte tilstand ved hjelp av NADPH som en elektrondonor [21]. I sin tur, donerer TRX1 reduserende ekvivalenter til disulfider i nukleære og cytosoliske proteiner opprettholde reduserte cysteinrester i disse proteinene. Heri belyst vi rolle TR1 i selvforsyning av vekst ved å vise at inhibering av DNA-replikasjon i en ondartet TR1 knockdown cellelinje er forbundet med en reduksjon av DNA Pol α uttrykk. I tillegg har andre studier antydet at DNA-replikasjon kan bli retardert ved å begrense den DNA-syntese siden tioredoksin har en rolle i å opprettholde det intracellulære deoksynukleotid bassenget [11], [22], [23]. Men vi utelukket denne muligheten ved å undersøke deoksynukleotid bassenger i kontroll, DT, DT /pU6-m3 og DT /siTR1 celler og viser at de ikke varierer under vekst i serum-mangel medium (se fig. S2).
Mange TR1 funksjoner og egenskaper tyder på at dette selenoprotein har anti-kreft funksjoner: 1) oksidativt stress er en av viktige kjennetegn ved kreftceller og TR1 er en sentral aktør i antioksidantforsvar ved å redusere TRX1 og andre redoks regulatorer i celler [ ,,,0],9] – [12]; 2) TR1 er avgjørende for riktig funksjon av tumor suppressor p53 [13]; 3) TR1 hemming av kreftfremkallende, elektro forbindelser innblandet det i kreftforebygging [1]; og 4) den selenholdig aminosyre, Sec, opptar det aktive katalytiske sete av TR1 [4] og selen er kjent for å ha potente kreftforebyggende egenskaper [1]. Imidlertid TR1 har også vært implisert i tumorutvikling og vedlikehold: 1) den er overuttrykt i mange tumorer og cellelinjer [9] – [12]; 2) flere antitumorlegemidler er potente inhibitorer av TR1 som tyder på at dette enzymet er et mål for cancerterapi [9] – [14]; 3) målrettet fjerning av TR1 reverserer morfologi og andre kreft kjennetegn ved maligne celler [16] (se også figurene 2 og 3 og tekst S1.); og 4) selen mangel er blitt rapportert å redusere tumordannelse er noen kreftmodeller i dyr [24].
Hvordan kan rollen til TR1 i kreftutvikling forenes med sin rolle i tumor suppresjon, så vel som den kjente anti-kreft egenskaper av selen, som er en katalytisk komponent av TR1? Det er fristende å spekulere at tilstrekkelige mengder kost selen generelt, og et tilstrekkelig nivå av ekspresjon TR1 særlig opprettholde redoks cellulær homeostase i normale celler, som beskytter dem mot oksidativ stress, mutasjoner i DNA og skade på andre cellulære komponenter. Således TR1, sammen med andre selenoproteins, kan fungere i forebygging kreft ved å hemme malign transformasjon. Men i nylig dannede tumorer, krav til TR1 øke betraktelig, da dette proteinet synes å være nødvendig for å opprettholde tumorvekst, sannsynligvis på grunn av den økte etterspørsel etter sine reduserende ekvivalenter via TRX1 veien og som vist i dette arbeidet, DNA-replikasjon. Dette forslaget forklarer både den potente kreft forebygging aktivitet av kosttilskudd selen og kontrasterende roller TR1 i både å forebygge og fremme kreft. Videre gir denne studien grunnlag for å forklare ulike litteraturdata på rollen til denne gåtefulle protein i kreft og løfter TR1 enda lenger som en [8] – [12], [14] – [16] vil utvilsomt ha stor innvirkning på hvordan vi visjon inntaket av selen i dietten til mennesker og andre pattedyr. Det har vært kjent for en gang at dietter inneholdende tilstrekkelige eller supplerende mengder av selen ha fordelaktige effekter i forebyggingen visse former for kreft eventuelt gjennom virkningen av å anrike den selenoprotein befolkning [1]. Men forsiktighet bør komme til uttrykk i at når en malignitet er igangsatt, deretter tilstrekkelige eller beriket mengder av selen i kosten kan bidra til å drive tumorigenesis. Vår studie gir et viktig lag mot å forstå rollene til redoks prosesser i kreftutvikling og bruk av diett i kreft forebygging og behandling.
Materialer og metoder
Material
75Se (spesifikk aktivitet 1000 Ci /mmol) ble hentet fra forskningsreaktoren Facility, University of Missouri, Columbia, MO. PVDF-membran, NuPage 4-12% Bis-Tris-geler, hygromycin B, lipofektamin 2000, Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), antibiotika-antimykotisk oppløsning og føtalt bovint serum var fra Invitrogen Life Technologies. siRNA vektor pSilencer 2,1-U6 Hygro ble kjøpt fra Ambion, Inc. og ρ-iodonitrotetrazolium fiolett (INT) fra Sigma. Antistoffer mot DNA polymerase α, β, δ og ε ble kjøpt fra Abcam, Inc. og antistoffer mot PCNA og Cdc45 var fra Santa Cruz Biotechnology, Inc .. BCA protein assay reagens, SuperSignal West Dura Utvidet Varighet Substrat og HRP-konjugert sekundært antistoff var fra Thermo Fisher Scientific Inc. FITC BrdU flyt kit ble kjøpt fra BD Pharmingen ™. Kreft cellelinje DT som koder onkogene
K-ras
og har sin opprinnelse i NIH3T3 (foreldre) celler ble sjenerøst gitt av Dr. Yoon Sang Cho-Chung og NIH3T3 celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection. LLC1 (mus Lewis lunge carcinoma-celler) ble erholdt som fikk [16] og humane cellelinjer ACHN (human nyre nyrecellekarsinom), A549 (human lunge ikke-småcellet lungekarsinom), HCT116 (human koloncelle adenokarsinom) og SNB19 (human celle glioblastom) ble oppnådd fra NCI, DTP, DCTD Tumor Repository ved NIH, Bethesda, MD.
