Abstract
Drug motstand er et hinder for effektiv behandling av eggstokkreft. Vi og andre har vist at den insulin-lignende vekstfaktor (IGF) signalveien er en ny potensielt mål for å overvinne resistens. Hensikten med denne studien var å validere IGF2 som en potensiell terapeutisk mål i resistent eggstokkreft og for å bestemme effekten av målretting IGF2
in vivo
. En analyse av The Cancer Genome Atlas (TCGA) data i serøs eggstokkreft kohort viste at høy IGF2 mRNA-ekspresjon er signifikant assosiert med kortere intervall til sykdomsprogresjon og død, er kliniske indikasjoner på medikamentresistens. I en genetisk forskjellige panel av ovarian cancer cellelinjer, ble IGF2 mRNA-nivåer målt i cellelinjer som er resistente mot forskjellige mikrotubul-stabiliserende midler, inkludert taksol funnet å være signifikant forhøyet sammenlignet med medikamentsensitive cellelinjer. Effekten av IGF2 knockdown på Taxol motstand ble undersøkt
in vitro Hotell og
in vivo
. Forbigående IGF2 knockdown betydelig lysfølsomt legemiddelresistent celler til Taxol behandling. En taxol-resistente eggstokkreft xenograft-modell, utviklet fra HEI-T30-celler, viste ekstrem medikamentresistens, karakterisert ved at den maksimale tolererte dosen av Taxol ikke forsinke tumorvekst hos mus. Blokkering av IGF1R (a transmembrane reseptor som overfører signaler fra IGF1 og IGF2) ved anvendelse av et monoklonalt antistoff endret ikke den respons til Taxol. Men stabil IGF2 knockdown ved hjelp av kort hårnål RNA i HEY-T30 effektivt restaurert Taxol følsomhet. Disse funnene validere IGF2 som en potensiell terapeutisk mål i resistent eggstokkreft og viser at direkte rettet mot IGF2 kan være å foretrekke strategi i forhold til målgruppe IGF1R alene
Citation. Brouwer-Visser J, Lee J, McCullagh K, Cossio MJ, Wang Y, Huang GS (2014) Insulin-like Growth Factor 2 lyddemping Gjenoppretter Taxol følsomhet i Drug Resistant eggstokkreft. PLoS ONE 9 (6): e100165. doi: 10,1371 /journal.pone.0100165
Redaktør: Shannon M. Hawkins, Baylor College of Medicine, USA
mottatt: 28 februar 2014; Godkjent: 22 mai 2014; Publisert: 16 juni 2014
Copyright: © 2014 Brouwer-Visser et al. . Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering: Grant støtte ble gitt av National Cancer Institute-National Institute of Child Health and human Development (K12 HD00849) og den amerikanske kongressen of Fødselsleger og Gynekologer gjennom kjønnsforsker Development Program prisen til GSH. Forfatterne erkjenner bruk av Albert Einstein kreftsenter delte ressurser (flowcytometrisystemer Kjerne, histologi og Comparative patologi kjerne), støttet av National Cancer Institute Cancer Center Support stipend P30CA013330. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er den ledende årsak til gynekologisk kreft dødsfall i USA. Siden midten av 1990-tallet, standard behandling for eggstokkreft er kirurgisk cytoreduksjon og systemisk kjemoterapi, vanligvis Taxol og platina [1]. Men flertallet av pasientene til slutt gi etter for tilbakevendende, progressiv sykdom på grunn av resistens mot kjemoterapi
I tillegg til sine godt etablerte roller i utvikling og vekst, aldring og karsinogenese [2] -. [6], insulin-lignende vekstfaktor (IGF) signalveien er nylig blitt implisert i medikamentresistens [7] – [11]. Som vi tidligere har rapportert, er oppregulering av insulinlignende vekstfaktor 2 (IGF2) en akutt cellulær respons overfor Taxol behandling, og dets ekspresjon modulerer respons til Taxol i medikament-resistente ovarie cancer-cellelinjer. [7]. Siden Taxol brukes i førstelinjebehandling av ovarialcancer, hypotese vi at høy IGF2 ville bli assosiert med egen klinisk resistens, manifestert som redusert tid til sykdomsprogresjon /tilbakefall hos pasienter. Støtte denne hypotesen, vår tidligere studie ved hjelp av en vev microarray tilnærming indikerte at høy IGF2 uttrykk i eggstokkreft svulstvev var faktisk prediktiv for forkortet intervallet til progresjon /tilbakefall.
