Abstract
Utviklingen av nye målrettede behandlingsformer er blitt et viktig forskningsfokus for lungekreft behandling. Vår tidligere studie har vist leptomycin B (LMB) betydelig hemmet spredning av lungekreft celler; imidlertid, p53 villtype lungekreftceller resistente mot LMB. Derfor er målet med denne studien var å utvikle og evaluere en roman terapeutisk strategi for å bevisstgjøre LMB-resistent lungekreft celler ved å kombinere LMB og doxorubicin (DOX). Blant de forskjellige behandlingsregimer, forbehandling med DOX (pre-DOX) og påfølgende behandling med LMB til A549-celler i betydelig grad redusert den 50% hemmende konsentrasjon (IC50) sammenlignet med den i LMB alene (4,4 nM
vs.
10.6 nM,
P
0,05). Analyse av cellesyklus og apoptose ved flowcytometri ytterligere bekreftet de cytotoksiske data. For å undersøke molekylære mekanismer for dette legemiddel kombinasjonseffekter, ble p53-trasé analysert ved hjelp av Western blot, og atom proteom ble evaluert ved todimensjonal-forskjell gelelektroforese (2D-DIGE) og massespektrometri. Sammenlignet med kontrollgrupper, nivåene av p53, fosfor-p53 (ser15) og p21 proteiner ble betydelig økt mens fosfor-p53 (Thr55) og survivin ble betydelig redusert etter behandling av pre-DOX og LMB (
P
0,05). 2D-DIGE /MS-analyse avdekket at sequestosome 1 (SQSTM1 /p62) hadde en betydelig økning i pre-DOX og LMB-behandlede celler (
P
0,05). I konklusjonen, våre resultater tyder på at resistente lungekreftceller med p53 villtype kan være sensibilisert til celledød ved planlagt kombinasjonsbehandling av DOX og LMB gjennom aktivering og gjenopprette p53 samt potensielt andre signalveien (er) med sequestosome en.
Citation: Lu C, Shao C, Cobos E, Singh KP, Gao W (2012) kjemoterapeutiske Sensibilisering av Leptomycin B Resistente lungekreft celler ved forbehandling med doxorubicin. PLoS ONE 7 (3): e32895. doi: 10,1371 /journal.pone.0032895
Redaktør: Ashraf B. Abdel-Naim, Avdeling for farmasi, Ain Shams universitet, Egypt
mottatt: 13 desember 2011; Godkjent: 07.02.2012; Publisert: 7 mars 2012 |
Copyright: © 2012 Lu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft fortsetter å være den ledende årsak til kreft. død over hele verden og i USA [1]. Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er fortsatt den dominerende formen for lungekreft (ca 85% av alle lungekrefttilfellene), blant annet lunge adenokarsinom (AC) er den hyppigste histologisk subtype for alle kjønn og raser sammen [2]. Prognosen for lungekreft er svært dårlig, med en 5-års overlevelse på mindre enn 15% i USA. Kjemoterapi fortsetter å være den vanligste behandlingen for å forlenge overlevelse og bedre livskvalitet [3], [4], [5], [6].
Kreft kjemoterapi har vært brukt med hell i en rekke forhold som involverer maligniteter, men dens effektivitet har ofte blitt begrenset av legemiddelresistens og bivirkninger [7]. Terapi med fokus på spesifikt molekyl (er) /bane (e) har potensial til å overvinne disse begrensningene [7]. Leptomycin B (LMB) og /eller dets derivater, som effektivt kan hemme atom eksport ved spesifikt å hemme kromosom region vedlikehold 1 (CRM1), har blitt anerkjent som en ny klasse av kreftbehandling [8], [9], [10], [11], [12]. CRM1, best karakterisert atom eksport reseptor, spiller en viktig rolle i kanonisk kjernefysisk eksport signal (NES) -avhengig atom eksport, inkludert større svulst suppressor proteiner (tsps) som p53, FOXO, pRB, p21, p27, etc., som vel som inhibitoren av NF-kB, nemlig i-kB [9], [13]. Nyere studier har rapportert at CRM1 uttrykkes på et vesentlig høyere nivå i livmorhalskreft, sammenlignet med normalt vev [14] og kan tjene som et prognostisk faktor for eggstokkreft [15] og osteosarkom [16]. Vårt nylig publisert
in vitro
studier med normal lunge epitelceller [17] og en bitransgenic musemodell [18] har antydet at CRM1 spiller en avgjørende rolle i lungekreft utvikling. I tillegg CRM1 var over-uttrykt i en tobakks karsinogen-induserte lunge AC musemodell, og human lunge AC (upubliserte data). Disse funnene tyder CRM1 kan tjene som et molekylært mål for behandling av kreft, inkludert lungekreft.
