Abstract
Bakgrunn
Småcellet lungekreft (SCLC) er en ekstremt aggressiv sykdom, ofte viser terapiresistent tilbakefall. Vi har tidligere identifisert nevroendokrin og epiteliale fenotyper i SCLC svulster og nevroendokrin markør, pro-opiomelanocortin (POMC), korrelert med dårligere total overlevelse hos pasienter. Imidlertid er effekten av behandlingen på følgende fenotypene ikke forstått. Den aktuelle studien var å fastslå effekten av gjentatt bestråling behandling på SCLC celle fenotype, med fokus på nevroendokrin markør, POMC.
Resultater
Menneske SCLC celler (DMS 79) ble etablert som subkutan xenograft tumorer i CBA nakne mus og deretter utsettes for gjentatt 2Gy bestråling. I ubehandlede dyr, POMC i blodet nær opptil tumorvekst; en ideell karakteristikk for en sirkulerende biomarkør. Etter gjentatt lokal bestråling
in vivo
, redusert sirkulerende POMC (p 0,01), i parallell med en reduksjon i tumorstørrelse, men forble lav selv når tumorene reetableres. Det utskårede tumorer viste redusert og utpreget heterogene ekspresjon av POMC sammenlignet med ubehandlede tumorer. Det var ingen forskjell i epiteliale markør, cytokeratin. Men det var betydelig mer N-cadherin positive celler i bestrålte svulster. For å undersøke tumorrespons til bestråling, ble DMS79 celler gjentatte ganger bestrålt
in vitro Hotell og de overlevende cellene. POMC ekspresjon ble redusert, mens mesenchymale markører N-cadherin, β1-integrin, fibroblast-spesifikt protein 1, β-catenin og Zeb1 ekspresjon ble amplifisert i flere bestrålings-primet celler. Det var ingen konsistente endringer i epitel markør uttrykk. Cell morfologi endret seg dramatisk med gjentatte bestrålte celler som viser en mer langstrakt form, noe som tyder på en bryter til en mer mesenchymale fenotype.
Konklusjoner
I sammendraget, POMC biomarkør uttrykk og sekresjon ble redusert i SCLC svulster som regrew etter bestråling og gjentatte ganger bestråling (bestråling-primet) celler. Derfor POMC ikke lenger var prediktiv av tumorbyrde. Dette understreker viktigheten av fullt evaluerer biomarkører under og etter behandling for å vurdere klinisk nytte. Videre kan gevinsten i mesenchymale egenskaper i bestrålte celler være en indikasjon på en mer invasiv fenotype
Citation. Meredith SL, Bryant JL, Babur M, Riddell PW, Behrouzi R, Williams KJ, et al. (2016) Bestråling Reduserer Nevroendokrine Biomarker Pro-opiomelanocortin i småcellet lungekreft celler
In Vitro Hotell og
In Vivo
. PLoS ONE 11 (2): e0148404. doi: 10,1371 /journal.pone.0148404
Redaktør: Stephanie Filleur, Texas Tech University Health Sciences Center, UNITED STATES
mottatt: 28 oktober 2015; Godkjent: 18 januar 2016; Publisert: 05.02.2016
Copyright: © 2016 Meredith et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Midler til SLM, JLB, PWR og RB ble levert av The Barbara Mawer Gavefond fond~~POS=HEADCOMP, BBSRC, Society for endokrinologi. Det ble også gitt av EU FP7 Metoxia Grant avtalen no. 222741 (til KJ Williams, støtter M. Babur)
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreftdød i den vestlige verden og småcellet lungekreft (SCLC) er den mest aggressive formen, og står for rundt 15% av alle tilfeller [1]. Denne dårlig prognose er på grunn av rask vekst, tidlig utvikling av fjernmetastaser og nesten uunngåelig tilbakefall med terapiresistent sykdom [2]. Den nåværende standard for behandling SCLC er en kombinasjon av kjemoterapi og radioterapi. Når primærsvulster og metastaser bli respondert på behandling, er overlevelse for pasienter ekstremt kort. Den manglende effekt av kjemoterapi og strålebehandling etter SCLC tilbakefall fremhever viktigheten av å få en mer inngående forståelse av cellulære og molekylære endringer i tumorer anses terapi motstandsdyktig.