Basert på disse laboratorie- og kliniske data, fant vi ut at IGF2 er en potensiell terapeutisk mål å bedre legemiddelresistens i eggstokkreft, men så vidt vi vet, ingen tidligere
in vivo
validerings studier har blitt gjort. Derfor, som beskrevet her, utførte vi studier for å vurdere om Taxol motstand kan overvinnes
in vivo
ved å målrette IGF2. Vi undersøkte virkningen av IGF2 knockdown på ikke bare Taxol effekter, men også responsen på ikke-taxan mikrotubulidynamikk samspill stoffer, og andre stoffer som vanligvis brukes ved behandling av eggstokkreft. For å bekrefte den kliniske relevansen av våre funn, en analyse av serøs eggstokkreft kohort av The Cancer Genome Atlas (TCGA) ble gjort for å evaluere forholdet mellom IGF2 uttrykk og kliniske resultater.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle dyreforsøk ble gjort med godkjenning av Institutional Animal Care og bruk Committee (Protocol 20130604) av Albert Einstein College of Medicine av Yeshiva University. Institutional Animal Welfare Assurance (A3312-01) for dette anlegget er fullt akkreditert av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) siden 22. februar ble 1983. Dyr ivaretatt i henhold til dyrevernloven og NIH «guide for omsorg og bruk av forsøksdyr».
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og reagenser
ovarialcancer cellelinjer A2780 [12] og HEY [13] (type gaver fra Dr. Susan Band Horwitz), og ovarialcancer cellelinje NIH: OVCAR8 [14] (en slags gave fra Dr. David Goldman) ble dyrket i RPMI-1640 (Life Technologies) med 10% Fetal Bovine Serum (Life Technologies) og 1% Penicillin /streptomycin (Life Technologies) ved 37 ° C med 5% CO
2. Alle resistente cellelinjer ble generert av forfatterne, bortsett HEY-Epo8 (en gave fra Dr. Susan Band Horwitz) som ble utviklet av Dr. C-P Huang Yang hjelp epotilon B [15]. Taxol-resistente HEI-T30-cellelinjen ble generert fra HEY-celler, som beskrevet tidligere [7]. A2780-T15-cellelinjen ble dannet på lignende måte fra A2780 ved hjelp av Taxol utvalg, men i den kontinuerlige nærvær av 15 uM verapamil (Sigma). A2780-B20 og HEY-B20 ble valgt for resistens mot ixabepilone (Ixempra Bristol-Myers Squibb), og OVCAR8-D30 til diskodermolid. Cellelinjer ble autentisert ved bruk av Genemarker 10 kit (Promega). Resistente cellelinjer ble matchet til sine sensitive linjer og publiserte data når det er tilgjengelig. Cellelinjer ble rutinemessig undersøkt for mycoplasma med MycoAlert (Lonza). Celler ble dyrket i medikamentfritt medium i minst 18 timer før forsøkene bortsett A2780-T15, som ble dyrket i nærvær av 0,5 nM Taxol. Klinisk formulert Taxol (Hospira) ble fortynnet seks ganger i 5% dekstrose vann (Hospira) til en sluttkonsentrasjon på 1 mg /ml for xenograft eksperimenter. NVP-AEW541, en liten molekylvekt kinase hemmer av IGF1R, ble gitt av Novartis Pharma AG [16]. Et monoklonalt antistoff mot IGF1R, IMC-A12 (Cixutumumab) ble levert av Imclone, et heleid datterselskap av Eli Lilly and Company.
IGF2 Gene Expression Analysis i kliniske prøver for eggstokkreft
cBioPortal for Cancer Genomics ble brukt for å få tilgang til genekspresjon og kliniske data fra Kreft Genome Atlas Project (TGCA) [17]. Spørringen ble utført med alt komplett Svulster av Ovarian Serous Cystadenocarcinoma (TCGA, Nature 2011) datasett, som omfatter 489 tilfeller av høy klasse serøs eggstokkreft. For IGF2 mRNA Expression Z-score, en terskel på 1,6 standardavvik over gjennomsnittet definert IGF-høy gruppe; alle andre tilfeller ble inkludert i IGF2-normal gruppe.