LMB er en svært spesifikk og potent inhibitor av CRM1 funksjon ved irreversibel binding med sulfhydrylgruppen av en Cys-rest nær eller innenfor last bindende domene av CRM1 (alkylerende Cys 528) [19], [20]. Således LMB kan hindre cytoplasmisk lokalisering og modulere kreftspesifikke reaksjonsveier, slik som inaktivering av viktige tumor-suppressorer som p53 [10]. Vår nylig studie viste at lunge AC-cellelinje A549 (p53 villtype) var mer resistent mot LMB enn andre cellelinjer med p53 mutert eller null [12]. Det er vel kjent at p53 spiller en viktig rolle i å fremme genomisk stabilitet, cellesyklus-stans, apoptose, DNA-reparasjon, og begynnende alderdom. Studier har antydet at funksjonene til villtype p53 på cellevekst arrest og DNA reparasjon kan øke motstanden mot radio- eller kjemo- terapeutiske midler; Det er også utsatt for å forsterke apoptose i respons til alvorlig skade på DNA [21], [22], [23]. Derfor, for å sensibilisere kreftcelle lunge til den kjemoterapeutiske effekten av LMB, vi heri foreslår en terapeutisk strategi som kombinerer LMB med andre legemidler ved å fremkalle alvorlige DNA-skade og p53-aktivering som til slutt kan føre til økt funksjon av p53 i apoptose i stedet for i DNA-reparasjon. Doksorubicin (DOX) er et mye brukt kjemoterapeutisk middel som induserer apoptose i forskjellige kreftceller gjennom aktivering av p53. Det har vært brukt i behandling av en rekke forskjellige faste tumorer. Men legemiddelresistens i DOX inneholder regimer er et stort problem som hindrer bedre responsrater og kurer og kardio bivirkninger er rapportert hos kreftpasienter som behandles med DOX [24], [25], [26]. Enkelte behandlinger av DOX resulterte i en sterk motstand i mange cancercellelinjer inkludert A549, på grunn av flere mekanismer, inkludert medikament biotilgjengelighet [27], [28] eller NF-kB-aktivering [29]. Hvis DOX er kombinert med andre kjemoterapeutiske midler, kan lavere doser anvendes for å ikke bare redusere bivirkninger, men også øke effektiviteten [30].
I denne studien, søkte vi å gå tilbake legemiddelresistens til DOX og /eller LMB i A549-celler via forskjellige terapeutiske regimer for en samtidig behandling av DOX og LMB, samt evaluere deres mulige molekylære mekanismer. Vi har funnet at forbehandling av DOX med den etterfølgende behandling av LMB sensibiliserte de medikamentresistente A549-celler til det kjemoterapeutiske effekten av LMB. Disse endringene kan resultere fra den første aktivering av p53 av DOX behandling og dermed CRM1 funksjon blokkering av LMB behandling for å samle aktivert p53 i atomrommet. Videre kan signalveier som involverer andre enn p53 molekyler også spille viktige roller i å fremme terapeutiske effekten av den kombinerte behandlingen av DOX og LMB.
Materialer og metoder
Reagenser
Doxorubicin (DOX) og dimetylsulfoksyd (DMSO) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich LLC, St. Louis, MO. LMB (1 mm) ble kjøpt fra LC Labs, Woburn, MA. Bestanden av DOX (10 mg /ml) og LMB ble fortynnet til den nødvendige konsentrasjon umiddelbart før bruk med vekstmedium. 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) ble innkjøpt fra USB Corporation. RPMI-1640 medium, penicillin /streptomycin, og fosterets bovint serum (FBS) ble kjøpt fra Thermo Scientific, Logan, UT. Primære antistoffer, inkludert p53, fosfor-p53 (Ser15), fosfor-p53 (Thr55), p21, sequestosome 1 (SQSTM1 /p62), og Survivin, ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA. Primær kanin polyklonale anti-α-tubulin ble kjøpt fra Abcam, Cambridge, MA. Pepperrot-peroksidase (HRP) -konjugert esel-anti-kanin-IgG og en forsterket kjemiluminescens (ECL) sett ble kjøpt fra GE Healthcare, Piscataway, NJ. Radioimmunopresipitasjonsanalyse assay (RIPA) lyseringsbuffer ble innkjøpt fra Santa Cruz Biotechnology.