Culture of pattedyrceller og cellevekstanalyser
NIH3T3 og DT-celler ble dyrket i DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum og antibiotika-antimykotisk oppløsning ved 37 ° C, 5% CO
2 i en fuktet inkubator. Stabilt transfektert siTR1 (TR1 knockdown) DT-celler og stabilt transfekterte pU6-m3 kontroll DT-celler ble fremstilt ved transfeksjon med de tilsvarende konstruksjoner med lipofektamin 2000 og deretter velge celler i nærvær av 500 ug /ml hygromycin B nøyaktig som beskrevet [16] .
morfologi av NIH3T3, DT, DT /pU6-m3 og DT /siTR1 celler ble vurdert i løpet av eksponensiell vekst ved såing celler bort på 60 mm kultur retter, cellene vokst eksponentielt og fotografert med en omvendt fase-kontrast mikroskop . Vekstrater på NIH3T3, ble DT /pU6-m3 og DT /siTR1 celler vurderes av seeding 2 × 10
5 celler /60 mm kulturskål, og etter 48 timer vekst ble cellene høstet med trypsin-EDTA, og cellene telles ved trypanblått ekstrudering metoden [16]. For å vurdere vekst av celler i serummangelfull tilstand, celler (5 × 10
5 celler /60 mm kulturskål) ble sådd og høstet etter 24 og 48 timer inkubasjon i medium som inneholder alle komponenter som komplett medium unntatt 0,5% FBS i stedet for 10% FBS, og cellene ble tellet som ovenfor.
Western blot-analyse og
75Se merking av celler
Teknikker for western blot analyse og merking av celler med
75Se har blitt beskrevet andre steder [16]. I korthet, for western blot-analyse ble cellene vasket med kald PBS og helcellelysater fremstilt ved anvendelse av lyseringsbuffer (20 mM Tris-Cl, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoksycholat, 10 mM NaF, 5 mM EDTA og proteinase-inhibitor cocktail). Mengdene av protein i celleekstrakter ble målt ved anvendelse av BCA-proteinanalyse-reagens, 30 ug av proteinprøver elektroforese på NuPAGE 4-12% Bis-Tris-geler, de separerte proteinene overført til en PVDF-membran, og deretter inkubert først med primært antistoff ( polyklonalt anti-TR1, anti-DNA Pol α, β, δ, ε, anti-PCNA og anti-Cdc45) og til slutt med HRP-konjugert sekundært antistoff. Membraner ble reagert med SuperSignal West Dura Utvidet Varighet Substrat og utsatt for røntgenfilm.
For
75Se-merking, celler ble sådd ut på en seks brønn plate (3 × 10
5 celler /brønn) inkubert i 24 timer, deretter merket med 40 uCi
75Se i 24 timer, høstes og lyseres som beskrevet ovenfor. 40 ug av hver prøve ble påført på NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel elektroforese, proteinene farvet med Coomassie blå farging løsning ble gelen tørket og eksponert for en PhosphorImager (Molecular Dynamics).
75Se-Merket selenoproteins på utsatte gels ble identifisert ved autoradiografi [16].
Soft agar assay
Vekst av celler i myk agar for å vurdere deres evne til å opprettholde forankringsuavhengig vekst har vært detaljert andre steder [16]. I korthet ble et total på 1000 kontroll, DT, DT /pU6-m3 eller DT /siTR1 Cellene ble suspendert i 3 ml 0,35% edel agar i dyrkningsmedium med 10% FBS, og spres jevnt på 60 mm plater som er dekket med en 4 ml basal lag 0,7% edel agar i DMEM. Platene ble inkubert i en fuktet CO
2 inkubator i 14 dager, 0,5 ml ferskt vekstmedium lagt inn på agarplate hver 5 dag. Koloniene som utviklet ble visualisert ved farging med ρ-iodonitrotetrazolium fiolett (INT) over natten og platene fotografert.
Cell syklus analyse
Celler ble sådd på cellekultur tallerken (5 × 10
5 celler /60 mm skål) og inkubert over natten før de overføres til serummangel medier (0,5% FBS i DMEM). Celler ble inkubert med 5-brom-2-deoksyuridin (BrdU) 6 t før innhøsting, BrdU-merkede celler høstet ved bestemte tidspunkter (0 hr, 24 timer og 48 timer) og farget med antistoffer for å overvåke replikert DNA. Høstet celler ble fiksert og permeabilized med BD Cytofix /CytopermTM Fixation /Permeabilization løsning for intracellulær farging. For replikert DNA farging, ble innlemmet BrdU undersøkt med anti-BrdU antistoff og hele genomisk DNA ble farget med 7-amino-actinomycin D (7-AAD) etter produsentens prosedyrer. Celler som inneholder de respektive DNA-tilstander ble analysert ved hjelp av strømningscytometri ved anvendelse av en FACS Calibur to sorter (Beckton Dickinson) og antall celler i hver fase av cellesyklusen kvantifisert ved FlowJo (Tre stjerne, Inc.).
støtte Informasjon
Tekst S1.
doi: 10,1371 /journal.pone.0001112.s001 plakater (0,03 MB DOC)
Figur S1.
doi: 10,1371 /journal.pone.0001112.s002 plakater (3,54 MB TIF)
Figur S2.
doi: 10,1371 /journal.pone.0001112.s003 plakater (0,82 MB TIF)