Kvantitativ PCR
Cellelysater ble homogenisert ved hjelp Qiashredder kolonner (Qiagen Inc., Valencia, CA) og total RNA ble isolert ved RNeasy Mini Kit (Qiagen). RNA konsentrasjon og renhet ble evaluert ved hjelp av en Nanodrop spektrofotometer (Fisher Thermo Scientific), som viser OD 260/280 ratio rekke 02.03 til 02.11. RNA integritet ble samplet ved hjelp av en Agilent Bioanalyzer (Agilent Technologies), viser en RIN poengsum rekke 9,8 til 10 år komplementær DNA ble gjort ved å utføre revers transkripsjon (RT) ved hjelp av Super VILO cDNA Synthesis Kit (Life Technologies) i henhold til produsentens anvisninger, ved anvendelse av 1 ug total RNA for alle cellelinjer med unntak av A2780, A2780-T15 og A2780-B20, hvor 2 ug total RNA ble benyttet. Kvantitativ real-time PCR ble utført ved bruk av en Eppendorf Mastercycler ep
realplex2
ved hjelp av en tre-trinnsmetoden (95C 10 min, etterfulgt av 40 sykluser av 95 ° C i 10 sek, 60 ° C i 20 sek, 72C til 20 sekunder; deretter for å smelte kurve 95C 15 sek, 60 ° C til 95 ° C i løpet av 20 min). Hver reaksjon benyttet 1/20 av cDNA-reaksjon, forover og revers primere med en sluttkonsentrasjon på 200 nM, og PowerSYBR (Applied Biosystems, Foster City, CA) fortynnet i ultrarent vann (Life Technologies) for å 1X sluttkonsentrasjon i et endelig reaksjons volum på 10 ul. Exon junction-spenner primere (Tabell S1) ble validert ved analyse av smeltekurver og forsterkning effektivitet. Et mRNA-ekspresjon resultatet ble beregnet ved anvendelse av formelen * 1000 hvor A C
t er forskjellen i C
t (syklus terskel) mellom genet av interesse og den indre normalisering genet,
PPIB plakater ( peptidylprolyl isomerase B; cyklofilin B).
PPIB
ble bekreftet å ha stabile mRNA uttrykk nivåer i foreldre, resistent, og transfektert eggstokkcellelinjer inkludert: HEY, HEY-T30, HEY-B20, HEY-T30 shIGF2-p, HEY-T30 shIGF2 -V, HEY-T30 shScrambled, A2780, A2780-T15, A2780-B20. Gjennomsnittlig forskjell i C
t-verdier ved vurdering
PPIB
uttrykk i parvise sammenligninger av disse cellelinjene var 0,2 (95% konfidensintervall fra -0,1 til 0,5). Fold-endring i relativ mRNA-ekspresjon ble beregnet ved anvendelse av metoden [7]. Genomisk DNA ble isolert med den AllPrep mini kit (Qiagen). Primere ble utviklet for å spenne en intron-exon krysset og ble validert ved smelting og effektivitet kurve analyse. Albumin (
ALB
) ble anvendt for intern normalisering. Ved å rekke komparativ genomisk hybridisering, ble HEY cellene funnet å ha to kopier av
IGF2
,
ABCB1
og
ALB
gener (data ikke vist). Kopier nummer variasjon ble bestemt fra qPCR av genomisk DNA ved hjelp av metoden og sette HEY til 2 eksemplarer [18].
Formerinasanalyse Kinetics og cytotoksisitetsassayer
For spredning kinetikk, celler ble sådd i 6- brønners plater. Hver 24. time, to brønner ble talt ved hjelp av et septer Counter (Millipore). For cytotoksisitetsanalyser ble celler sådd i en 96-brønners plate. Etter 24 timer ble cellene behandlet med serielle fortynninger av den indikerte stoffet, med en fast konsentrasjon på 1 uM NVP-AEW541 eller 10 ug /ml IMC-A12 hvis indikert. Etter 72 timers behandling, ble det relative celleantall i hver brønn bestemt ved å bruke Sulforhodamin B assay [7]. IC
50 er den medikamentkonsentrasjon som svarer til en reduksjon i celleantall 50% beregnet ved hjelp av dose-effekt kurven.