Celler og cellekultur
humant lunge adenokarsinom epiteliale cellelinjer A549 og NCI-H358 ble erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC ). Cellene ble dyrket i RPMI-1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 50 U /ml penicillin og 50 mg /ml streptomycin. Cellene ble inkubert ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 95% luft og 5% CO
2 på volumbasis. Cellene ble sub-dyrket eller belagt for påfølgende behandling før de nådde omtrent 80% konfluens.
celleviabilitet Assay
Cellelevedyktigheten ble evaluert ved hjelp av MTT-assay som tidligere beskrevet [17]. I korthet ble cellene sådd ut i 5 x 10
3-celler per brønn i 96-brønners plater. Basert på cytotoksisiteten av DOX eller LMB observert i denne studien og tidligere rapporter [9], [12], [26], [31], [32], [33], 0,5 nM LMB eller 0,5 uM DOX ble valgt for ko -rensing eller forbehandling. Cellene ble behandlet med den følgende: 1) DOX alene (0-5 uM) i 24 og 48 timer; 2) LMB alene (0-10 nM) i 24 og 48 timer; 3) co-behandling på 0,5 nM LMB og DOX (0-5 mm) samtidig (DOX + LMB (0,5 nM)) i 24 og 48 timer; 4) co-behandling på 0,5 mikrometer DOX og LMB (0-10 nM) samtidig (LMB + DOX (0,5 mm)) i 24 og 48 timer; 5) forbehandling av 0,5 nM LMB i 24 timer (pre-LMB) og påfølgende DOX (0-5 mm) i 48 timer (pre-LMB + DOX); og 6) forbehandling av 0,5 uM DOX i 24 timer (pre-DOX) og påfølgende LMB (0-5 nM) i 48 h (pre-DOX + LMB). Etanol (EtOH, 0,1%) ble benyttet som bærerkontroll for LMB. Tre timer før slutten av hvert tidspunkt, ble 15 ul av MTT (10 mg /ml) tilsatt til hver brønn og inkubert ved 37 ° C. Ved hvert tidspunkt, da fiolett bunnfall var synlig under mikroskopet, ble 100 pl 100% DMSO tilsatt til alle brønner og cellelevedyktigheten ble bestemt ved å måle absorbans ved 570 nm (referansebølgelengde = 630 nm) ved bruk av en SpectraMax Plus-spek fotometer (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Seks replikater på hver konsentrasjon og tidspunkt ble analysert. Eksperimenter ble utført uavhengig av hverandre i tre eksemplarer. Vehikkelbehandlede kontroller og blanks ble inkubert i samme plate under de samme betingelser. Delvis absorbans ble beregnet ved hjelp av følgende formel:.% Celleviabilitet = bety absorbans i testbrønner /bety absorbans i kontrollbrønner × 100
Analyse av Cellesyklus og apoptose ved flowcytometri
Celler ble først gitt forbehandling av 0,5 uM DOX i 24 timer og deretter ble behandlet med LMB for ytterligere 48 timer. Derfor ble cellene høstet etter totalt 72 timer fra behandlingen. Basert på cellelevedyktigheten assay, totalt 6 grupper av A549-celler med forskjellige behandlinger ble analysert, inkludert kontrollen, 0,5 pM DOX (pre-DOX), 1 nM LMB (LMB1), pre-DOX og 1 nM LMB (pre- DOX + LMB1), 5 nM LMB (LMB5), og pre-DOX og 5 nM LMB (pre-DOX + LMB5). For cellesyklusanalyse, totalt 2 x 10
5-celler fra hver behandlingsgruppe ble samlet opp og fiksert i 70% etanol i mer enn 24 timer ved 4 ° C. Cellene ble farget med Guava Cell Cycle Reagens (Millipore) og kjøre på en Guava EasyCyte ™ Flowcytometer (Millipore). En total av 5 x 10
3 arrangement ble tellet, og prosentandelen av celler i pre-G1, G0 /G1, S og G2 /M-fasene av cellesyklusen ble bestemt ved anvendelse av GuavaSoft programvare (Millipore). For apoptose analyse ble ViaCount analyse utføres for å bestemme levedyktige og døde celler. I korte trekk, cellesuspensjon (5 x 10
5 celler /ml) ble blandet med Guava ViaCount reagens (Millipore), og blandingen ble inkubert ved romtemperatur i 5 minutter for å farge cellene. De fargede celleprøver ble kjørt på en Guava EasyCyte ™ Flowcytometer (Millipore). Totalt 5 × 10
3 hendelser ble talt og data ble anskaffet ved hjelp Guava ViaCount programvare (Millipore). Hver prøve ble kjørt i triplikat, og hvert eksperiment ble gjentatt tre ganger.
