Abstract
Å belyse funksjon av MAS-relaterte GPCR, medlem D (MRGD) i kreft, vi undersøkte
in vitro Hotell og
in vivo
onkogene funksjon av MRGD hjelp murine fibroblast cellelinje NIH3T3 der MRGD er stabilt uttrykt. Uttrykket mønster av MRGD i kliniske prøver ble også analysert. Vi fant at overekspresjon av MRGD i NIH3T3 indusert fokusdannelse og multi-cellulær sfæroide formasjon, og fremmet tumorer i nakne mus. Med andre ord, overekspresjon av MRGD i NIH3T3-indusert tap av kontakt-inhibering, forankrings-uavhengig vekst og
in vivo
tumorigenesis. Videre ble det funnet at liganden av MRGD, beta-alanin, forbedret sfæroide dannelse i MRGD-uttrykkende NIH3T3 celler. Fra undersøkelser av kliniske kreft vev, fant vi høy uttrykk for MRGD i flere lungekrefttilfellene ved immunhistokjemi samt sanntid PCR. Basert på disse resultatene, kan MRGD være involvert i tumordannelse, og kan også være en roman kreft narkotika mål
Citation. Nishimura S, Uno M, Kaneta Y, Fukuchi K, Nishigohri H, Hasegawa J et al. (2012) MRGD, en MAS-relaterte G-protein koblet reseptor, Fremmer Tumorigenisis og uttrykkes sterkt i lungekreft. PLoS ONE 7 (6): e38618. doi: 10,1371 /journal.pone.0038618
Redaktør: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kina
mottatt: 05.09.2011; Akseptert: 8. mai 2012; Publisert: 08.06.2012
Copyright: © 2012 Nishimura et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av Daiichi Sankyo Co Ltd de bevilgende myndighet hadde rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere og utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. SN, MU, YK, KF, HN, JH, NK, FN, og TA er ansatt i Daiichisankyo Co Ltd Denne studien ble også finansiert av Daiichi Sankyo Co Ltd Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
G-protein-koblet reseptor (GPCR) familiemedlemmer aktivere diverse fysiologiske signalering og spiller en viktig rolle i utviklingen, så vel som funksjon av hvert organ [1]. I tillegg har ulike GPCR blitt funnet å være overuttrykt i grunnskolen og metastatiske tumorceller i hode og hals plateepitelkarsinom, ikke-småcellet lungekreft, brystkreft, prostatakreft og mage svulster, melanom og diffust store B-celle lymfom [2]. Noen GPCR har også blitt rapportert å være funksjonelt involvert i kreft progresjon [3], som for eksempel gastrin-frigjørende peptid reseptor (GRPR) i prostatakreft [4], CXCR4 i metastase [5] og så videre. MAS1, er den første GPCR for å bli rapportert til å ha noe forhold til kreftutvikling. Det ble rapportert at NIH3T3 celler ectopically uttrykker MAS1 fremmet fokus formasjon
in vitro Hotell og tilrettelagt tumorigenesis i nakne mus [6] imidlertid verken betydelig MAS1 uttrykk eller aktiv MAS1 mutasjon har blitt rapportert i kliniske kreftformer, derfor rollen MAS1 i kreft er fortsatt uklart. På den annen side ble høy ekspresjon av MAS1 observert i sentralnervesystemet, slik som hippocampus og lillehjernen, og MAS1 forbedret ligand-avhengige kalsiuminnstrømningen av Ang II reseptor (AT2R) hvor MAS1 dannet et kompleks med AT2R. Dette tyder på at MAS1 spiller en viktig rolle i det sentrale nervesystem [7], [8].
MAS-forbindelse G-proteinkoblet reseptor, D (MRGD), også referert til som hGPCR45 [9] eller TGR7 [10], ble identifisert som en ny GPCR i murine og humane genom [11]. Det ble funnet at MRGD tjener som reseptoren av beta-alanin [12]. Flere MRG familiemedlemmer ble rapportert å ha spesifikk subpopulasjoner av sensoriske nevroner, som oppdager smertestimuli [11]. Som for MRGD, ble dets ekspresjon funnet i dorsale rotganglier (DRG) og samlokalisert med vanilloid-reseptor-1 (VR-1), som er et viktig reseptor for varme og smertefølelse [12]. Videre genetisk ablasjon av MRGD uttrykke nevron reduserer atferds følsomhet for skadelige mekaniske stimuli, men ikke for varme eller kalde stimuli hos mus [13]. Dermed er MRGD anses å være en av spillerne i smerte sensasjon og /eller transduksjon. Det ble også rapportert at MRGD transduces intracellulær signalisering av angiotensin (Ang) II metabolitt, Ang- (1-7) [14]. Som beskrevet ovenfor, har den funksjon av MRGD i sentralnervesystemet blitt observert av flere grupper.