ELISA for Reseptor Fosforylering
Cellene ble dyrket i komplett medium for 24 timer, deretter serum-sultet i 12 timer før stimulering i 10 minutter med rekombinant IGF2 (50 ng /ml; Abcam) eller insulin (50 nM; Sigma), med eller uten forbehandling av cellene med NVP-AEW541 (1 uM) eller IMC-A12 (10 mikrogram /ml) i 2 timer. Celler ble lysert ved bruk av NP40-baserte lyseringsbuffer med PhosSTOP (Roche) og protease-inhibitor cocktail (Sigma). Etter proteinkvantifisering, den DuoSet IC Menneskelig Phospho-IGF-1 R og Phospho-Insulin R (R validering av disse funnene ble gjort for dette manuskriptet ved hjelp av to nye unike oligonukleotidsekvenser tilfeldig navngitte siIGF2-1 og siIGF2-2. For A2780-T15-celler, ble to oligonukleotidsekvenser brukes, tilsvarende den første siRNA som brukes i HEI-T30 (vilkårlig navngitt siIGF2-3), så vel som den nye oligonukleotid siIGF2-1. For stabil knockdown bruker BLOCK-iT induserbar H1 Lentiviral RNAi System (Life Technologies), ble vektorer utformet for å gi uttrykk for en shRNA targeting IGF2, eller en ikke-måls kontroll (shScrambled). HEY-T30 celler ble transfektert med plasmid direkte eller med lentiviral partikler, deretter velges med zeocin (Life Technologies). Kloner av plasmid-transfekterte celler og lentivirale-transfekterte celler ble screenet for IGF2 knockdown. Klone med lavest IGF2 mRNA uttrykk fra hver gruppe ble brukt for senere eksperimenter.
Cellesyklus og apoptose analyse
Celler ble behandlet som beskrevet i figuren legender. Etter 16 timer ble adherente celler og flytende oppsamlet. For cellesyklusanalyse, ble cellene fiksert med 70% kald etanol i 1 time, og deretter inkubert med 20 ug /ml propidiumjodid (Sigma) og 100 ug /ml RNase (Fisher Scientific Thermo) i PBS. For apoptose analyse ble Violet Proporsjonellekspansjon Membran Asymmetri Probe /død celle apoptose Kit (Life Technologies) som brukes i henhold til produsentens protokoll. Et fiolett fargestoff nervøs 4′-N, N-dietylamino-6- (N, N, N-dodecyl-metylamino-sulfopropyl) -metyl-3-hydroxyflavone (F2N12S) ble anvendt for påvisning av membran asymmetri endringer som inntreffer i løpet av tidlig apoptose, noe som resulterer i et redusert forhold på 585 nm til 530 nm emisjon. Samtidig ble SYTOX (R) AADvanced anvendt som en død celle flekk. Ved hjelp av ufargede celler og kontroll ubehandlede celler, ble gating av kvadranter bestemt; leve, apoptotisk, og døde celler ble kvantifisert ved hjelp FlowJo (Treestar).
legemiddelutstrømning Analyse
To hundre tusen HEY og HEY-T30 celler ble resuspendert i 1 ml varm PBS + 5% FBS . Alle inkubasjons-trinn ble utført ved 37 ° C i cellekulturinkubator. Verapamil (15 uM) eller NVP-AEW541 (1 uM) ble tilsatt, og prøvene ble inkubert i 1 time. Deretter 50 uM av Tubulin Tracker grønn-reagens (Oregon grønn 488 Taxol, bis-acetat) (Life Technologies) ble tilsatt, og prøvene ble inkubert i 45 minutter. Celler ble pelletert deretter resuspendert i PBS + 5% FBS, med verapamil eller NVP-AEW541 hvis angitt, og inkubert i ytterligere 20 minutter, vasket i PBS og farget med TO-PRO-3 (Life Technologies). Celler ble umiddelbart analysert ved hjelp av en FACSCanto II (BD) og FlowJo; TIL-PRO-3 positive celler (døde celler) ble silt ut og de gjenværende celler ble fremstilt grafisk for å bestemme merket Taxol oppbevaring [19].