Foreløpig strålebehandling gis til SCLC pasienter som med begrenset sykdom og ofte også i utstrakt sykdom. Radioterapi er gitt i den første eller andre syklus av kjemoterapi i enten en eller to ganger daglige doser i 3-5 uker [3]. Radio- og chemo-motstand kan etterlignet
in vitro Hotell og studier har vist at strålebehandling bestandig SCLC celler også utvikler resistens mot andre agenter [4,5]. Imidlertid har de fenotypiske egenskapene til bestrålingsresistente SCLC-celler ikke blitt dokumentert. Nevroendokrine markører har vist seg nyttig, men er ofte begrenset i sin oppdagelse og iscenesettelse av SCLC pasienter; derfor er mer følsomme og pålitelige biomarkører søkt å styrke diagnose og prognose.
Overskudd av sirkulerende POMC, forløperen av stresshormon, adrenokortikotropt hormon (ACTH), er mest vanlig dokumentert hos pasienter med slimdannende tumorer, men også i pasienter med ikke-hypofysesvulster, særlig SCLC [6-9]. Disse pasientene kan presentere med milde til moderate symptomer på Cushings syndrom. Vi har vist at sirkulerende nivåer i det nevroendokrine markør, POMC, korrelerer med en lavere overlevelse hos pasienter med SCLC-tumorer [10]. Men om dette biomarkør vil være like nyttig for å forutsi tumor tilbakefall etter behandling ikke er kjent.
Ikke-SCLC (NSCLC) celler behandlet med radioterapi eller kjemoterapi har kapasitet til å gjennomgå epiteliale til mesenchymal overgang (EMT) i respons på behandlingen [11-17], og dette blir en mer anerkjent karakteristisk for metastaser i mange krefttyper [18,19]. Mindre er kjent om hvorvidt det er en tilsvarende progresjon i SCLC eller om EMT er knyttet til terapi-motstand i denne kreft. Men studier har vist at det er subpopulasjoner av heft SCLC celler
in vitro Hotell som er mer mesenchymale og viser økt chemoresistance [20]. I tillegg er det bevis for EMT i SCLC svulster, som har vært knyttet til økt invasivitet og chemoresistence [21].
Naturen av fenotypiske overganger og rollen til nevroendokrin fenotype i SCLC svulster er dårlig forstått. I tillegg er effekten av bestråling behandling på tumor fenotype ikke blitt beskrevet i SCLC. Vårt mål var å bestemme hvorvidt POMC kan fungere som en biomarkør for tumorbyrde etter bestråling behandling, eller hvis den endres som følge av bestråling motstand, ved hjelp av den samme murine modell som tidligere er etablert [10]. Vi fant at POMC ble betydelig redusert i resistente celler
in vitro Hotell og
in vivo Hotell og var ikke en god prediktor for svulst gjenvekst etter bestråling. Det var også en tydelig mesenchymale switch
in vitro Hotell og
in vivo
etter bestråling som kan være en indikasjon på mer aggressive eller bevegelige tumorceller.
Metoder
Cell kultur
DMS 79 er en SCLC cellelinje opprinnelig fra en pleuravæske tatt fra en 65 år gammel mann kaukasiske og etablert
in vitro
av Dr Pettengill, (Dartmouth Medical School, Hanover, NH, USA). Cellelinjen ble donert av henne i 1990 [22]. Celler ble godkjent av DNA-sekvense Facility (University of Manchester) på tidspunktet for undersøkelsen og har både
p53 Hotell og
RB1
mutasjoner. DMS 79 celler vokse som løst hengende aggregater og ble dyrket i RTISS media (RPMI 1640 + L-Glutamin supplert med 2,5% FBS, 5 ng /ml insulin, 10 ug /ml transferrin, 30nm natrium selenitt og 1% HEPES buffer) [23].
