Abstract
Hypoksi er kjent for å spille viktige roller i celle overlevelse, angiogenese, tumor invasjon og metastasering. Hypoksi-formidlet over-ekspresjon av hypoksi-induserbar faktor (HIF) er blitt vist å være assosiert med terapeutisk motstand, og bidrar til dårlig prognose av kreftpasienter. Emerging bevis tyder på at hypoksi og HIF veier bidrar til oppkjøpet av epithelial-til-mesenchymale overgang (EMT), vedlikehold av kreft stamcelle (CSC) funksjoner, og også opprettholder den onde sirkelen av betennelses alt som fører til terapeutisk motstand. Imidlertid er den nøyaktige molekylære mekanismen (e) der hypoksi /HIF driver disse hendelsene ikke fullt ut forstått. Her viser vi, for første gang, fører den hypoksi til øket ekspresjon av VEGF, IL-6, og CSC signatur gener Nanog, OCT4 og EZH2 i samsvar med øket cellemigrering /invasjon og angiogenese, og dannelsen av pancreatospheres, samtidig med økt uttrykk av MIR-21 og MIR-210 i menneskelige kreft i bukspyttkjertelen (PC) celler. Behandlingen av PC-celler med CDF, en ny syntetisk forbindelse inhiberte produksjonen av VEGF og IL-6, og ned-regulert ekspresjon av Nanog, Oct4, EZH2 mRNA, samt MIR-21 og MIR-210 i henhold til hypoksi. CDF førte også til redusert celle migrasjon /invasjon, angiogenese, og dannelse av pancreatospheres under hypoxi. Videre redusert CDF genekspresjon av MIR-21, MIR-210, IL-6, HIF-1α, VEGF, og CSC signaturer
in vivo
i en mus orthotopic modell for menneskelig PC. Sammen er disse resultatene tyder på at anti-tumoraktiviteten til CDF helt eller delvis er mediert gjennom deregulering av tumor hypoksiske veier, og således CDF kan bli en roman, og effektive anti-tumormiddel til PC terapi
Citation.: Bao B, Ali S, Ahmad A, Azmi AS, Li Y, Banerjee S, et al. (2012) Hypoksi-Induced Aggressivitet av kreft i bukspyttkjertelen celler skyldes økt Uttrykk av VEGF, IL-6 og MIR-21, som kan dempes med CDF behandling. PLoS ONE 7 (12): e50165. doi: 10,1371 /journal.pone.0050165
Redaktør: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, USA
mottatt: 26 august 2012; Godkjent: 22 oktober 2012; Publisert: 13.12.2012
Copyright: © 2012 Bao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Cancer Institute, National Institutes of Health gir R01CA131151, R01CA132794 og R01CA154321 tildelt FHS, og Department of Defense Exploration-hypotesen Development Award PC101482 tildelt Bin Bao. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Medforfatter Dr. Sarkar er en PLoS ONE Editorial styremedlem. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Kreft i bukspyttkjertelen (PC) er en av de mest dødelige ondartede sykdommer med de fattigste klinisk resultatet i verden. I 2012 har det vært anslått at 43, 920 emner vil være nylig diagnostisert med PC, og vil stå for 37, 390 kreftrelaterte dødsfall i USA [1]. På grunn av fravær av spesifikke symptomer, mangel på tidlige deteksjonsteknikker og svært aggressive fenotyper, PC er vanligvis diagnostisert på et avansert-uhelbredelige og metastatisk stadier [2], [3]. Dermed er median total overlevelse cirka seks måneder etter kirurgiske og chemo-stråling terapi for lokalavansert eller metastatisk stadier av PC. Derfor er det fem års total overlevelsesrate mindre enn fem prosent. En slik kortere overlevelse er først og fremst på grunn av sen diagnose og terapeutisk motstand, og bidra til tumorresidiv og metastasering.