Statistical Analysis
For hver analyse, data var fra i det minste to uavhengige eksperimenter. Numrene på replikater per eksperiment er beskrevet i figuren sagn. Forskjeller mellom hjelp av to grupper ble analysert ved anvendelse av t-test. For forskjellene mellom tre eller flere grupper, enveis ANOVA med Bonferroni post-test ble brukt. For analyse av to uavhengige variabler, ble to-veis ANOVA med Bonferroni post-test brukt. For å overleve analyse ble logrank test som brukes. Alle P verdier er tosidige og P 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Supplemental Måter
Fil S2 inneholder de materialer og metoder som brukes til å generere p-tubulin mutasjons data (vist i fig. . S1 av Arkiv S1) og IGF2 Western blot data (vist i figur. S2E av File S1).
Resultater
Vår tidligere studie av IGF2 protein uttrykk ved hjelp av en vev microarray av epitelovarialcancer svulster viste at høy vev uttrykk nivåer av IGF2 var assosiert med en forkortet intervall til progresjon /tilbakefall [7]. Siden da ble genuttrykk data fra 489 klinisk kommenterte stadium II-IV høyverdig serøs eggstokkreft prøver av Kreft Genome Atlas-prosjektet (TCGA) gjort tilgjengelig gjennom cBioPortal for Cancer Genomics [17]. Ved hjelp av disse dataene portal, testet vi et forhold av IGF2 uttrykk og iboende resistens, hvor høy IGF2 ble definert som 1,6 SD over gjennomsnittet, tilsvarende 94-95th persentilen i en normalfordeling. Ved å bruke dette kuttet score, størrelsen på IGF2 høye gruppe tilnærmet brøkdel av eggstokkreft pasienter som forventes å ha egenmedikamentresistente svulster, manifestert ved progresjon under eller kort tid etter endt kjemoterapi. I vår analyse av TCGA data, vi faktisk fant at høy IGF2 mRNA uttrykk i tumorvev signifikant korrelert med en forkortet intervall til progresjon /tilbakefall, dvs. progresjonsfri overlevelse (Fig. 1a). Median progresjonsfri overlevelse i denne gruppen var mindre enn 12 måneder, indikerer iboende resistens. Høy IGF2 mRNA uttrykk også korrelert med vesentlig forkortet total overlevelse (Fig. 1B). Multivariat analyse ble ikke aktivert av disse dataene portal, men i vår tidligere publikasjon bemerket vi en sammenslutning av IGF2 uttrykk med høyere stadium og grad [7].
IGF2 uttrykk og eggstokkreft overlevelse. Bruke cBioPortal for Cancer Genomics for å analysere data fra Kreft Genome Atlas studie av eggstokkene serøs cystadenocarcinoma, sammenlignet vi progresjonsfri overlevelse og total overlevelse hos pasienter med høy tumor nivåer av IGF2 mRNA (større enn 1,6 standardavvik over gjennomsnittet; grå linje) og de med normale kreft nivåer av IGF2 mRNA (alle andre pasienter, svart linje). Pasienter med høye IGF2 mRNA nivåer hadde betydelig forkortet progresjonsfri overlevelse (A) og total overlevelse (B). (C) IGF2 uttrykk i følsomme og resistente cellelinjer. Ved hjelp av RT-qPCR, målte vi IGF2 mRNA-nivå i seks medikamentresistente ovarie carcinom cellelinjer og deres tre cellelinjer med opprinnelse. Alle legemiddelresistent cellelinjer har betydelig høyere IGF2 mRNA uttrykk i forhold til deres sensitive cellelinje opprinnelsesland. Linjer viser gjennomsnitt ± SEM av IGF2 mRNA-ekspresjon stillingen i minst to uavhengige eksperimenter for hver cellelinje, hvert foretatt in triplo, og symbolet over linjen angir den statistiske signifikans sammenlikne den resistente cellelinje med dets paren motstykke; * P 0,05, *** p 0,001, **** p 0,0001 ved Enveis ANOVA med Bonferroni posttest. (D) ABCB1 uttrykk. ABCB1 mRNA uttrykk nivåene ble målt med RT-qPCR i HEY, HEY-T30, A2780 og A2780-T15. HEY-T30 har høyere ABCB1 mRNA uttrykk i forhold til de andre cellelinjer. Linjer viser gjennomsnitt ± SEM av ABCB1 mRNA-ekspresjon stillingen i minst fire uavhengige eksperimenter for hver cellelinje, hvert foretatt in triplo, (E) ABCB1 DNA kopiantall. Ved qPCR utført på genomisk DNA, har HEY-T30 en seksdobling i ABCB1 DNA-kopi tall som angir genamplifikasjon. Linjer viser gjennomsnitt ± SEM av to uavhengige eksperimenter, hver utført i tre eksemplarer.