Western Blot
De samme seks behandlingsgrupper på A549-celler som beskrevet i flowcytometri ble analysert for Western blot. Cellene i hver gruppe ble lysert i RIPA-lyseringsbuffer på is. Lysatene ble ultralydbehandlet og deretter sentrifugert ved 13 000 x g i 5 min ved 4 ° C for å samle supernatanten. Proteinkonsentrasjoner ble målt ved bruk av Bio-Rad Bradford proteinanalyse. Totalt 30 ug protein per prøve ble separert ved 12% SDS-polyakrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE) og deretter overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner. De immobiliserte proteiner ble så inkubert over natten ved 4 ° C i blokkeringsbuffer inneholdende 3% fettfri tørrmelk i 1 x fosfatbufret saltvann (PBS) og 0,1% Tween 20 (1 x PBST). Etter blokkering ble membranene probet med det primære antistoff i 1 time. -Antistoff-binding ble påvist med esel anti-kanin-IgG-HRP ved en fortynning på 1:1,000 i 1 time ved romtemperatur. Etter en kort inkubasjon med ECL, ble signalene på membranene eksponert for røntgenfilmer (Fujifilm Corporation, Tokyo). Relative densitometriske digital analyse av proteinbånd ble bestemt ved anvendelse av Mengde En programvare (Bio-Rad) og normalisert med intensiteten av husholdningsgenet (α-Tubulin, 1:10,000 fortynning) for hver prøve.
Effekter av DOX og LMB på Nuclear proteinprofil
for å evaluere effekten av DOX og LMB på proteiner i tillegg til de som er i p53 vei, en gel-basert proteomikk tilnærming, todimensjonal-forskjell gelelektroforese (2D-DIGE), var først utført for å undersøke atomproteinprofiler etter LMB behandling. Protein flekker som viser store endringer ble identifisert ved væskekromatografi-massespektrometri (LC /MS /MS) og bekreftet ved Western blot. Endringer i protein (er) ble videre undersøkt i celler med kombinert behandling av DOX og LMB av Western blot.
Nuclear Protein Extraction.
For proteomikk analyse, kjerneproteiner ble hentet følgende protokoller som beskrevet av Lu
et al product: [34]. I korte trekk, basert på vår tidligere studie [12], A549 eller NCI-H358-celler, behandlet med vehikkel-kontroll (0,1% EtOH) eller 20 nM LMB i 24 timer (i duplikat), ble skyllet med iskald PBS, høstet, og suspendert i iskald buffer A inneholdende 10 mM tris-HCl (pH: 7,4, Bio-Rad), 8 M Urea (Bio-Rad), 4% (vekt /volum) 3 – [(3-cholamidopropyl) dimetylammonio] -1-propan (CHAPS, Bio-Rad), 0,5 mm ethylenediaminetetraacetic (EDTA, Bio-Rad), 2,5 mM MgCl
2 (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ), 0,5 mM PMSF (Santa Cruz Biotechnology), en x protease inhibitor cocktail (Roche, Basel, Sveits), og 1% (volum /volum) NP-40 (USB Corporation, Cleveland, OH). Blandingen ble homogenisert med en 21-gauge nål, fulgt av sentrifugering av homogenatet ved 700 x g i 10 minutter ved 4 ° C for å utfelle kjernene. De cytoplasmatiske ekstrakter i supernatanter ble samlet og pelletene ble resuspendert i 1 ml iskald buffer B (20 mM tris-HCl, pH 8,5 og 1 x protease-inhibitor cocktail), ultralydbehandlet på is, og blandes med 0,737 g urinstoff, 0,267 g tiourea og 0,07 g (vekt /volum) CHAPS. Etter inkubering på is i 1 time, ble supernatanter inneholdende kjernefysiske ekstraktene oppsamlet ved sentrifugering ved 100.000 x g i 1 time ved 4 ° C. Proteinkonsentrasjoner ble målt ved Bradford-analyse (Bio-Rad). Kvaliteten på atom ekstraksjon ble bestemt, og den identifiserte protein ble bekreftet ved Western blot. α-tubulin (tilstede i cytoplasma) og histon 3 (tilstede i kjernen) ble brukt til å validere og bekrefter renheten av proteinfraksjoner.
2D-Dige.