Hypoksi er en av de grunnleggende biologiske fenomener som er sterkt knyttet til utvikling og aggressivitet av et bredt spekter av solide tumorer inkludert PC. Hypoksi-induserbare faktorer (HIF) er en sentral transkripsjonsfaktor som formidler hypoksi responsive gener og er allment akseptert for å spille kritiske roller i tumorinvasjon, metastase, og behandling motstand, på grunn av dens økte cellevekst, overlevelse, angiogenese og cellemigrering og invasjon [4], [5]. Derfor svulst hypoksi med endret uttrykk av HIF og dens biologiske effekten resultat i dårligere kliniske resultatet av pasienter diagnostisert med solide tumorer, noe som resulterer i høyere dødelighet, noe som tyder på at forståelsen av den molekylære forhold til hypoksi med andre molekylære og cellulære funksjoner i tumor aggressivitet, ville være uvurderlig for utvikling av nye terapeutiske strategier for behandling av fast tumor utvikling og progresjon. Det er allment akseptert at kreft stamceller (cscs) og epitelial-til-mesenchymale overgang (EMT) fenotypiske celler er sterkt assosiert med terapeutisk motstand, og bidrar til aggressiv tumorvekst, invasjon og metastase, og blir vanligvis ansett for å være en av de viktigste årsakene til tumorresidiv og tilbakefall [6]. Dataene fra økt antall studier tyder på at hypoksi og HIF signalveien fører til anrikning av cscs og EMT celler som anmeldte nylig [7], som bidrar til kreft aggressive fenotyper, som også kan være på grunn av deregulering av microRNAs (miRNAs).
De mirnas er godt kjent for å spille sentrale roller i en rekke biologiske prosesser, slik som celledifferensiering, spredning, død, overlevelse, metabolisme og energi homeostase [8], [9]. Samle bevis tyder på at mirnas kan ha en avgjørende rolle i utvikling og progresjon av maligne disaeses. Vekslingene av miRNA uttrykket er angivelig knyttet til kliniske resultatet av kreftpasienter, behandling motstand, tumor tilbakefall og /eller tilbakefall. Et stort antall mirnas har blitt rapportert å være responsive til hypoksi og HIF-signalreaksjonsveien i et bredt spekter av celler og vev, inkludert cancerceller [10] – [13]. Det er blitt funnet at hypoksi redusert ekspresjon av MIR-101, en potensiell anti-onkogen molekyl, og økt ekspresjon av MIR-21 og MIR-210, pro-onkogene molekyler i en rekke kreftformer, inkludert PC [14], [15]. Således kan hypoksi-formidlet regulering av mirnas spiller viktige roller i tumor aggressive fenotyper mediert ved modulering av cellulære signalveier inkludert HIF-signalreaksjonsveien i en svulst mikromiljøet. Derfor er rettet mot disse hypoksi-formidlet mirnas kan tilveiebringe en ny og effektiv terapeutisk strategi for forebygging og /eller behandling av faste tumorer, inkludert PC.
I denne studien undersøkte vi effekten av hypoksi på cellemigrering, invasjon og angiogenese, og uttrykk for VEGF, IL-6, CSC signatur gener, MIR-21 og MIR-210 i PC-celler under hypoksiske forhold. Vi undersøkte også hvilken rolle MIR-21 i reguleringen av VEGF, IL-6, dannelsen av pancreatospheres, og CSC signatur gener i PC-celler. Videre undersøkte vi effekten av en ny syntetisk derivat av curcumin (CDF) på celle overlevelse, migrasjon, invasjon, angiogenese, dannelse av pancreatospheres, og ekspresjon av HIF-1α, VEGF, IL-6, CSC signatur gener, og mirnas i PC-celler under hypoksiske forhold. Til slutt undersøkte vi effekten av CDF på MIR-21, MIR-210, HIF-1a, VEGF, og CSC signatur markører
in vivo
.
Materialer og metoder
Reagenser og antistoffer
A novel curcumin-avledet analog CDF ble syntetisert som beskrevet i vår tidligere publikasjon [16]. Antistoffer mot CD44, EpCAM, og HIF-1α ble hentet fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Antistoffer mot Ki-67 og VEGF ble kjøpt fra Santa Cruz (Santa Cruz, California). Antistoff mot EZH2 ble hentet fra BD Biosciences (San Jose, California). Alexa Fluor-488 geit-anti-mus-IgG for CD44 og EpCAM-farging ble oppnådd fra Invitrogen. Den miRNA revers transkripsjon (RT) primere, PCR prober og anti-MIR-21 inhibitor ble oppnådd fra Applied Biosystems (Carlsbad, California). Krystallfiolett og Matrigel løsning ble oppnådd fra Sigma Chemicals (St Louis, MO).