Det er flere GPCR familiemedlemmer som viser aminosyre- sekvenslikhet til MAS1 slik som MRGA, MRGB, MRGC, MRGD, MRGE , MRGF, MRGG, MRGH og MRGX [11]. I fylogenetiske trær i MRG-familien, er MAS1, MRGD, MRGE, MRGF og MRGH kategorisert som tilhører samme gren [11]. Dette reiste hypotesen om at genene i fylogenetiske gren inkludert MAS1 kunne ha en likhet i funksjon eller signaloverføring. Vi la merke til at evnen til MAS1 til å fremme tumorigen funksjon i NIH3T3, og i denne studien, forsøkt å belyse den tumorgene funksjon av MRGD, som er rapportert å virke i det sentrale nervesystemet slik som MAS1. Vi har også undersøkt uttrykk for MRGD i humane kreftvevet. Vi fant at MRGD fremmer tap av kontakt-inhibering, forankrings-uavhengig vekst og
in vivo
tumorigenese og er også sterkt uttrykt i flere humane lungekreft, noe som tyder på at MRGD kan spille en viktig rolle i human cancer.
Resultater
effekt av MRGD på celleproliferasjon og tumorigenicity in vitro
for å klargjøre effekten av MRGD på cellevekst, den NIH3T3-MRGD cellelinje, som NIH3T3 celler ble stabilt transfektert med MRGD retrovirusekspresjonsvektor ble etablert og vekstrelaterte profiler ble analysert. Genekspresjonen av MRGD i NIH3T3-MRGD cellelinje ble bekreftet ved RT-PCR og sekvensering (figur S1). Ved hjelp av NIH3T3-celler MRGD, fokusdannelsen analyse (se Materialer og Metoder) ble utført, hvor signifikant foci dannelse ble observert i NIH3T3-MRGD cellekultur, mens ingen slike foci ble sett i NIH3T3-Mock (figur 1A). Disse dataene indikerer at MRGD genekspresjon avbryter kontakt hemming av NIH3T3 celler, en av funksjonene i normale fibroblaster. For å bestemme MRGD sin andre vekstrelaterte funksjoner, de sfæroide vekstanalyse (se Materialer og Metoder) ble utført, hvor NIH3T3-MRGD celler og NIH3T3-Mock-celler dyrket på en 96-brønns ikke-klebende U bunnet plate, respektivt. Først, la vi merke til at større kuler ble observert for NIH3T3-MRGD enn for NIH3T3-Mock på femte dagen etter plating. Den spheroid av NIH3T3-Mock krympet under dyrking, mens det av NIH3T3-MRGD åpenbart vokste dag for dag, som vist i figur 1B. Vi har fastslått denne vekst-relaterte tegnet ved å måle endring i diameteren til kulene, og også ved å måle forskjellen i ATP aktivitet av kulene (figur 1C og D). Betydelig ble observert større diameter sfæroide for NIH3T3-MRGD enn for NIH3T3-Mock fra 2 til 8 dager etter plating (figur 1C, p 0,005, Mann-Whitney U test, 2 haler). Dessuten ble mye mer ATP innhold sett for NIH3T3-MRGD sammenlignet med NIH3T3-Mock 6 dager etter plating (figur 1D, p 0,005, Mann-Whitney U test, 2 haler). Lignende resultater ble oppnådd med [
3H] -tymidin inkorporering analysemåling (figur S2, File S1). Disse resultatene indikerer at MRGD fremmer i betydelig grad forankrings-uavhengig vekst av normal fibroblast, med andre ord, MRGD besitte onkogene evne.