Atom protein ekstraksjon for 2D- DIGE ble kjørt som tidligere beskrevet [35]. I korte, kjernefysiske protein utdrag fra A549 eller NCI-H358-celler med eller uten LMB behandling (i duplikat) ble omvendt merket med Cy3 og Cy5 henholdsvis (GE Healthcare). Rør inneholdende 50 ug av hver prøve ble kombinert med en pl fortynnet Cy3 eller Cy5 (400 pmol /ul i N, N-dimetylformamid, Sigma). Etter sentrifugering ble blandingen fikk stå på is i 30 minutter uten lyseksponering. Deretter ble reaksjonen stoppet ved tilsetning av 1 pl av 10 mM lysin (Sigma) og plassering av prøvene på is i 10 min i mørket. Prøver (inneholdende 100 ug proteiner) merket med Cy3 og Cy5, ble fortynnet til 300 ul ved tilsetning av 2D rehydratisering buffer (BioRad) som består av 8 M urea, 0,5% CHAPS, 10 mM ditiotreitol (DTT, Bio-Rad), 0,2% biolytes amfolytt, og spor bromfenolblått. Prøvene ble deretter påført på 17 cm immobilisert lineær pH-gradient 3-10 (IPG) strimler (BioRad) for rehydrering over natten. Isoelektrisk fokusering ble utført ved 250 V i 20 minutter ble gradvis økt til 10 000 i løpet av 2,5 timer, og holdt ved 10 000 V for en total på 50.000 Spennings timer (Vh). IPG strimler ble deretter ekvilibrert med buffer I (6 M urea, 2% SDS, 375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 20% glyserol, 130 mM DTT, og spor bromfenolblått) og buffer II (6 M urea, 2% SDS, 375 mM Tris-HCl, 20% glyserol, 135 mM jodacetamid, og spor bromfenolblått). Proteiner ble deretter separert med 12% SDS-PAGE-geler og visualisert ved hjelp av en Typhoon Trio Imager (GE Healthcare) på eksitasjonsbølgelengdene av 532 og 633 nm for henholdsvis Cy3 og Cy5,. Bilder ble manipulert og analysert ved DeCyder og Imagequant programvare (GE Healthcare); protein intensitet forskjeller ble beregnet for hver spot på hver gel.
In-gel fordøyelse.
2D-geler ble farget med SYPRO-RUBY (Bio-Rad). Flekker av interesse ble isolert ved anvendelse av en flekk velger, og plassert i et 0,5 ml Eppendorf-rør for trypsin fordøyelse på en ProGest (Genomiske oppløsninger) arbeidsstasjons [35]. I korte trekk, ble gel plugger vasket med DIH
2o, og behandlet med acetonitril (ACN) i 15 min. Gelstykkene ble rehydrert med 10 mM DTT og 0,1 M ammoniumbikarbonat (NH
4HCO
3) i 30 minutter ved 60 ° C i vannbad. Etter krymping igjen med ACN, en oppløsning inneholdende 55 mM jodacetamid (Bio-Rad) og 0,1 M NH
4HCO
3 ble tilsatt i 20 min uten lyseksponering, og deretter byttet ut med 0,1 M NH
4HCO
3 i 15 min. Gelen pluggene ble deretter vasket i 0,1 M NH
4HCO
3 i 5 minutter, mens tilsetning av et like stort volum ACN i 5 min. Etter gjentagelse vasketrinnet to ganger, gel bitene var dehydrert ved ACN, og deretter tørket i 30 min. Individuelle gelbitene ble rehydratisert i fordøyelse buffer inneholdende 12,5 ng /ul trypsin (Promega), 40 mM NH
4HCO
3, og 10% ACN ved 37 ° C i 4 timer. Maursyre ble tilsatt for å stoppe reaksjonen, og supernatanten ble analysert direkte.
LC /MS /MS Identifikasjon.
trypsinert peptider ble analysert ved hjelp av nano LC /MS /MS på en ThermoFisher LTQ Orbitrap XL. I korte trekk, ble 30 ul av hydrolysat fylt på en 5 mm x 75 pm ID C12 (Jupiter Proteo, Phenomenex) ventilert kolonnen ved en strømningshastighet på 10 uL /min. Gradienteluering ble utført på en 15 cm ved 75 um ID C12-kolonne ved 300 nL /min. En 30 min gradient ble anvendt. Massespektrometer ble drevet i en dataavhengig modus, og de seks mest tallrike ionene er blitt valgt for MS /MS. Massespektrometri resultater ble søkt hjelp Mascot (www.matrixscience.com). Prøvene ble behandlet i Stillas algoritmen bruker DAT filer generert av Mascot. Parametere for LTQ Orbitrap XL data krever et minimum av to peptid kamper per protein med minimum sannsynligheten for 90% på proteinnivå.