Cell kultur
Menneskelig bukspyttkjertelkreft (PC) cellelinjer ASPC-en og MiaPaCa-2-celler ble opprettholdt på standard kultur eller normoksisk betingelser (21% O2 og 5% CO2, 37 ° C), som tidligere beskrevet [17]. Hypoksisk (1% O
2) og 5% CO
2 betingelser ble samlet ved bekjempelse av inngangsstrømningshastigheter av nitrogen og karbondioksid, respektivt. Alle cellelinjene ble holdt i 10% FBS-DMEM-medium ved en standard cellekultur tilstand. Alle cellelinjene har blitt godkjent av Applied Genomics Technology Center ved Wayne State University den 13. mars 2009, og disse autentiserte cellene ble frosset for senere bruk. Den brukes til testing metoden var kort tandem repeat profilering bruker PowerPlex 16 System fra Promega. Gemcitabin
Cell overlevelse analyse
MTT analysen ble gjennomført for å undersøke effekten av CDF på celle overlevelse i humane PC celler (ASPC-1 og MiaPaCa-2 celler) under hypoksiske forhold. 3000 celler ble sådd hver brønn i 96-brønners plater og inkubert ved standard dyrkningsbetingelser (21% O
2 og 5% CO
2) over natten. Cellene ble deretter behandlet med forskjellige konsentrasjoner av CDF (0-0,5 mm) og inkubert i 8 timer under hypoksiske betingelser (1% O
2) etterfulgt av 16 timer fra normoksisk betingelser (21% O
2) hvert dag. Etter 3 dager med behandling, ble cellene høstet for standarden MTT-analysen, som beskrevet i våre tidligere publikasjoner [18], [19].
klonogene assay
klonogene analyse ble utført for å undersøke virkningen av CDF på cellevekst og proliferasjon av celler i henhold til PC-hypoksiske betingelser, som beskrevet tidligere [18]. 5 x 10
4 celler ble sådd ut i en 6-brønns plate. Etter 3 dager med eksponering til 0,5 uM av CDF (8 h av hypoksiske tilstander og 16 h i normoksisk betingelser hver dag), ble cellene trypsinert, og 1000 enkeltlevedyktige celler ble sådd ut i 100 mm petriskåler. Cellene ble deretter inkubert i 10 til 12 dager ved 37 ° C i en 5% CO
2/5% O
2/90% N
2 inkubator. Koloniene ble farget med 2% krystallfiolett, vasket med vann, og telles.
Invasion analysen
in vitro
invasjon analysen av PC-celler ble utført under hypoksiske betingelser ved ved hjelp av Transwell Costar 24-brønners-plater med polykarbonatmembran (Corning Incorporated, Corning, NY), som tidligere beskrevet [19]. I korthet, 4 x 10
4 av humane PC-celler (ASPC-1 og MiaPaCa-2) som utsettes for 3 dagers inkubering i henhold til normoksisk eller hypoksiske betingelser, henholdsvis, ble sådd i hver brønn av Matrigel forbelagte Transwell platene FBS-frie kulturmedier. De nederste brønner av systemet ble fylt med 10% FBS fullstendig medium. Etter 20 timers inkubering, enten i fravær eller nærvær av CDF (0,5 uM), ble den invaderte kreftcellene farget med 4 ug /ml Calcein-AM (Invitrogen) i PBS-løsning ved 37 ° C i 1 time, etter produsentens håndbok. Fotografiene ble tatt med et fluorescerende mikroskop (Nikon ECLIPSE TE2000-U) koblet til en datamaskin.
Sårtilheling analysen
For å undersøke effekten av CDF på celle migrasjon av PC celler i henhold hypoksiske betingelser vi utført sårheling analyse, som beskrevet tidligere [17]. I korthet, når ASPC-1-celler nådde 90-95% konfluent, ble såret generert ved å skrape overflaten av platene med en 10-200 ul pipette. Cellene ble deretter inkubert i fravær og nærvær av CDF (0,5 uM) og ble inkubert i henhold til hypoksiske betingelser i 4 timer, etterfulgt av 16 timer fra normoksisk forhold, og deretter fotografert med et Nikon Eclipse TS100 mikroskop.
tube forming analyse
for å undersøke effekten av CDF på angiogenese
in vitro
hjelp vaskulære endotelceller etter hypoksiske forhold, gjennomførte vi tube-analysen, som beskrevet tidligere [20]. I korthet, 3 x 10
4 kanin vaskulære endotelceller ble sådd ut i hver brønn av Matrigel-pre-belagte 96-brønners plate i 100 ul 10% FBS-DMEM-medium, og utsatt for normoksisk eller hypoksiske betingelser i 4 timer inkubasjon ved 37 ° C, etterfulgt av 16 timer fra normoksisk forhold. Bildet ble tatt på 4 timer og 20 timer, henholdsvis.