DMS 79 celler ble bestrålt ved hjelp av en brøk røntgenbestråling maskin (Faxitron X-ray aksjeselskap, Sveits) ved 2Gy og venstre for å komme seg i 14-21 dager. Denne prosedyren ble gjentatt for 10 sykluser med levedyktighet målinger gjennomført før og 72 timer etter hver behandling. Total tid i kulturen var 32 uker og totalt antall passasjer av celler var mellom 30 og 40. Celleviabilitet og doblingstidene ble vurdert ved CellTiterGlo Lysende celleviabilitet Assay (Promega, WI, USA). Celler ble utsatt for 5Gy IR utfordringer for å bestemme om cellene hadde fått motstandsdyktighet mot de høyere doser av bestråling. Bestråling sykluser ble utført på 3 individuelle kulturer for hvert forsøk.
xenograft studier
Etikk erklæringen.
Alle prosedyrer som involverer dyr ble utført i henhold til den britiske Home Office Animal ( vitenskapelige prosedyrer) Act 1986, og godkjent av det lokale universitetet i Manchester Ethical Review Committee.
DMS 79 celler ble injisert subkutant i CBA nakne hunnmus ved 5×10
6 celler /mus i 0,1 ml av serum fri RPMI 1640-medium med tilsetning av 50% matrigel. Musene ble hentet fra University of Manchester Biological Services Facility og holder til i interne ventilasjons bur i grupper på fem, ved 22 ° C, under sterile forhold med autoklaveres sagflis sengetøy og miljøberikelse. Gjennomsnittlig vekt var 24.5g +/- 0,37 g og mus var 12 uker gammel ved starten av studien. Dyrene ble utsatt for 12:12 lys mørk syklus og
ad libitum
tilgang til sterilt standard chow diett (SDS) og sterilt vann. Musene ble tildelt behandlingsgruppene av 5 dyr /gruppe basert på tiden det tar for svulsten å nå 250mm
3. Svulster ble lokalt bestrålt eller ubehandlet på 250mm
3 på 2Gy /dag i 3, 5 eller 10 påfølgende dager, noe som gir en total dose på 6, 10 og 20Gy. Alle dyrene ble nøye overvåket for generell helse og vekt daglig. Alle dyr forble i god helse gjennom hele eksperimentet ikke annet er oppgitt. Under
in vivo
studere ett muse ble hentet mid-eksperiment på grunn av en hoven mage og betydelig vekttap (fra gruppe 4 [10 påfølgende IR dager]) og ble derfor ekskludert fra analysen.
Mus ble ofret klokken 10.00 av stigende CO
2 og halshugging når tumorer nådde 1000mm
3. Svulster og andre organer av interesse var da halv knipse frosset og halv formalinfiksert og parafinvoks innebygd. Blodprøver av maksimal 80μl ble tatt av halen nick på dag 0, 13 og hver 7
th dagen etterpå. Mus plasma ble analysert for POMC ved hjelp av ELISA (se nedenfor).
POMC ELISA
Sirkulasjons POMC nivåene ble målt i mus plasma ved hjelp av en spesiell to-sete ELISA. Denne analysen fulgte den samme protokoll som beskrevet tidligere [10]. Den nedre grense for analysesensitiviteten i løpet av studien var 15 pmol/L.