A. Representative bilder av fokus dannelse i monolagkulturer av NIH3T3 celler som stabilt uttrykker Mock (NIH3T3-Mock celler, venstre) eller MRGD (NIH3T3-MRGD celler, til høyre). Cellene ble farget med krystallfiolett etter å fikse med 4% paraformaldehyde. B. Representative bilder av NIH3T3-MRGD eller NIH3T3-Mock spheroid på dag 1 og 7. C. spheroid vekstkurver. De sfæroide størrelser av NIH3T3-MRGD (lukket) eller NIH3T3-Mock (åpen) på dagene 2, 3, 5 og 7, er vist med sine diametre (gjennomsnitt ± SD). * Indikerer p 0,005 (Mann-Whitney U test, 2 haler). D. Cell spredning av sfæroide kulturer av NIH3T3-MRGD eller NIH3T3-Mock. Luminescence av hele cellen ATP innholdet (middel ± SD) ble målt til 6 dager etter plating. * Indikerer p. 0,005 (Mann-Whitney U test, 2 haler)
Effekt av MRGD på celleproliferasjon og tumorigenicity in vivo
Neste, til evaluere
in vivo
tumorigent aktivitet, vi subkutant inokulert NIH3T3-MRGD eller NIH3T3-mock å atymiske nakne mus. Den bemerkelsesverdige veksten av transplantert vev ble observert med mus subkutant implantert med NIH3T3-MRGD celler, men ikke med NIH3T3-Mock-celler (tabell 1). De gjennomsnittlige tumorvolumer NIH3T3-MRGD-celler-podet mus skredet 2000 mm
3 i 21 dager etter vaksinasjonen. I kontrast, ble det ikke bemerkelsesverdig vekst sett i NIH3T3-Mock-celler-podet mus til 21 dager etter vaksinasjonen. En klump av celler ble funnet i NIH3T3-Mock-celler podet mus 24 dager etter vaksinasjonen, men det var fortsatt veldig liten og gjennomsnittlig volum var mindre enn 400 mm
3. Som NIH3T3-MRGD dannet den store klumpen
in vivo
, utførte vi HE flekker å bekrefte at NIH3T3-MRGD klump besatt svulstlignende patologiske funksjoner. HE-farging av de podede vev seksjoner av NIH3T3-MRGD-celler-podet mus viste fibrosarkom-lignende morfologi (fig S3). Til sammen tyder dette resultatet at MRGD uttrykk fører ikke bare
in vitro
men også
in vivo
tumorigenicity.
Induksjon av cellevekst av ligand stimulering
for å evaluere effekten av beta-alanin, en av de MRGD ligandene [12], på sfæroide veksten fremmes ved MRGD, beta-alanin i forskjellige konsentrasjoner ble tilsatt til den sfæroide kultur av NIH3T3-MRGD celler eller NIH3T3-RASV12 celler. NIH3T3-celler Mock ikke vokser godt i sfæroide kultur og ingen stabil vekst ble indusert selv i nærvær av beta-alanin (data ikke vist), og derfor NIH3T3-celle Mock gruppen ble ikke angitt i denne studien. I dette eksperimentet betydelig fremming av cellevekst av beta-alanin i en doseavhengig måte ble observert for NIH3T3-MRGD som målt ved hjelp av ATP-aktivitet (p 0,05, Mann-Whitney U-test, 2-haler), mens ingen effekt av beta-alanin ble sett for NIH3T3-celleklump RASV12 veksten selv med 2000 pg /ml beta-alanin (figur 2). Disse data indikerer at forankrings-uavhengig vekst av MRGD uttrykkende celler kan forbedres ved sin ligand stimulering.
NIH3T3-celler transfektert med MRGD eller RASV12 ble dyrket i RPMI 1640 inneholdende 0,1% BSA og forskjellige konsentrasjoner av beta-alanin for 7 dager. Data ble innhentet fra tre uavhengige cellekulturer (betyr ± SD). * Indikerer p. 0,05 (Mann-Whitney U test, 2 haler), sammenlignet med NIH3T3-MRGD uten beta-alanine, og med NIH3T3-RASV12
Uttrykk av MRGD i humane kreftformer
Vi bestemt MRGD uttrykk i flere kliniske kreftformer. Først, for å klargjøre MRGD proteinekspresjon nivå i lungekreft prøver, utførte vi IHC ved hjelp av et par av tumor og normalt vev seksjoner av 33 parene av humane lungekreft prøver (se Materialer og Metoder). For IHC, ble kanin-anti-MRGD antistoff dannet og antigen spesifisitet av antistoffet ble bekreftet som vist i Materialer og Metoder; fargings signaler av anti-MRGD antistoff ved den ytre membran ble påvist i formalin-fikserte HEK293 /αvβ3 celler transfektert med MRGD, selv om den ikke er i Mock-transfekterte HEK293 /αvβ3 celler (figur 3A og B). Med dette antistoffet, 22 av 33 kliniske lungekreft tilfellene viste MRGD positive signaler (22/33): adenokarsinomer (9/10), dårlig differensiert plateepitelkarsinom (7/10) og godt differensierte plateepitelkarsinom (6 /10) (tabell 2). Vi la merke til spesielt sterke signaler i noen prøver, inkludert adenokarsinomer (8/9) (Figur 3C og S4), dårlig differensiert plateepitelkarsinom (3/7) og godt differensierte plateepitelkarsinom (2/10). På den annen side ble ingen farging signal som detekteres for småcellet karsinom (dato ikke vist).