Cytokiner VEGF og IL-6-analysen
ELISA-analysen ble utført for å vurdere effekten av CDF på hypoksi-indusert cytokin produksjoner av VEGF og IL-6 av humane PC-celler. Kulturen medier fra cellene under hypoksiske eller normoksisk forhold, henholdsvis for 16 timer ble høstet for måling av VEGF og IL-6 ved hjelp av ELISA analysesett (R Invitrogen), og utsatt for hypoksiske betingelser annenhver dag. Etter 7 dager ble kuler med diameter større enn 50 μmeters betegnet som «pancreatospheres» oppsamlet ved sentrifugering (300 x g i 5 min), og talt.
farging assay og konfokal mikros
10.000 av enkeltcellesuspensjoner av PC celler per brønn var seeded og inkubert i 24 timer ved hjelp av ultra lave heft brønner i seks-brønns plate (Corning, Lowell, MA) i sfæren formasjon medium etterfulgt av dyrking i henhold hypoksiske forhold annenhver dag, som beskrevet ovenfor. Etter 7 dagers behandling CDF, ble pancreatospheres oppsamlet ved sentrifugering (300 x g i 5 minutter), vaskes med 1 x PBS og fiksert med 3,7% parformaldehyde i 10 minutter ved romtemperatur. Monoklonale CD44 og EpCAM antistoffer ble brukt til farging analysen, etter produsentens protokoll, som beskrevet tidligere [17], [21]. De CD44 eller EpCAM-merket pancreatospheres ble fotografert ved hjelp av en confocal bildebehandling mikroskop (Leica TCS SP5) med 200 × forstørrelse i MIRL Core-anlegget, Wayne State University School of Medicine.
Transfeksjon av anti-MIR-21 siRNA
2 x 10
5-celler /brønn (paren MiaPaCa-2-celler) eller 10.000 celler (MiaPaCa-2 sfæriske celler) per brønn ble sådd ut i seks-brønns plater og transfektert med anti-MIR-21 siRNA eller negativ kontroll siRNA (Ambion, Austin, TX) ved en endelig konsentrasjon på 20 nM bruker DharmaFECT transfeksjon reagens (Dharmacon), etter produsentens protokoll, som beskrevet tidligere [17].
Sanntids reversere transcriptase- polymerase chain reaction (RT-PCR) av mRNA og miRNAs
for å bestemme de relative mRNA nivåer, to mikrogram total RNA ekstrahert fra hver prøve ble brukt for RT reaksjon i 20 mL av reaksjonsvolumet ved hjelp av en omvendt transkripsjon system (Invitrogen) i henhold til produsentens anvisninger. SYBR Grønn PCR analysen kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) ble brukt for sanntids PCR reaksjon, ved hjelp av AB StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems), etter produsentens protokoll. Sekvenser av PCR-primere ble tidligere beskrevet [19]. Dataene ble analysert ved hjelp av C
t-metoden og ble normalisert til GAPDH-ekspresjon i hver prøve. For å bestemme ekspresjon av mirnas i cellene, ble den TaqMan mikroRNA Assay Kit (Applied Biosystems) som anvendes følgende produsentens protokoll. Fem ng av total RNA ble revers transkribert som beskrevet tidligere [19]. Real-time PCR-reaksjoner ble så utført i et totalt volum på 10 ul reaksjonsblanding ved hjelp av TaqMan PCR-oppløsning som beskrevet tidligere [17]. Dataene ble analysert ved hjelp av C
t-metoden og ble normalisert ved RNU48 uttrykk i hver prøve.