Vi viste tidligere at IGF2 mRNA nivåene øker under akutt Taxol behandling, og vi hypotese at oppregulering av IGF2 er assosiert med vedvarende gjenlevende celler som gir opphav til resistente tilbakevendende sykdom. For å studere medikamentresistens i laboratoriet, taxol, så vel som ikke-taxan mikrotubul-stabiliserende midler (MSAS), ixabepilone, diskodermolid, og epotilon B, ble brukt til å utvikle seks distinkte resistente cellelinjer. Som bestemmes av real-time PCR, hadde alle MSA-resistente cellelinje modeller forhøyet IGF2 mRNA uttrykk i forhold til deres sensitive foreldrelinjen (Fig. 1C). Siden Taxol er uten tvil det mest klinisk brukt blant disse stoffene, følgende eksperimenter fokusert på Taxol resistente cellelinjer HEY-T30 og A2780-T15.
Vi har evaluert legemiddelresistent cellelinjer for andre mekanismer for Taxol motstand [ ,,,0],20], [21]. HEY-T30 har ABCB1 mRNA løpet uttrykk (Fig. 1 D) forbundet med genomisk forsterkning av
ABCB1 plakater (Fig. 1E), mens HEY har ingen kopiantall endring av
ABCB1
. Disse funnene ble bekreftet av utvalg komparativ genomisk hybridisering (data ikke vist). A2780-T15 ble valgt i nærvær av verapamil og som ikke overuttrykker ABCB1 (fig. 1D), og heller ikke A2780-T15 eller A2780 har DNA-kopi antall endring av
ABCB1 plakater (fig. 1E). Vi fant ingen signifikant sammenheng mellom IGF2 og ABCB1 uttrykk i vårt panel av cellelinjer (Fig. S3 av File S1). DNA-sekvensering viste at A2780-T15 har en mutasjon (glycin i posisjon 360 er endret til et asparaginsyre) i den Taxol-bindende lomme av β-tubulin (fig. S1A og S1B for filt S1), mens HEI-T30 har ikke noen en mutasjon i β-tubulin.
HEY-T30 proliferated på samme måte i Taxol-frie medier eller media som inneholder lave konsentrasjoner av Taxol (≤30 nM) (fig. 2A). A2780-T15 proliferert mye saktere i Taxol-frie media enn i media inneholdende Taxol (≤15 nM) (fig. 2B), hvilket antyder mulig Taxol avhengig vekst forbundet med sin β-tubulin mutasjon. Når lavdose Taxol var til stede, A2780-T15 proliferated med en lignende hastighet som A2780. De resistente cellelinjer viste kryssresistens overfor ixabepilone, en MSA som deler en felles β-tubulin bindingssted med Taxol. Utvidet profilering av HEY-T30 (Fig. 2C, venstre panel) viste motstand mot microtubule-destabiliserende narkotika vinblastin og motstand mot doxorubicin, men ligner følsomhet for cisplatin, sammenlignet med foreldre HEY. A2780-T15 (fig. 2C, høyre panel) ble kryss-resistent til begge doxorubicin og CDDP, men var mer følsomme for vinblastin. Overfølsomhet for mikrotubulidynamikk-destabiliserende narkotika har blitt observert tidligere i en annen resistent cellelinje huse en β-tubulin mutasjon som var forbundet med avhengighet av mikrotubulidynamikk stabiliserende medikamenter for spredning [22].