Statistiske analyser
Fakultet ANOVA ble utført for å teste effekten av DOX og /eller LMB konsentrasjoner og inkubasjonstider på cellenes levedyktighet. Probit-analyse ble brukt for å beregne 50% hemmende konsentrasjoner (IC50s). For data innhentet fra flowcytometri, ble gjennomsnittlig celle prosenter beregnet og statistisk signifikans ble bestemt via enveis ANOVA og post hoc tester. For protein expression nivåer mellom kontroll, pre-DOX, LMB1, pre-DOX + LMB1, LMB5, og pre-DOX + LMB5, enveis ANOVA og Tukey innlegg hoc tester ble brukt for å sammenligne densitometrisk intensiteten av enkeltprøver mellom grupper. For 2D-DIGE, ble bildeanalyse utført med DeCyder programvare (GE Healthcare) og ImageMaster programvare. For DeCyder programvare ble Differential In-Gel Analysis (DIA) modulen brukes til å behandle et par bilder fra en enkelt gel, og utføre flekk deteksjon og kvantifisering. Den biologiske variasjonen Analysis (CDG) ble anvendt for å beregne forhold mellom prøver og kontrollprøver ved å utføre en gel-til-gel matching av paret av punktkart fra hver gel. Flekkene med mer enn to ganger endring i revers-merket dupliserte eksperimenter sammenlignet med kontroller ble ansett som target proteiner. Alle analyser ble utført ved hjelp av SPSS programvare (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) og forskjeller med
P
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
cytotoksisiteten av DOX eller LMB
MTT-analysen ble utført for å bestemme celle-levedyktighet på hvert tidspunkt. Som vist i figur 1A og 1B, både DOX og LMB i betydelig grad hemmet celleproliferasjon av A549 i en dose- og tidsavhengig måte (
P
0,001). De IC50s av DOX og LMB etter 48 timer var 2,2 pM og 10,6 nM (tabell 1). På samme måte både DOX og LMB betydelig hemmet celledeling av NCI-H358 i en dose- og tidsavhengig måte (
P
0,001, Figur S1 A og S1B)
A, Cytostatikum. virkningene av DOX alene og DOX + LMB på cellelevedyktigheten til A549-celler som bestemt ved MTT-analyse. Data er uttrykt som prosent ved å sammenligne til bærerkontrollen for DOX og LMB (0,5 nM) for DOX + LMB. Verdier er representert som middel ± SD, n = 6. B, Cytotoksiske effekter av LMB alene og LMB + DOX på cellelevedyktigheten til A549-celler som bestemt ved MTT-analyse. Data er uttrykt som prosent ved å sammenligne til kjøretøy kontroll for LMB og DOX (0,5 mm) for LMB + DOX. Verdier er gjennomsnitt ± SD, n = 6. C, cytotoksiske effektene av DOX alene og pre-LMB + DOX på cellelevedyktigheten av A549 celler på 48 timer som bestemmes av MTT analysen. Data er uttrykt som prosent ved å sammenligne til bærerkontrollen for DOX og pre-LMB for salg LMB + DOX. Verdier er gjennomsnitt ± SD, n = 6. D, cytotoksiske effektene av LMB alene og pre-DOX + LMB på celle levedyktighet av A549 celler på 48 timer som bestemmes av MTT analysen. Data er uttrykt som prosent ved å sammenligne til bærerkontrollen for LMB og pre-DOX for pre-DOX + LMB. Verdier er gjennomsnitt ± SD, n = 6. Forsøk utført i tre eksemplarer ga lignende resultater.
Cytotoksisitet of Co-behandling av DOX og LMB
I likhet med DOX eller LMB grupper, DOX + LMB (0,5 nM) eller LMB + DOX (0,5 mm) hemmet A549 spredning i en dose- og tidsavhengig måte (
P
0,001, figur 1A og 1B). Men den samtidige behandlinger av DOX + LMB (0,5 nM) eller LMB + DOX (0,5 uM) ikke endrer cytotoksiske effekter på A549-celler sammenlignet med DOX alene eller LMB alene ved både 24 og 48 timer (
P
0,05, figur 1A og 1B). De IC50s av DOX + LMB (0,5 nM) og LMB + DOX (0,5 uM) etter 48 timer var 2,1 uM og 10,4 nM (tabell 1). Tilsvarende hadde den samtidige behandlinger av DOX + LMB (0,5 nM) eller LMB + DOX (0,5 uM) ikke endrer cytotoksiske effekter på NCI-H358-celler sammenlignet med DOX alene eller LMB alene ved både 24 og 48 timer (
P
. 0.05, Figur S1 A og S1B)
Cytotoksisitet av pre-LMB + DOX eller pre-DOX + LMB
Som vist i figur 1C, forbehandling av 0,5 nM LMB ikke øke den cytotoksiske effekten av DOX på A549 celler på 48 h sammenlignet med DOX alene (
P
0,05). De IC50s ved 48 timer av pre-LMB + DOX og DOX alene, var 2,8 og 2,2 pM, henholdsvis (tabell 1). Imidlertid forbehandling av 0,5 uM DOX øket cytotoksisk effekt av LMB på A549-celler i betydelig grad ved 48 h (
P
0,05, figur 1D). IC50 ved 48 timer av pre-DOX + LMB var 4,4 nM, som var betydelig lavere enn den til LMB alene (10,6 nM,
P
= 0,037, tabell 1). Videre fikk enten pre-LMB eller pre-DOX ikke forbedre den cytotoksiske effekten av DOX eller LMB på NCI-H358-celler (
P
0,05, Figur S1C og S1D).