Dyreforsøk
Protokollen fra dyreforsøk ble godkjent av Investigation Committee, Wayne State Animal University, Detroit, MI. Kvinne CB17 alvorlig kombinert immunmangel (SCID) mus i en alder av 4 uker gamle ble kjøpt fra Taconic Farms (Germantown, New York) og ble matet Lab Diet 5021 (Purina Mills, Inc., Richmond, IN). 10 x 10
6 MiaPaCa-2-celler ble orthotopically implantert i bukspyttkjertelen hos musene som beskrevet i vår tidligere publikasjon [17], og således den anti-tumor-aktivitet data ikke blir presentert her. Når musene utviklet palpable tumorer ble dyrene tilfeldig delt inn i to grupper: (1) ubehandlet kontroll; (2) CDF (5 mg /mus /dag), intragastrisk gang daglig i 12 dager. Tumormålinger og endringer i vekt ble utført. Svulstvev fra alle grupper av dyr ble fjernet, hurtig frosset i flytende nitrogen, og lagret ved -80 ° C for senere bruk for RNA og histologisk undersøkelse som presenteres i dette manuskriptet.
Etablering MiaPaC-2 tumor sfære celler
for å undersøke effekten av CDF eller anti-MIR-21 på VEGF, IL-6, CSC signaturer i CSC-lignende undergruppe av tumorceller, utviklet vi MiaPaCa-2 tumor sfære celler i mus xenograft modell, som tidligere beskrevet [22]. Kort sagt ble ca 5000 pancreatospheres av MiaPaCa-2-celler implantert i xenograft musemodell (4 uker gamle) for å anrike kreftstamcelle (CSC) populasjonen. Tumoren ble fjernet, og cellene ble dyrket i sfæren formasjonen medium, som beskrevet ovenfor, for å utvikle de sekundære pancreatospheres, som omtales som «MiaPaCa-2-tumorceller» sfære. MiaPaCa-2 tumor sfære celler ble også karakterisert ved våre tidligere publikasjoner [17], [22].
Immunohistochemistry
Formalin-fiksert og parafin-embedded tumor vevssnitt ble evaluert ved immunhistokjemi i kjernefasilitet ved Institutt for patologi, Karmanos Cancer Institute, Detroit, Michigan, som beskrevet tidligere [17]. Kort fortalt ble 5-15 mikrometer tykk vevssnitt kuttet og montert på gelatin-belagt histologiske lysbilder. Deparaffinizations av lysbildene ble utført ved hjelp av xylen-løsning, etterfulgt av vasking med forskjellige konsentrasjoner av alkohol og avionisert vann. Immunhistokjemisk farging ble utført ved hjelp av Ki-67 (1:400), HIF-1α (1:100), VEGF (1:100), EpCAM (01:50), og EZH2 (1:50) primære antistoffer med passende fortynninger og ved hjelp av normal vert serum for negative kontroller, etterfulgt av farging med egnede pepperrotperoksydase-konjugert sekundært antistoff, i henhold til produsentens instruksjon. Platene ble utviklet i en oppløsning av diaminobenzidin og motfarget med en svak løsning av hematoksylin ved hjelp av ABC-reagens-sett (Vector Labs), etterfulgt av nukleær farging ved hjelp av AEC farging kit (Vector Labs). De fargede lysbilder var dehydrert og montert i Permount løsning og undersøkt av en lisensiert patolog. Fotografiene ble tatt med et Nikon ESLIPSE E800 med 20 × forstørrelse. Den immunhistokjemisk farging fikk en samlet poengsum basert på intensiteten av flekker (ingen flekker som null, svak som 1+, moderat som 2+, sterk som 3+) lagt sammen med de prosentvise positive celler (ingen flekker som null, 25% som 1+;. 25-50% som 2+ og større enn 50% som 3+)
Statistisk analyse
gjennomsnitt og standardavvik (SD) av data i denne studien ble utarbeidet etter GraPad Prism programvare (versjon 4.03). Sammenligninger av behandlingsresultat ble testet for signifikante forskjeller ved den sammenkoblede
t
test eller ANOVA analyse. Statistisk signifikans ble antatt ved en
p
verdi på mindre enn 0,05.