Cell blokk-prøver ble brukt for å bekrefte spesifisiteten antistoffet i immunfarging. HEK293 /αvβ3 celler transfektert med MRGD ekspresjonsvektor (A) eller Mock vektor (B) er vist. C. Representanten farging av lunge adenokarsinom som er positivt for MRGD.
Vi har også analysert MRGD genuttrykk i kliniske kreft av kvantitativ RT-PCR. Ett hundre og tyve syv sett av RNA-prøver med både kreft og ikke-cancer partier av lunge, spiserør, bryst, nyre, mage, livmor og tykktarmskreft vev ble anvendt. I de prøver av uterus eller tykktarm vev, MRGD ekspresjon i kreft parti aldri oversteg 3 ganger mengden i den normale delen. Som for lungekreft, er gjennomsnittet av MRGD ekspresjon i kreft parti overskredet beløp som tilsvarer 3 ganger så mye som det i lungen normal porsjon, og for 12 av 33 lunge par prøver, MRGD ekspresjon i kreftpartiet skredet 3 ganger beløpet i den sammenkoblede normal porsjon (figur 4). I alle 7 kreftarter bestemmes her, lunge paret prøvene viste den høyeste frekvensen (36%) av høyere MRGD ekspresjon i kreft del i forhold til den for den normale delen med kriteriene som overstiger 3 ganger den mengde (figur 4). Noen andre kreftprøvene, for eksempel bryst (3 av 16), spiserør (2 av 12), nyrer (1 av 10) og mager (1 ut av 25) viste også 3 ganger høyere ekspresjon i kreftpartiet sammenlignet til at i den normale delen. Vi fikk ikke se en statistisk forskjell i den generelle sammenligning av mRNA signal mellom normale og kreft porsjoner i hver krefttype ved enveis ANOVA. Mer presis kategorisering av pasientene må være nødvendig for å oppnå statistisk signifikans. Men dataene klart indikerer at over tre-ganger høyere uttrykk signaler er vist i tumoren i stedet for den normale delen i noen kreftpasienter. Økt ekspresjon av kreft partiet i lungekreft var også meget konsistent med resultatene av IHC. Dette tyder på at dataene er meget meningsfylt for å indikere den neste retning av forskning på MRGD ekspresjon i kreft.
Ett hundre og tyve syv sett av RNA-prøver av kreft og ikke-cancer partier fra de samme pasienter med lunge ( n = 33), spiserør (n = 12), bryst (n = 16), nyre (n = 10), mage (n = 25), livmor (n = 12) eller tykktarmen (n = 19) kreft. Forhold mellom mengden av MRGD mRNA i tumor del per som i normal parti av hvert enkelt tilfelle ble plottet. Baren viser gjennomsnittet av forholdet i hver krefttype.
Diskusjoner
Vi viste at MRGD uttrykk induserer tap av kontakt hemming, forankringsuavhengig spheroid vekst
i vitro Hotell og også tumorigenesis
in vivo
, som ikke er sett i foreldre normale fibroblast celler (Figur 1, Tabell 1). Disse i funksjonelle fenotyper observert for MRGD er ganske lik de som er rapportert for et representativt onkogen, RASV12 [15]. Vi bekreftet også at RASV12 uttrykk fremmer kansellering av kontakt inhibisjon av normale fibroblastceller og induserer også sfæroide vekst eller forankringsuavhengig cellevekst (data ikke vist). Videre viste vi at NIH3T3-MRGD celler resulterte betydelig vekst av fibrosarkom-lignende celler
in vivo plakater (Figur S3), og deres morfologiske fenotyper var ganske lik den NIH3T3-RASV12 celler (data ikke vist). Disse resultatene sterkt støtte at MRGD transduces tumorigent signalering og fremmer forankringsuavhengig cellevekst sett med RASV12. Det ble rapportert at iPS celler ble laget fra mus embryo fibroblast (MEF) omprogrammeres ved å innføre flere gener inkludert onkogener [16]. I denne studien har vi fokusert på tumorigent funksjon MRGD, derimot, kan det være av interesse å avklare hvorvidt MRGD er i stand til å fremme stemness. Ekspresjonen av stemness markører som for eksempel okt-3/4, Nanog og så videre [16] – [19] i NIH3T3-MRGD og andre MRGD-positive celler, så vel som ekspresjon av MRGD seg i stamceller og omprogrammeres MEFs, er av interesse å vite betydningen av MRGD i dette faget, og bør belyses i fremtiden.