Effekter av DOX og LMB på celle~~POS=TRUNC syklus~~POS=HEADCOMP og apoptose
Celleproliferering hemming kan være et resultat av enten cellesyklus arrest eller apoptose, og dermed disse to aspektene ble videre undersøkt ved flowcytometri analyse av A549 celler etter LMB og DOX behandling. Analysen cellesyklusen viste at prosentandelen av celler i G2 /M var 15,1 ± 0,4, 26,9 ± 2,8, 22,7 ± 1,0, 22,9 ± 4,2, 22,5 ± 2,8 og 18,6 ± 1,3 i kontroll, pre-DOX, LMB1, pre -DOX + LMB1, LMB5, og pre-DOX + LMB5, henholdsvis (tabell 2). Pre-DOX, LMB1, pre-DOX + LMB1, LMB5, og pre-DOX + LMB5 alle resulterte i en opphopning i G2 /M fase versus kontroll (
P
0,05, Figur 2 og Tabell 2 ). I tillegg har analysen cellesyklus viste at prosentandelen av celler i pre-G1 var 5,4 ± 2,2, 9,0 ± 2,1, 8,2 ± 2,0, 18,6 ± 7,1, 10,2 ± 4,7 og 27,5 ± 2,8 i kontroll, pre-DOX, LMB1, pre-DOX + LMB1, LMB5, og pre-DOX + LMB5, henholdsvis (tabell 2). Pre-DOX + LMB1 og pre-DOX + LMB5 resulterte i en endelig konsentrasjon i den pre-G1 fase i forhold til ikke bare kontroll, men også LMB alene (
P
0,01, Figur 2 og Tabell 2). Analyse av apoptose viste at LMB behandling signifikant induserte celle apoptose (
P
0.01, tabell 2). Apoptose ble ytterligere øket etter at cellene ble ko-behandlet med pre-DOX og LMB i forhold til LMB alene (
P
0.01, tabell 2). Prosentandelen av apoptotiske celler var 13,2 ± 1,6, 15,8 ± 2,6, 19,2 ± 2,4, 27,1 ± 0,6, 22,4 ± 4,0, og 29,6 ± 2,1 i kontroll, pre-DOX, LMB1, pre-DOX + LMB1, LMB5, og pre -DOX + LMB5, henholdsvis (tabell 2).
Representative histogrammer av cellesyklus analyser i DOX og LMB-behandlede A549 celler. Control, pre-DOX, LMB1, pre-DOX + LMB1, LMB5, og pre-DOX + LMB5 ble høstet og merket med Guava Cell Cycle Reagens (Millipore) og analysert ved flowcytometri (pre-G1, G0 /G1, S, og G2 /M). Y-aksen viser antall celler tellet, og x-aksen viser en økende mengde av Guava Cell Cycle Reagens inkorporering /celle (venstre til høyre). Eksperimenter utført i triplikat ga lignende resultater. LMB1: 1 nM LMB, LMB5. 5 nM LMB
Western blot analyser av p53, Phospho-p53 (Ser15), Phospho-p53 (Thr55), p21, og Survivin Protein Expression etter DOX og LMB Behandling
Expression nivåer av p53, fosfor-p53 (Ser15), og p21 (et nedstrøms mål av p53) ble signifikant økt i celler behandlet med pre-DOX + LMB enn de av kontroller og viste en signifikant dose-responseffekt (figur 3A). De relative protein uttrykk nivåer av p53 (vilkårlige enheter) var 0,02 ± 0,00, 0,03 ± 0,00, 0,07 ± 0,00, 0,13 ± 0,03, 0,45 ± 0,01 og 0,44 ± 0,00 i kontroll, pre-DOX, LMB1, pre-DOX + LMB1, LMB5, og pre-DOX + LMB5, henholdsvis (figur 3B,
P
. 0,05, LMB1
vs
kontroll;
P
0,01, pre -DOX + LMB1, LMB5, eller pre-DOX + LMB5
vs.
kontroll). De relative protein ekspresjonsnivå av fosfo-p53 (Ser15) (vilkårlige enheter) var 0,06 ± 0,00, 0,06 ± 0,00, 0,13 ± 0,03, 0,15 ± 0,01, 0,21 ± 0,01 og 0,77 ± 0,04 i kontroll, pre-DOX, LMB1 , pre-DOX + LMB1, LMB5, og pre-DOX + LMB5, henholdsvis (figur 3B,
P
0,05, LMB5
vs
kontroll;.