Resultater
CDF økt celleoverlevelse og clonogenicity av PC celler etter hypoksisk forhold
for å undersøke effekten av CDF på celleoverlevelse i humane PC-celler under hypoksiske betingelser, ble MTT-analyse utført ved anvendelse av humane PC-celler (ASPC-1 og MiaPaCa-2 celler). Resultatene indikerer at CDF bemerkelsesverdig inhiberte celleoverlevelse av ASPC-1 og MiaPaCa-2-celler på en doseavhengig måte (figur 1A). Klonogene Analysen ble utført for å undersøke effekten av CDF (0,5 umol /l) på cellevekst og proliferasjon av celler i henhold til PC-hypoksiske betingelser. Resultatene viste at CDF behandling reduserte clonogenicity av ASPC-1 og MiaPaCa-2-celler i henhold til hypoksiske betingelser (figur 1B). Disse funn tyder på at CDF hemmer celleoverlevelse og vekst av klonogene PC-cellene under hypoksiske betingelser.
panelene A, B, C og D representerer cellevekst, clonogenicity, VEGF, og IL-6, respektivt. De kondisjonerte media ble samlet fra celler dyrket under normoksisk og hypoksiske forhold, som beskrevet under metodedelen. Målingene av VEGF og IL-6 ble utført ved hjelp av ELISA. Barene i listene viser standardavvik (SD) på minst n = 3. * indikerer p. 0,05
Effekt av CDF på produksjoner av VEGF og IL-6 cytokiner i PC-celler etter hypoksiske forhold
Vi undersøkte også effekten av CDF på hypoksi-indusert VEGF og IL-6 produksjoner av PC celler ved hjelp av ELISA-analysen. Resultatene viser at de ASPC-1 og MiaPaCa-2-celler inkubert ved hypoksiske betingelser økte produksjoner av VEGF og IL-6, sammenlignet med cellene inkubert ved normoksisk betingelser (figur 1C). CDF behandling bemerkelsesverdig redusert produksjon av hypoksi-indusert VEGF og IL-6 i PC-celler (figur 1C), som tyder på en hemmende rolle av CDF i produksjoner av hypoksi-indusert VEGF og IL-6 i humane kreft i bukspyttkjertelen celler.
effekt av CDF på angiogenese
in vitro
i vaskulære endotelceller henhold hypoksiske forhold
for å undersøke effekten av CDF på angiogenese
in vitro
henhold hypoksiske betingelser gjennomførte vi tube-analysen bruker vaskulære endotelceller. Resultatene viser at hypoksiske betingelser betydelig økt røret dannelsen av vaskulære endotelceller i 4 timer og 20 timer av inkubasjon, henholdsvis, i forhold til normoksisk betingelser (p = 0,0016 og p = 0,016, respektivt; n = 3). CDF behandling inhiberte signifikant hypoksi-indusert rør dannelse av vaskulære endotelceller (p = 0,004, n = 3) (figur 2A). For å vurdere hvorvidt CDF-mediert molekyler eller CDF selv bidrar til hemming av røret formasjon, samlet vi ikke CDF-behandlede (kontroll) og CDF-behandlet kondisjonert medium fra kreftceller og gjennomført røret dannelsen analysen i henhold normoksisk forhold. Som vist i figur 2B, hadde de vaskulære endoteliale celler inkubert med kontroll tilstand media øket rør formasjonen på 4 timer og 20 timer, sammenlignet med de celler inkubert med CDF-forbehandlet kondisjonert medium (p = 0,029 og p = 0,011; n = 3). Tilsetning av CDF til styre kondisjonerte medium vesentlig hemmet røret formasjonen, sammenlignet med cellene inkubert ved begge kontroll kondisjonerte medier og CDF-forbehandlet kondisjonert medium (p = 0,0001; n = 3) (figur 2B). Disse dataene tyder på at CDF seg selv bidrar til hemming av røret dannelsen av vaskulære endotelceller
panelene A og. B, C cellemigrering ble evaluert ved sårheling assay; invasjon ble evaluert av kammeret invasjon analysen.