En rekke rapporter tyder på at ikke bare onkogen som RASV12 men også proto-onkogener som ErbB2 og FYN gi lignende tumorigene fenotype i fibroblastceller [20], [21]. I tillegg er ekspresjonen av slike onkogener og /eller proto-onkogener ofte økt i forskjellige humane kreftformer, og at deres cellevekst og anti-apoptotiske signaler fremmer ikke bare veksten av kreft, men også sykdomsprogresjon hos kreftpasienter [2], [22] – [25]. I denne rapporten har vi funnet at MRGD mRNA uttrykkes i kliniske humane kreftprøver fra noen pasienter med lunge, bryst, spiserør, nyre eller magekreft. I tillegg fant vi at noen av disse kreftprøver uttrykker MRGD mRNA viste relativt høyere MRGD protein uttrykk i forhold til ikke-kreft deler fra de samme pasientene, selv om ingen samlet statistisk signifikans ble sett i hver tumortype (figur 4). For lungekreft, analyser vår RT-PCR viste høy og hyppig MRGD mRNA uttrykk, og vår IHC analyser viste at det høyeste nivået, som vi oppdaget for MRGD protein uttrykk, ble ofte observert i humane lungekrefttilfellene (tabell 2), særlig i lunge adenokarsinomer (figur 3). Selv om videre analyser av MRGD funksjoner i humane kreftceller og vev er nødvendig, den ekspresjonsprofilen av MRGD i kliniske kreft åpenbart i denne studien tyder sterkt på den mulige bidrag av den onkogene funksjon av MRGD seg selv og /eller en beslektet signal bane i enkelte faste tumorer slik som lungekreft. GPCR kan være gode mål for lavmolekylære inhibitorer, så vel som antistoffer, og derfor MRGD, et GPCR, kan tjene som et nytt mål for cancerterapi. Lung adenokarsinomer kan være en spesielt interessant krefttype for mulig kreftbehandling målretting MRGD.
mekanismer som MRGD fremmer onkogene signaler forbli ukjent. Men våre resultater indikerer at MRGD uttrykk fremmer onkogene fenotyper i normale celler både
in vitro
og
in vivo plakater (figur 1, tabell 1), og også at liganden, beta-alanin, aktiverer MRGD avhengige cellevekst
in vitro plakater (figur 2). Det ble rapportert at normale nivåer av beta-alanin var omtrent 3,8 uM i frisk human plasma [26]. Også rapportert, var det beta-alanin-konsentrasjoner i nerverelaterte vev er vist å være omtrent 50 uM i rottehoftenerve og 60 uM i katt hjerne [27], [28]. Våre data indikerer at beta-alanin fremmer sfæroide vekst fra 2 pM til 2000 uM i en doseavhengig måte, og 50% vekstfremming ble observert ved 20 uM (figur 2). Derfor, beta-alanin i friske menneskeplasma er høy nok til å fremme vekst sfæroide via MRGD. En rapport har til dags dato, avslørte at høy beta-alanine konsentrasjon er knyttet til kreft; i detalj, brysttumorer av rotte eller mus inneholde høyt nivå beta-alanin som aldri har blitt funnet i normalt brystvev fra rotte eller mus [29]. Derfor, kan beta-alanin-konsentrasjon i plasma eller tumorer i kreftpasienter være høyere enn for normale individer. Det kan være mulig at beta-alanin aktiverer tumorvekst og overlevelse hos kreftpasienter signaler gjennom MRGD til en viss grad. I tillegg, i kreftvev, kan høy MRGD uttrykk forårsake konstituerende transduksjon av onkogene signaler, eller kan føre til høyere ligand respons enn i normalt vev som fører til fremme kreft vekst. På den annen side har noen rapport avslørte at beta-alanin fremmer kreftutvikling, og derfor er det mulig at det kan være en annen MRGD ligand som bidrar til utvikling av kreft gjennom MRGD. Disse bør bli belyst i fremtiden
I denne studien demonstrerte vi.; 1) tumorigent aktivitet MRGD
in vivo Hotell og
in vitro
, 2) MRGD uttrykk i kliniske kreft vev, 3) fremme spheroid vekst av beta-alanin, den MRGD ligand, og 4 ) fibrosarkom-lignende morfologi av de podede vev av mus subkutant implantert MRGD-uttrykkende celler. Dette tyder på at MRGD er en potent mål i kreftbehandling og at lite molekyl antagonister, antistoffer eller RNAi for MRGD ville gi lovende kreftbehandling.