Immunhistokjemi /Immunocytochemistry
5 um deler av formalinfiksert voks innleiret DMS 79 tumorer ble farget for POMC (N1C11, antistoff fremstilt i vårt lab) (se [10] for ytterligere detaljer om antistoff), neuron-spesifikk enolase (NSE) (monoklonalt, klone BBS /NC /VI-H14, Dako katt nummer M0873, fortynning 1: 100) cytokeratin (monoklonalt, klone AE1 /AE3, Dako, katt nummer M3515, fortynning 1: 100) og N-cadherin (CDH2 mus monoklonalt, klone 6G11, Dako, katt nummer M3613, fortynning 1:50) ved hjelp diaminobenzen (DAB) chromagen envision system (Dako). Sekundært antistoff som ble benyttet var et polyklonalt geit-anti-mus IgG konjugert til HRP (Dako, Cat nummer P0447, fortynning 1: 200). Antigen gjenfinning ble utført på alle seksjoner ved hjelp av citrat-buffer (pH 6) ved 95 ° C i 30 minutter
Bildeanalyse analyse~~POS=HEADCOMP
Tumor seksjonene ble skannet med 20x forstørrelse ved hjelp av en Aperio CT-skanner (Aperio Systems, Vista, CA) og cytoplasma DAB farging ble kvantifisert ved hjelp av Aperio Positive Pixel Count program v9.1 (Aperios Systems , Vista, CA). Bare levedyktig vev fra hver del ble analysert og områder av brettet /skadet vev og nekrose /pre-nekrose ble ekskludert for å redusere skjevhet. Negative kontroller ble gjennomført for alle behandlingsgrupper for å bestemme bakgrunnsfarging nivåer som deretter kan bli utelukket ved hjelp av Aperio programvare. De levedyktige celler områder fra hele tumorsnitt ble analysert, tumorene fra alle musene ble inkludert i analysen og 3 seksjoner fra hver tumor ble analysert.
data genereres ble uttrykt som en prosentandel av antallet positive bildeelementer i forhold til totalt antall piksler analysert (positivt tall fraksjon), som kan likestilles med den positive området brøkdel [24].
Kvantitativ PCR
DMS 79 celler eksponert for totalt 21Gy IR
in vitro plakater (8x2Gy sykluser og 1x5Gy syklus) som viser forskjellige morfologiske endringer fra ubehandlede celler dyrket i samme periode ble høstet. RNA ble ekstrahert ved hjelp av en QIAGEN RNeasy Mini Kit (ved hjelp Qiashredder rør). cDNA syntese ble utført ved hjelp av QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen). Primere ble hentet fra Eurofins MWG, (London, UK) og ble utformet på tvers ekson grenser. Gener av interesse inkluderer;
POMC
,
ENO2 plakater (nevron enolase [NSE]),
NCAM1 plakater (neural cell-adhesjonsmolekyl [N-CAM]),
CHGA
(Kromogranin A [CGA]),
KRT18 plakater (cytokeratin 18 [CK18]),
KRT19 plakater (cytokeratin 19 [CK19])
CDH1 plakater (epitel cadherin [E -Cad]),
EpCAM plakater (epithelial celle adhesjon molekyl),
CDH2 plakater (nevrale cadherin [N-Cad]),
ITGB1 plakater (Inte β1),
CTNNB1 product: (β-catenin),
ZEB1
,
FSP1 plakater (fibroblast-spesifikt protein 1) og
ACTA1 plakater (α-glatt muskulatur aktin). Kvantitativ PCR ble utført med Faststart Universal SYBR Grønn (Roche) og kjøre /analysert ved hjelp StepOnePlus Real Time PCR maskin og programvare (Applied Biosystems)
Statistiske Data Analysis
All statistisk dataanalyse ble utført med GraphPad Prism programvareversjon 5. Data som presenteres er gjennomsnitt og standardavvik av gjennomsnittet av minimum tre individuelle eksperimenter. Korrelasjonskoeffisienter ble vurdert ved hjelp av spearmans korrelasjon test. Kvantitativ real time PCR data ble analysert ved hjelp av StepOne programvare og Microsoft Excel. Genekspresjon statistisk signifikans Evalueringen ble målt ved anvendelse av uparede t-tester. Enveis ANOVA statistiske tester ble brukt for å sammenligne flere grupper av data inkludert Bonferroni er multiple sammenligninger.