Formerinasanalyse kinetikk cellelinjer. Celler ble dyrket i komplett medium med den angitte konsentrasjon av Taxol i 6-brønners skåler, og celler fra to brønner hver talt hver 24 timer. (A) HEY-T30 celler i nærvær eller fravær av 30 nM Taxol sprer saktere enn HEY celler (p 0,05, Gjentatte Tiltak Toveis ANOVA, Bonferroni posttest). (B) A2780-T15 i nærvær av 2 nM og 15 nM Taxol vokse på samme måte som A2780. Men i fravær av Taxol, A2780-T15 proliferates saktere, noe som tyder Taxol avhengighet (p 0,01, Toveis ANOVA, Bonferroni posttest). Hver vekst kurve representerer gjennomsnittet av minst to uavhengige eksperimenter hver utført i duplikater blir hvert punkt representert som gjennomsnitt ± SEM. (C) IC
50-tallet av cellegifter i sensitive og resistente cellelinjer. I 96-brønners plater, ble cellene behandlet med serielle fortynninger av de angitte medikamenter og konsentrasjonen av 50% proliferasjon hemning (IC
50), fastlagt ved hjelp av SRB-analysen cytotoksisitet. HEY-T30 er kryss-resistente mot ixabepilone og vinblastin. Det er beskjeden kryssresistens mot doxorubicin, men ikke til CDDP. A2780-T15 er kryss-motstandsdyktig mot ixabepilone, og beskjedent kryss-resistent mot doksorubicin og CDDP, men mer følsomme for vinblastin. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM fra minst tre uavhengige eksperimenter utført med seks replikater. P-verdier beregnet ved uparet t-test. (D, E) Sammenligning av HEY-T30 og HEY xenograft respons på Taxol. Etter subkutan injeksjon av HEY-T30 eller HEY celler, ble musene delt inn i behandlingsgrupper på 6 dyr hver. Når den gjennomsnittlige xenograft volumet nådde 120 mm
3, Taxol behandling ble administrert ved den maksimale tolererte dosen (MTD) og 20 mg /kg intraperitonealt hver tredje dag i fem behandlinger (behandlingsdag: 0, 3, 6, 9, 12 ), noe som resulterer i en kumulativ dose på 100 mg /kg. Kontrolldyrene mottok intraperitoneale injeksjoner av fortynningsmiddel (5% dekstrose i vann, D5W) i henhold til det samme plan. Tumorene ble målt hver tredje dag, og midlere tumorvolum ± SEM for hver gruppe er vist ved hvert tidspunkt. HEY xenografter svart på Taxol behandling, som potent undertrykte tumorvekst (Fig 2D;. Stiplet blå linje). HEY-T30 xenografter ikke svare på Taxol behandling (Fig 2E,. Stiplet oransje linje) og vokste med en lignende hastighet som behandlede HEY-T30 xenografter. HEY Taxol vs HEY D5W på dag 19, p 0,001; uparet t-test.
Et kritisk punkt i å oversette laboratoriefunn i mulige behandlinger for pasienter er å gjennomføre
in vivo
testing ved bruk av dyremodeller. Siden A2780-T15 celler var avhengig av Taxol for deres vekst, men HEY-T30 var ikke, vi evaluert HEY-T30 som xenograft modell for
in vivo
testing av terapeutiske strategier rettet mot legemiddelresistens. Vi administreres Taxol ved hjelp av tidligere bestemte maksimale tolererte dose (MTD, kumulativ dose på 100 mg /kg) [23] for å vurdere medikamentresistens
in vivo
. Foreldre HEY xenograft vekst ble effektivt undertrykt av Taxol, som indikerer følsomhet for Taxol (Fig. 2D). I kontrast, Taxol unnlatt å hemme HEY-T30 xenograft vekst i forhold til kjøretøy (5% dekstrose i vann; D5W) behandling, noe som indikerer resistens (Fig 2E.)