Effekt av CDF på celle migrasjon og invasjon in vitro i PC-celler i henhold hypoksiske forhold
sårheling Analysen ble utført for å undersøke effekten av CDF på celle migrasjon av PC celler i henhold hypoksiske forhold. Som vist i figur 2C, hadde hypoksi-eksponerte ASPC-1-celler økte den til sårheling kapasitet, sammenlignet med celler dyrket under normoxia (p = 0,0001; n = 3) (figur 2C). CDF behandling inhiberte den til sårheling kapasitet i kreftceller under hypoksiske betingelser (p 0,05, n = 3) (figur 2C og D). For å undersøke effekten av CDF på invasjon av PC cellene under hypoksiske forhold, gjennomførte vi
in vitro
invasjon analysen. Som vist i figur 2E, både ASPC-1 og MiaPaCa-2-celler eksponert for hypoksiske betingelser hadde økt kapasitet av invasjon, sammenlignet med de celler som er utsatt for normoksisk forhold. CDF behandling inhiberte kapasiteten til hypoksi-indusert invasjon av PC-celler. Disse data tyder på at CDF kan hemme hypoksi-indusert celle migrasjon og invasjon av menneskelige PC celler.
Effekt av CDF på genuttrykket av CSC markører i PC-celler i henhold hypoksiske forhold
sanntid RT-PCR-analyse ble utført for å undersøke effekten av CDF på kreft stamcelle (CSC) signatur gener i ASPC-1 og MiaPaCa-2-celler i henhold til hypoksiske betingelser. Som vist i figur 3, hypoksi forårsaket av de relative mRNA-nivåer av Nanog, Oct4, og EZH2 i ASPC-1 og MiaPaCa-2-celler, mens CDF reduserte nivåene av Nanog, Oct4, og EZH2 mRNA i PC-celler under hypoksiske betingelser.
real time RT-PCR ble ansatt som beskrevet under metodedelen. Barene i figurene indikerer SD n = 3. * indikerer p. 0,05
Effekt av CDF på mikroRNA (miRNA) uttrykk for MIR-21 og MIR-210 i PC-celler etter hypoksisk forhold
for å undersøke effekten av CDF på miRNA uttrykket i PC-celler under hypoksiske forhold, vi målte relative nivåer av MIR-21 og MIR-210 etter hypoksiske betingelser ved real-time RT-PCR. Som vist i figur 3, hypoksi forårsaket av de relative miRNA nivåene av MIR-21 og MIR-210 i ASPC-1 og MiaPaCa-2-celler, mens CDF reduserte nivåene av MIR-21 og MIR-210 i PC-celler under hypoksiske betingelser, noe som tyder at CDF er en potent middel i å dempe hypoksi-indusert ekspresjon av MIR-21 og MIR-210 i humane PC celler.
Effekt av CDF eller anti-MIR-21 på CSC selvfornyelse kapasitet i menneskelig PC celler under hypoksiske betingelser
for å vurdere virkningen av CDF eller anti-MIR-21 på den CSC selvfornyelse kapasitet av humane PC-cellene under hypoksiske betingelser, gjennomførte vi kula formasjonen analyse ved bruk av ASPC-1 og MiaPaCa-2 celler. Resultatene viser at anti-MIR-21 redusert dannelse av pancreatospheres i MiaPaCa-2-celler (figur 4A). Disse data tyder på at MIR-21 kan spille en viktig rolle i reguleringen av den selvfornyelse kapasitet på CSC-lignende PC-celler. Tilsvarende redusert CDF behandling dannelsen av pancreatospheres i ASPC-1 og MiaPaCa-2-celler i henhold til hypoksiske betingelser (figur 4A).
panelene A, B og C representerer dannelsen av pancreatospheres, ekspresjon av CD44 og EpCAM, og produksjonen av VEGF og IL-6, respektivt. Sfæren formasjon Analysen ble gjennomført for å undersøke selvfornyelse kapasitet på cscs i PC-celler, som beskrevet under metodedelen. Konfokal mikroskopi avbildning (200 x forstørrelse) ble gjennomført for å måle CSC celleoverflatemarkører CD44 og EpCAM i MiaPaCa-2 tumor sfære-celler, som beskrevet i metodedelen. Barene i figurene indikerer SD n = 3. * indikerer p. 0,05
Effekt av CDF eller anti-MIR-21 på uttrykk for CSC celleoverflatemarkørproteiner CD44 og EpCAM i PC celler-avledet sfære celler etter hypoksisk forhold
for å undersøke hvorvidt CDF eller anti-MIR-21 hemmer uttrykk for CSC celleoverflatemarkører CD44 og EpCAM i CSC-lignende celler avledet fra PC-celler, gjennomførte vi konfokalmikroskoper avbildningsmikroskopi for å vurdere ekspresjon av CD44 og EpCAM i MiaPaCa-2-celler initierte tumor-avledede celler sfære. Resultatene viser at anti-MIR-21 reduserte ekspresjon av CD44 og EpCAM i MiaPaCa-2-tumorceller sfære i henhold hypoksiske betingelser, i overensstemmelse med resultatene fra CDF-behandling (figur 4B). Disse data tyder på at CDF ned-regulerer dannelsen av MiaPaCa-2-tumorceller sfære i samsvar med nedregulering av CD44 og EpCAM uttrykk, som er delvis formidles ved redusert ekspresjon av MIR-21.