Resultater
POMC er en mindre effektiv biomarkør av tumorvekst etter bestråling
Sirkulasjons POMC nøyaktig etterlignet tumorprogresjon hos ubehandlede xenopodet mus (fig 1 A) og det var en sterk korrelasjon (r = 0,82, figur 1B). Når svulster var lokalt bestrålt for 3 og 5 dager var det også en sterk positiv korrelasjon mellom tumorstørrelse og sirkulerende POMC (figur 1C-1F). Men terminale POMC konsentrasjonene var lavere enn i ubehandlede dyr, selv om alle dyr hadde blitt opprettholdt inntil tumorene nådde den samme størrelse. Enda mer påfallende, når subkutane DMS 79 svulster ble bestrålt i 10 påfølgende dager på 2Gy /dag, POMC ikke speile svulst gjenvekst (r = 0,35, figur 1G og 1H). Sirkulerende POMC fra terminal plasmaprøver, når tumorene var alle på 1000 mm
3, var fire ganger lavere i 20Gy bestråling gruppen sammenlignet med dem i den ubehandlede gruppen (p = 0,0165 Fig 1I). POMC tumor-proteinet var også lavere i 20Gy bestrålt gruppe (p = 0,0092 Fig 1J). Data fra alle individuelle mus er vist i S1 fig.
DMS 79 celler ble etablert som subkutane transplantater, og når de var 200-250mm
3 enten til venstre for å vokse ubehandlet (A) eller eksponert for 2Gy IR /dag i 3 påfølgende dager (C), 5 påfølgende dager (E) eller 10 påfølgende dager (G). Sirkulerende POMC ble overvåket ved blodprøver på dagene 0, 13, 20 og hver 7. dag deretter. Fargede søylene angir periode hvor svulster ble lokalt utsatt for IR. Circulating POMC og tumorstørrelse ble analysert ved hjelp av korrelasjonsanalyse, som ble utført på alle tidspunkter fra hver gruppe (B, D, F, H). Resultatene presentert (A, C, E, G) er individuelle mus, men representerer 3-5 mus /gruppe. Alle individuelle dyredata er presentert i figur S1 Sirkulasjons POMC ble analysert i terminal prøver (I). Hele protein fra tumorprøver ble analysert ved ELISA for POMC (J). Følgende antall dyr nådd 1000mm
3 tumorvolumet innen 120 dager fra tumor implantat; Ubehandlet gruppe 5/5, 3x2Gy 4/5, 5x2Gy 5/5, 10x2Gy 3/4 * p = 0,05 ** p = 0,01. Kontroller i figur 1A har opprinnelig vært beskrevet i Stovold et al. British Journal of Cancer [10].
POMC er redusert og tydelig heterogene etter gjentatte bestråling
in vivo
Ubehandlet svulster farget jevnt positiv for POMC (fig 2A -2 C). Imidlertid tumorer utsettes for 2Gy /dag i ti dager viste mindre utpreget og heterogen POMC farving i løpet av levedyktige celleområdene (figur 2D-2G). Seksjoner fra alle svulster er vist i S2 Fig Positive pixel analyse på tvers av alle svulster bekreftet at det var 23% sterkere positive POMC celler i ubehandlede tumorer enn i 20Gy bestrålt tumorer (figur 2 H). POMC genekspresjon ble også redusert i 20Gy IR tumorer (fig 2i). Når behandlingen av en alternativ nevroendokrine markør, neuron spesifikk enolase (NSE), var det ingen forskjell i farge mellom de ubehandlede og bestrålte tumorer (S3 Fig).