Materialer og metoder
Skriftlig informert samtykke ble mottatt fra alle deltakerne når vi innhentet alle kliniske vev, og alle eksperimenter av de kliniske vev ble utført i henhold til protokoller godkjent av Daiichi Sankyo forskningsetisk komité. Alle dyr arbeidet er utført i henhold til relevant nasjonal retningslinje i 2005, da dyret verkene ble studert.
Disse dyreforsøk protokoller ble godkjent av Sankyo dyr forskningsetisk komité, i Sankyo Co., Ltd., som var antecedent av Daiichi Sankyo Co., Ltd
Materialer og cellekultur
FBS ble kjøpt fra Hyclone (South Logan, UT). DMEM, RPMI1640, Opti-MEM, Geneticin og Lipofectamine 2000 ble kjøpt fra Life Technologies (Carlsbad, California). Retrovirus emballasje cellelinje, 293-10A1, ble etablert i vårt laboratorium fra 293 cellelinje (ATCC, CRL-1573) ved trans PCL-10A1 (IMGENEX, Sorrento Valley, CA). Den 293-10A1-cellelinjen ble opprettholdt med DMEM-medium supplert med 10% FBS, 3 ug /ml blasticidin (Wako, Osaka, Japan) under betingelser med 5% CO
2 ved 37 ° C. NIH3T3-cellelinje ble oppnådd fra ATCC (CRL-1658) og ble korrigert for RPMI1640 medium supplert med 10% FBS. Hexadimethrine bromide ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (Tokyo, Japan). HEK293 /αvβ3 cellelinjen ble etablert fra 293 celler (ATCC, CRL-1573) ved stabil transfeksjon med inte αv og P3 ekspresjonsvektorer, og ble dyrket i DMEM medium supplert 10% FBS.
Generering av NIH3T3-MRGD celler
cDNA som koder full-lengde human MRGD, RASV12 eller GFP ble klonet inn en pLNCX vektor (Clontech Laboratories, Mountain View, California). For infeksjon, ble NIH3T3 celler sådd i en 10 cm tallerken og dyrket i 1-3 dager. De 293-10A1 cellene ble sådd ut på en 10 cm kollagen I-belagt tallerken (AGC Techno Glass, Chiba, Japan) og ble dyrket over natten. pLNCX-MRGD, pLNCX-RASV12 eller pLNCX-Mock ble transfektert inn i cellene ved 293-10A1 Lipofectamine 2000. supernatanten av de transfekterte 293-10A1 celler ble samlet opp, deretter friskt medium ble tilsatt for neste syklus. Den oppsamlede supernatant ble filtrert med et 0,45 um PVDF-membran (Millipore, Billerica, Massachusetts), og det tilsvarende volum av RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS og 16 ug /ml Hexadimethrine bromid ble tilsatt. Denne virale løsning ble tilsatt til NIH3T3-celler for infeksjon. Rekken av disse infeksjonsfremgangsmåter ble gjentatt tre ganger hver 12. time. Etter 12 timer fra den siste infeksjon, ble cellene dyrket med 500 ug /ml Geneticin i en uke for å samle celler som uttrykker målgenet.