For å legge strategier hvordan å målrette IGF2-mediert stoffet. motstand, undersøkte vi reseptor ekspresjon og aktivering i de medikamentresistente og sensitive cellelinjer. Tidligere publiserte studier indikerte at IGF2-binding induserer autofosforylering av IGF1R og insulinreseptoren isoformen A, IR-A [24], [25], noe som resulterer i reseptoraktivering og nedstrøms signalisering til effektor molekyler, slik som AKT. I tillegg ble høy IR-A /IGF1R uttrykk forbundet med resistens overfor anti-IGF1R terapier, som signalisering gjennom IR-A kan omgå avhengighet av IGF1R [26]. Vi fastslått at IGF1R mRNA uttrykk var høyere i HEY og HEY-T30, sammenlignet med A2780 og A2780-T15, uten betydelige forskjeller mellom de sammenkoblede følsomme og resistente linjer (Fig. 3A). Som vist på fig. 3B, IR-A nivåer var lavere i HEY og HEY-T30 i forhold til A2780 og A2780-T15. Real time PCR data ble også analysert med korreksjon for forskjeller i forsterkning effektivitet mellom primer sett (Tabell S1 av File S1), med tilsvarende funn. Ved Western blot, IGF1R og IR proteinekspresjon tilsvarte mRNA-nivåer (data ikke vist). Dermed HEY og HEY-T30 hadde lavere IR-A /IGF1R forhold enn A2780 og A2780-T15.
(A) IGF1R mRNA av sensitive og resistente cellelinjer. Målt ved hjelp av RT-qPCR (n = 5 uavhengige eksperimenter hvert foretatt in triplo), IGF1R mRNA-nivåer er like når resistente cellelinjer sammenlignet med foreldrecellelinjer med opprinnelse. Linjer viser gjennomsnitt ± SEM. (B) IR mRNA av sensitive og resistente cellelinjer. Målt ved RT-qPCR (n = 5 uavhengige eksperimenter hver utført i tre eksemplarer) IR-A og IR-B mRNA nivåer i HEY-T30 er betydelig redusert sammenlignet med HEY, mens tilsvarende nivåer er observert ved sammenligning av A2780-T15 til A2780. Linjer viser gjennomsnitt ± SEM, **** p 0,0001; uparet t-test. (C) Phospho-IGF1R og fosfor-IR ELISA i HEY-T30. Cellene ble sultet over natten, inkubert med 1 pM NVP-AEW541 eller 10 ug /ml IMC-A12 i 2 timer, stimulert med 50 ng /ml IGF2 eller 50 nM insulin i 10 minutter, ble lysert, og nivåer av fosforylert IGF1R og IR bestemmes av ELISA. Både IGF2 og insulin forårsaket 5- til 6-fold-change økte nivåer av fosfor-IGF1R som kan bli undertrykt av NVP-AEW541 eller IMC-A12. Endringene i fosfor-IR etter stimulering med IGF2 eller insulin var mye mindre (fold-endring 1,5). Barer skildre gjennomsnitt ± SEM-gangers endring fosforylering nivåer av minst to uavhengige forsøk, hvert utført i duplikat. (D) Phospho-AKT og fosfo-ERK-Western blot. Cellelysater fremstilt som beskrevet i (C) ble anvendt for immunblotting ved bruk av fosforylering spesifikke AKT og ERK antistoffer. IGF2-indusert AKT fosforylering på treonin 308 og serin 473 ble undertrykt av NVP-AEW541 og IMC-A12, mens total AKT var uendret. Ingen effekt ble observert på fosfo-ERK nivåer. Ett representativt eksperiment av to uavhengige eksperimenter er vist. Lik protein lasting ble bekreftet av Ponceau farging og GAPDH immunoblotting. (E) Phospho-IGF1R og fosfo-IR ELISA i A2780-T15. Celler ble fremstilt på lignende måte (C). IGF2 og insulin forårsaket 7-ganger og 10 ganger høyere nivåer av fosfo-IGF1R, henholdsvis, og dette kan undertrykkes ved å NVP-AEW541 eller IMC-A12. Nivåer av fosfor-IR etter IGF2 eller insulin stimulering økte også, fire ganger og 9 ganger, henholdsvis. Som vist på fig. ** P 0,01;