DMS 79 celler ble etablert som subkutane tumorer hos nakne mus og enten ubehandlet (AC) eller utsatt for IR i 10 påfølgende dager på 2Gy /dag (DG). En sentral del av svulsten ble farget for POMC å bruke vår egen N1C11 antistoff. (A D) viser hele svulsten tverrsnitt, (B C) viser sterk homogen POMC flekker i egne kreft områder i ubehandlede DMS 79 xenografter. (E-G) viser levedyktige tumorcelle regioner av et bestrålt DMS 79 xenograft avslørende (E) sterk farging, (F) svakere uensartet farging, (G) svak farging. (H) Kvantitative vurdering av positive piksel analyse av ubehandlede tumorer og 20Gy IR behandlede tumorer farget for POMC. (I) POMC genekspresjon ble analysert i alle ubehandlede og 20Gy IR tumorer. Svulster som presenteres er representative for 3-5 /gruppe med alle andre svulster i S2 Fig.
Økt N-cadherin
in vivo
etter bestråling
For å avgjøre om det var noen ekstra endring i fenotype, bestrålt DMS 79 xenografttumorer ble også analysert for N-cadherin og cytokeratin (fig 3). N-cadherin viste lav eller fraværende hos ubehandlede tumorer, men ekspresjon var sterkere i gjentatte ganger bestrålt tumorer, med tilstedeværelse av enkelte sterkt positive N-cadherin-celler fordelt på tvers av tumorsnitt (figur 3A og 3B). I tillegg ble noen områder mer tett befolket med positive celler, og skaper en heterogen fordeling samlet. Positiv pixel analyse bekreftet N-cadherin var signifikant økt i bestrålte tumorer (lav flekker ni ganger økning p = 0,001 høy farging 18 gangers økning p = 0,0268) sammenlignet med ubehandlede tumorsnitt (fig 3c). Cytokeratin flekker, i motsetning, viste jevnt positiv farging i ubehandlet og bestrålt xenograft seksjoner (Fig 3D og 3E), bekreftet av positive pixel analyse (Fig 3F).
mesenchymale markør N-cadherin (N-Cad) (A og B) og den epiteliale markør cytokeratin (CK) (D 0,001 * p =. 0,05
Ingen endringer i POMC i DMS79 celler etter en enkelt dose av bestråling
Resultatene fra
i vivo
studier antydet at tumorer post-stråling har ervervet fenotypiske egenskaper som er forskjellige fra ubehandlede tumorer og at disse endringer ble kombinert med en reduksjon i POMC biomarkør sekresjon og uttrykk og en økning i N-cadherin. For å undersøke dette videre, DMS79 celler
in vitro
ble utsatt for stråling og endringer i fenotype ble overvåket. Til å begynne med DMS-79-celler ble gitt en dose av 2Gy eller 5Gy bestråling for å bestemme hvorvidt en enkelt dose var nok til å fremme eventuelle fenotypiske endringer (figur 4).
DMS-79-celler ble tellet på dag 0 og deretter bestrålt ved 2Gy og 5Gy. Levedyktige tellinger ble utført opp til 7 dager etter bestråling før celler ble farget for POMC, cytokeratin (CK) og N-cadherin. Alle bestråling sykluser ble utført på 3 uavhengige kulturer. * P = 0,05 ** p = 0,01 *** p = 0,001
Celleviabilitet ble betydelig redusert i celler som ble bestrålt i både 2Gy og 5Gy. Men vises de overlevende levedyktige celler ingen åpenbare forskjeller i morfologi eller i uttrykk for POMC, cytokeratin og N-cadherin, 7 dager etter bestråling, noe som tyder på at gjentatt bestråling er kombinert med den fenotypiske endring
in vivo
.
Endring stråling fenotype
in vitro
DMS 79 celler dyrket
in vitro
ble deretter utsatt for gjentatt bestråling over 8 måneder før de ble mer tolerant til behandling (fig 5A skjematisk). Med flere sykluser av bestråling antall celler som overlever en 2Gy IR utfordring øket (figur 5B). Etter 9 sykluser med bestråling var det en nedgang i doblingstiden for celler som utsettes for bestråling (figur 5D) og en reduksjon i POMC sekresjon (figur 5E).