Fokus dannelsesbestemmelsen
Celler ble sådd ut i 1 x 10
5-celler /brønn på en 6-brønners cellekulturplate (Corning Japan, Tokyo, Japan) og dyrket i en uke. De dyrkede celler ble fiksert med 4% paraformaldehyd (Wako, Osaka, Japan) i 30 minutter ved 4 ° C og ble farget med 0,5% krystallfiolett (Sigma-Aldrich Japan, Tokyo, Japan).
sfæroid vekst analysen
NIH3T3-MRGD cellene ble suspendert i RPMI1640 medium supplementert med 10% FBS og 0,1% BSA og sådd ut på 5000 celler /brønn i 100 ul på en 96-brønners celleklump plate (Sumitomo Bakelite, Tokyo, Japan) . I det tilfellet hvor beta-alanin ble tilsatt, ble celler platet ut på 5000 celler /brønn i 80 ul, og deretter 20 ul av beta-alanin ble tilsatt på samme dag. Spheroid vekst ble målt med en av følgende metoder. 1) Måling sfæroide diameter: sfæroide diameter ble målt ved okulær mikrometer. Hver diameter ble beregnet fra forstørrelsen av en objektivlinse og et okular. 2) Måling spheroid sin ATP mengde: Cell Titer-Glo Lysende celleviabilitet Assay (Promega KK, Tokyo, Japan) ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner. Deretter, sfæroide med 100 pl av reagens var godt pippetert og overført til en hvit flatbunnet plate (Corning Japan, Tokyo, Japan). 1 sek luminescens av platen ble målt ved Mithrassystemet LB940 (Berthold Teknologier, Wildbad, Tyskland).
Analyse av in vivo-tumordannelse av MRGD-transfekterte NIH3T3-celler
atymiske nakne mus (BALB /cAJcl-nu /nu mus, CLEA Japan, 5 uker gammel, kvinne) ble inokulert subkutant med 3 × 10
6 NIH3T3-MRGD celler (n = 3) eller NIH3T3-Mock celler (n = 3), som en negativ kontroll. Tumor volum ble målt 3 ganger per uke. Tumorvolum ble beregnet etter følgende ligninger: Ifølge den relevante nasjonale retningslinjer, alle musene skulle avlives hvis tegn på toksisitet som redusert aktivitet, redusert appetitt, redusert drikking, licks, vokter lemmer, økt aggresjon, stemmebruk, aversjon mot con-detaljer, dehydrering, mangler anatomi, unormal holdning, brukket vedheng og prolaps, diaré, progressive dermatitt, krum holdning, slapphet eller vedvarende recumbency, hoste, tung pust, rennende nese, gulsott og /eller anemi, nevrologiske tegn, blødning fra en hvilken som helst åpning, selv-indusert trauma, vanskeligheter ved bevegelse, overdreven eller langvarig hypertermi eller hypotermi, eller vekttap som overskrider 10% av den totale kroppsvekten av negative kontrollmus, ble sett. Ingen tegn til toksisitet ble sett i mus under dette forsøket.
Utarbeidelse av kanin anti-human MRGD polyklonale antistoff
blanding av 2 typer peptider, GTVESALNYSRGSTVH (16 mer) og ELEGGETPTVGTNEMGA ( 17 mer), ble brukt som et antigen. Serum ble oppnådd fra kaniner immunisert med antigenet fremstilt med ufullstendig Freunds adjuvans (DIFCO, Detroit, MI) med unntak av den første immuniseringen, som inneholdt Freunds fullstendige adjuvans (DIFCO, Detroit, MI). Til slutt ble polyklonale IgG antistoffer renset fra serum ved en tilhørighet kolonnen med antigen peptider.
Immunohistochemistry (IHC)
Spesifisiteten av anti-MRGD antistoffer ble validert ved farging HEK293 /αvβ3 celler transfektert med MRGD uttrykte eller tom vektor. Disse transfektanter ble fiksert med 20% formalin nøytral bufferløsning (Wako, Osaka, Japan) og parafin innebygd for å gjøre celleblokker. Celle blokkene ble kuttet ut for å tynne snitt av mikrotom og satt på en APS-belagt lysbilde glass. Snittene ble tørket, de-parafin og forbehandlet ved Biotin Blocking System (Dako Japan, Tokyo, Japan). Seksjonene ble så blokkert med protein blokk serumfritt (Dako Japan, Tokyo, Japan) og ble behandlet med et polyklonalt anti-humant MRGD antistoff (1/200) i antistoff-fortynningsmiddel (Dako Japan, Tokyo, Japan). De antistoffbehandlede Snittene ble behandlet med biotinylert anti-kanin-IgG, og deretter behandlet med ABC-AP av Vectastain ABC kit alkalisk fosfatase kanin IgG (CliniScience, Montrouge, Frankrike). AP røde av alkalisk fosfatase substrat Kit ble jeg brukt som et farge substrat. Kreft vevssnitt ble fremstilt fra parafin innebygde blokker og immunhistokjemisk farging ble utført med ABC-metoden.