P
0,01, pre-DOX + LMB5
vs
kontroll).. Videre er det opp-regulering av fosfo-p53 (Ser15) i pre-DOX + LMB5 var signifikant sammenliknet med LMB5 gruppe (
P
0,01). Relative protein expression nivåer av p21 (vilkårlige enheter) var 0,29 ± 0,08, 0,69 ± 0,01, 0,85 ± 0,09, 1,07 ± 0,03, 1,14 ± 0,08 og 1,57 ± 0,02 i kontrollen, pre-DOX, LMB1, pre-DOX + LMB1 , LMB5 og pre-DOX + LMB5, henholdsvis (figur 3B,
P
0,01, pre-DOX, LMB1, pre-DOX + LMB1, LMB5, og pre-DOX + LMB5
vs.
kontroll). Videre er det opp-regulering av p21 i pre-DOX + LMB5 var signifikant (
P
0,05). Sammenlignet med LMB5 gruppe
A, Effekter av pre-DOX + LMB behandlings på protein ekspresjon av p53, fosfo-p53 (Ser15), fosfo-p53 (Thr55), P21, og survivin i A549. Celler ble behandlet med 0,5 uM DOX 24 timer før behandling med LMB (1 nM eller 5 nM). Etter 48 timer LMB behandling ble cellene høstet for Western blot-analyse for å bestemme proteinnivåer. Blotter ble også analysert for α-tubulin å bekrefte lik protein lasting. B, De relative intensitetene av protein p53, fosfo-p53 (Ser15), fosfo-p53 (Thr55), P21, og Survivin sammenlignet med intensiteten av α-tubulin. Intensiteten av hvert bånd ble kvantifisert ved hjelp Antall ett-maskinen. Dataene er gjennomsnitt ± SD, n = 3. Forsøkene ble utført in triplo. LMB1: 1 nM LMB; LMB5: 5 nM LMB; *,
P
0,05 sammenlignet med kontroll; **
P
0,01 sammenlignet med kontroll; #
P
0,05, sammenlignet med LMB5; ##,
P
. 0,01, sammenlignet med LMB5
I motsetning til p53, fosfor-p53 (Ser15), og p21 uttrykk nivåer, fosfor-p53 (Thr55) og survivin (en annen nedstrøms mål for p53) ekspresjonsnivåer var signifikant og doseavhengig redusert i celler behandlet med pre-DOX + LMB sammenlignet med dem for kontrollgruppen (figur 3A). De relative protein ekspresjonsnivå av fosfo-p53 (Thr55) (vilkårlige enheter) var 0,67 ± 0,06, 0,56 ± 0,01, 0,65 ± 0,01, 0,57 ± 0,00, 0,56 ± 0,01 og 0,42 ± 0,00 i kontroll, pre-DOX, LMB1 , pre-DOX + LMB1, LMB5, og pre-DOX + LMB5, henholdsvis (figur 3B,
P
. 0,01, pre-DOX + LMB5
vs
kontroll). De relative protein ekspresjonsnivå av Survivin (vilkårlige enheter) var 0,28 ± 0,02, 0,23 ± 0,03, 0,23 ± 0,05, 0,14 ± 0,01, 0,12 ± 0,05 og 0,08 ± 0,00 i kontroll, pre-DOX, LMB1, pre-DOX + LMB1, LMB5, og pre-DOX + LMB5 behandlet grupper, henholdsvis (figur 3B,
P
. 0,05, pre-DOX + LMB5
vs
kontroll).
Effekter av DOX og LMB på Nuclear proteinprofil
Nuclear Protein Extraction.
Purity av atom og cytoplasmatiske proteiner ble testet ved hjelp av Western blot analyse med anti-histon 3 og anti-α-tubulin . Flertallet av α-tubulin ble funnet bare i cytoplasmafraksjonen fra A549 og NCI-H358-celler; histone tre ble funnet bare i kjernefraksjonen fra A549 og NCI-H358-celler, noe som tyder på at preparatet ble beriket for kjerneproteiner (4A og S2A).
A, Western blot av kjernefysiske og cytoplasmatiske proteiner utdrag fra A549; α-tubulin fungert som en intern kontroll for cytoplasmatiske proteiner, og histon 3 fungerte som kontrollgruppe for kjerneproteiner. B, 2D-DIGE analyser av kjerneproteiner i A549 celler og 3D-visning av SQSTM1 i A549 cellen med kjøretøykontroll eller LMB behandling. Atom proteiner behandlet med LMB eller kjøretøy kontroll ble merket med Cy3 (grønn kanal) og Cy5 (rød kanal), henholdsvis. Nukleære proteiner ble separert på grunnlag av isoelektrisk punkt (PI, horisontal akse) og molekylvekt (MW, vertikal akse).