DMS 79 celler ble bestrålt ved 2Gy i 10 progressive sykluser (skjematisk [A]). Prosentandelen av celler som overlever i de bestrålte kulturene ble sammenlignet med «kontroll» dvs. cellene ikke behandlet på det aktuelle syklus (B) (Spearman korrelasjon p = 0,0001). Eksperimentet ble utført med disse innstillinger for å tillate økt proliferasjon det bestrålte celler viste seg over tid sammenlignet med helt ubehandlede celler. DMS 79 celler ble også utfordret med høyere doser av IR (5Gy) på ulike steder for å evaluere Radiosensitivity (C). Celler resterende ble uttrykt som en prosent av kontroller (B 0,05 *** p =. 0,001
Strålebehandling er kombinert med en bryter til en mer mesenchymale fenotype
Parallelt med
in vivo
data, IR-primet SCLC celler viste ingen konsistent generell endring i epiteliale markører, cytokeratin 18, cytokeratin 19, E-cadherin og epithelial celleadhesjonsmolekyl (EpCAM) (figur 6). Men mer interessant, fem av de seks mesenchymale markører analysert, ble oppregulert; N-cadherin p = 0,001, Inte β1 p = 0,044, fibroblast-spesifikt protein 1 p = 0,03, Zeb1 p = 0,001, β-catenin p = 0,001. Denne informasjonen er konsistent med de morfologiske observasjoner
in vitro Hotell og kvantifisering av
in vivo
farging.
Diskusjoner
Vurdere SCLC tumorceller
in vivo Hotell og
in vitro
har identifisert en endring i fenotype etter eksponering for gjentatte bestråling. POMC uttrykk redusert i svulster
in vivo
etter gjentatte bestråling og redusert POMC ble også funnet i bestrålte tumorceller
in vitro
. I tillegg til dette endret nevroendokrin fenotype, ble det observert en økning i mesenkymale karakteristika etter gjentatt bestråling.
Mange studier har identifisert kandidat biomarkører for ulike krefttyper, som betegner deres betydning i diagnose, prognose og tidlig påvisning av tilbakefall i pasienter. Imidlertid er det en betydelig kompleksitet i nytten av biomarkører. I denne studien, bestråling av DMS 79 celler
in vivo
resulterte i redusert POMC i blodet, og redusert POMC protein og mRNA uttrykk nivåer i tumorer selv om svulstene hadde regrown. Dette indikerer at biomarkør uttrykk har endret seg som følge av behandling og er ikke lenger i stand til å forutsi tumor gjenvekst. Vi har tidligere beskrevet POMC som en ny biomarkør hos pasienter med SCLC og viste den korrelert med levermetastaser [10]. Det kan være at det i pasientene, er bestråling reduserer POMC ekspresjon /produksjon i den primære tumor, (som sett i xenotransplantater), men ingen metastaser hos pasientene (spesielt de i leveren) fortsatt kan være som utskiller høye nivåer av POMC inn i sirkulasjon.
POMC kan være en veldig spesifikk og sensitiv biomarkør for en undergruppe av SCLC pasienter som ikke har blitt behandlet. Imidlertid er det viktig å vurdere at POMC måling kan vise seg å være misvisende for de fleste pasienter som har hatt bestråling og tilbakefall, fordi de sirkulerende konsentrasjoner av POMC produsert av primærtumor forblir undertrykket. Derfor POMC viser en markant forskjellig forhold til tumorvolumet i ubehandlet versus bestrålte svulster. Selv om det er riktig at en økning i POMC skulle tilsi tilbakefall etter strålebehandling, vil den tumorbyrde som denne er assosiert være mye større enn det som ble observert uten strålebehandling. I figur 1 en ubehandlet tumor på 200 mm3 bringer 300pmol /l POMC men en svulst behandlet med 20Gy ville være 1000cm3 før den produserte den samme mengde POMC. Dersom dette omregnes til pasienter, vil det påvirke hvor godt POMC kunne brukes på grunn av den tiden en residiverende svulst gitt radioterapi er stor nok til å bli detektert av POMC, kan det være utenfor den størrelse som et alternativ intervensjon kan være nyttig. Lignende scenarier er sannsynlig å eksistere for andre biomarkører, der studier ikke har vurdert den type og omfang av behandlingen.