Måling av MRGD genuttrykk i klinisk vev
Total RNA av tumor eller ikke-tumor kliniske vev fra den samme donor ble anskaffet fra BioChain (Hayward, CA). Disse RNA par prøver ble behandlet med ATP-avhengige DNase (Toyobo, Osaka, Japan) med 10 enheter RNase inhibitor (Toyobo, Osaka, Japan) i 15 minutter på is. Den DNase ble fjernet av total RNA miniprepp system (VIOGENE, Taipei County, Taiwan). For å oppnå cDNA, en blanding av templat total RNA (2 ng), tilfeldige primere (9 mer, 50 pmol), ReverTra Ace (10 enheter, Toyobo, Osaka, Japan) og reaksjonsbuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 75 mM KCl, 6 mM MgCl
2, 1 mM DTT, 1 mM dNTP-buffer) ble inkubert ved 25 ° C i 15 minutter, 42 ° C i 30 minutter, og deretter 95 ° C i 3 minutter. Sanntids-PCR reaksjonen ble utført med TaqMaq One-Step RT-PCR Master Mix (Life Technologies Japan, Tokyo, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner ved hjelp av følgende sonden og primere.
MRGD
-2 (TaqMan probe sekvens): TGTGTGCCACCATGCCTGGCTAATT
MRGD
F2 (Forward primer sekvens): GCTCACTACAACCTCAATGTGCC
MRGD
R2 (Reverse primer sekvens): GCCACATAGCAAGATCTCATCTCTAC
data ble normalisert ved TaqMan β-actin kontroll reagens (Life Technologies Japan, Tokyo, Japan). Disse genekspresjon ble målt ved hjelp av Mx3000P QPCR system (Agilent Technology, Santa Clara, CA).
Statistiske analyser
Alle
vitro
eksperimenter ble analysert ved Mann-Whitney U -UNDERSØKELSER, bortsett fra kvantitativ RT-PCR-analyse i kliniske prøver, som ble analysert ved en-veis ANOVA. Rapporterte p-verdiene er to-haler og anses å være statistisk signifikant på p. 0,05
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Agarose gel elektroforese av PCR-amplifiserte cDNA innskudd. Nukleinsyresekvenser av PCR-produktene på vektor innskudd ble verifisert. Spor 1 og 3: RT-PCR-amplifisert GFP fra total RNA fra NIH3T3-GFP; felt 2: Forsterket GFP fra GFP plasmid (positiv kontroll); kjørefelt 4 og 6: RT-PCR-forsterket MRGD fra total RNA fra NIH-3T3-MRGD; kjørefelt. 5: Amplified MRGD fra MRGD plasmid (positiv kontroll)
doi: 10,1371 /journal.pone.0038618.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Cell spredning av NIN3T3-MRGD spheroid målt etter [
3H] -tymidin inkorporering. [
3H] -tymidin inkorporering i kulene ble målt til 6 dager etter plating. * Indikerer p 0,005 (Mann-Whitney U test, 2 haler)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0038618.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
HE farging av NIH3T3-MRGD podet vev i naken mus. De NIH3T3-MRGD klumper på 7 dager etter vaksinasjonen i atymiske mus (A, × 40, B × 800) viste en mobil representant spindel celle tumor vevstype
doi:. 10,1371 /journal.pone.0038618.s003
(TIF)
Figur S4.
HE og IHC stainings av lunge adenokarsinom prøver med anti-MRGD antistoff. HE farging (A, C, E) og IHC-farging (B, D, F) ble utført. Dette er eksempler fra tre uavhengige pasienter med lunge adenokarsinom. Pasient 1, A, B; Pasient 2, C, D; Pasient 3, E, F.
doi: 10,1371 /journal.pone.0038618.s004 plakater (TIF)
File S1.
Materiale og Metoder for Figur S2.
doi: 10,1371 /journal.pone.0038618.s005 plakater (DOC)
Takk
Vi vil gjerne takke medlemmene av R D Division of Daiichi Sankyo; N. Maeda og N. Abe for å lage celleblokker, M. Yamada for beising han og IHC prøver, S. Endo for statistisk analyse, og Dr. M. Ono, Dr. P. Rodley og Dr. Y. Abe for rådgivning i skrivingen av denne rapporten.