Effekt av CDF eller anti-MIR-21 på VEGF og IL-6-produksjon i MiaPaCa-2-tumor sfæriske celler under hypoksiske betingelser
Som vist på figur 4C, MiaPaCa-2 tumor sfære celler som produseres forholdsvis større mengde av VEGF i henhold hypoksisk forhold, i forhold til sine foreldre MiaPaCa-2 celler (2174 pg /ml /10
4 MiaPaCa-2 svulst sfære celler vs 3248 pg /ml /10
6 MiaPaCa-2 celler, figur 1C og 4C), noe som tyder at MiaPaCa-2-tumor kulene kan fremme angiogenese ved opp-regulere produksjonen av VEGF. Vi fant også at CDF behandling redusert hypoksi-indusert VEGF produksjon i MiaPaCa-2 svulst sfære celler. Tilsvarende MiaPaCa-2 sfæriske celler produsert relativt større mengde av hypoksi-indusert IL-6, sammenlignet med dens parentale celler (18 pg /ml /10
4 MiaPaCa-2 sfæriske celler vs 164 pg /ml /10
6 foreldre MiaPaCa-2-celler, figur 1D og 4C). CDF behandling eller mangel på MIR-21 ved hjelp av anti-MIR-21 transfeksjon redusert produksjon av hypoksi-indusert IL-6 i CSC-lignende sfæriske celler (figur 4C).
Effekt av CDF eller MIR-21 mangel på genekspresjon av HIF-1α, VEGF, IL-6, CD44, EpCAM, og EMT fenotype markører i MiaPaCa-2-tumor sfæriske celler under hypoksiske betingelser
Som vist i figur 5A, redusert CDF behandling av relative mRNA-nivåer av HIF-1α, VEGF, IL-6, CD44, og EpCAM i MiaPaCa-2 tumor sfæriske celler under hypoksiske betingelser. På samme måte, nedregulering av MIR-21 ved hjelp av anti-MIR-21 transfeksjon redusert ekspresjon av disse genene i MiaPaCa-2-tumorceller sfære i henhold hypoksiske betingelser. Vi undersøkte også om ikke CDF eller MIR-21 mangel regulerer genuttrykk av EMT markører i MiaPaCa-2 svulst sfære celler i henhold hypoksiske forhold. Vi fant at inaktivering av MIR-21 ekspresjon resulterte i en betydelig reduksjon i de relative mRNA-nivåer av EMT mesenchymale markører ZEB1 og vimentin, og øker den relative mRNA-nivået av epitelial markør E-cadherin i tumor sfæren cellene under hypoksiske betingelser (figur 5A ). Tilsvarende redusert CDF mRNA nivåer av ZEB1, vimentin, og Twist i tumor sfære cellene under hypoksiske forhold (figur 5A).
paneler A og B representerer mRNA og mirnas hhv. Sfæren celler ble transfektert med anit-MIR-21 ved hjelp av transfeksjon reagens, etter produsentens manual. Real time RT-PCR ble ansatt som beskrevet under metodedelen. Barene i figurene indikerer SD n = 3. * indikerer p. 0,05
Effekt av CDF på miRNA uttrykket i MiaPaCa-2 tumor sfære celler etter hypoksisk forhold
Nyere eksperimentelle bevis har vist at hypoksi kan regulere uttrykk for en rekke miRNAs, inkludert anti-onkogen (la-7 og MIR-101), og pro-onkogene (MIR-21 og MIR-210) mirnas [10], [ ,,,0],12], [13], [15], [23], [24].