Til tross for at det var en betydelig nedgang i POMC
in vitro Hotell og
in vivo
etter bestråling, var det ingen endring i N-CAM, NSE eller kromogranin A genuttrykk
in vitro
. Dette indikerer at sidene i det nevroendokrine fenotype vedvarer etter bestråling. Dette tyder på at gjentatt bestråling kan resultere i endringer i POMC genet eller POMC vei som fører til redusert sekresjon POMC, men er ikke å endre nevroendokrine fenotypen generelt. Disse resultatene viser at når analysere en roman biomarkør, er det ekstremt viktig å være klar over plastisitet biomarkør uttrykk etter behandling.
Parallelt med endringene i POMC uttrykk var det en oppregulering av mesenchymale markører N- cadherin, β1-integrin, Zeb1, fibroblast-spesifikt protein og en β-catenin på mRNA-nivå. Dette tilveiebringer innsikt i de som er involvert i responsen av tumorcellene til behandling mekanismer. Epiteliale til mesenchymale overgang er kjent for å være assosiert med resistens overfor terapi. I denne studien ble ervervet resistens er ledsaget av en nedgang i POMC og en oppregulering av mesenchymale markører. Motstand mot bestråling av SCLC celler har tidligere blitt identifisert med N-acetylglucoaminyltransferase V (GNT-V) over utfoldelse og oppregulering av GNT-V
in vivo
forårsaker en økning i N-cadherin, vimentin og ZEB2, igjen noe som tyder på en sammenheng mellom Radiosensitivity og EMT-lignende endring [25]. N-cadherin nivåer er kjent for å øke etter bestråling i NSCLC celler [16,17] og i follikulær skjoldbrusk xenografttumorer [26]. EMT blir også aktivert i brystkreftceller mottar lavdose stråling [27]. I tillegg observerte vi at SCLC cellene når de utsettes for gjentatte runder med bestråling
in vitro
ble mer løsrevet fra andre celler og vises en langstrakt morfologi som er i tråd med en mesenchymale fenotype.
selv om bestråling er vesentlig redusere tumorbyrden hos pasienter, kan det være å kjøre cellene mot en mer aggressiv, mesenchymale fenotype. Mekanismen for dette er ikke kjent, selv om det reaktive oksygenarter (ROS) som genereres som et resultat av radioterapi eller fortsatte røyking kan forandre celleadhesjon og stimulerer celle invasjon [28]. ROS kan også indusere EMT gjennom oppregulering av E-cadherin repressor, Snail [29]. Imidlertid er denne mekanismen mindre sannsynlig som E-cadherin nivået uendret i de bestrålte cellene i vår
in vitro
modell. Den uforandret E-cadherin-genekspresjon antyder at snarere enn en klassisk EMT mekanisme som ofte observeres i NSCLC [11,12,14,15], er SCLC-celler bare oppregulering mesenchymale egenskaper. Det er mesenchymale fenotype som er ansett ansvarlig for invasjon og sekundære kolonisering av tumorceller [30]. I denne modellen, men bestråling behandling ikke klart å produsere metastaser i lungene, hjernen eller lever hos disse mus (data ikke vist). Mangelen på metastaser i
in vivo
modell kunne tilskrives verten miljøet, vanskeligheter med inter-arter signalisering (humane SCLC celler i mus), mangel på immunologiske faktorer, eller utilstrekkelig tid for celler å kolonisere sekundær organer.
