Abstract
Forekomst av kreft stamceller lignende celler (cscs) er en av de mekanismene som er ansvarlig for chemoresistance som har vært en stor hindring mot lunge adenokarsinom (LAD) behandling. Nylig har vi identifisert mikroRNA (MIR) -200b som en viktig regulator av chemoresistance i menneskelige docetaxel-resistente LAD celler. Men om MIR-200b har effekt på regulering cscs fortsatt i stor grad uklart og må belyses ytterligere. Her viste vi at Mir-200B var signifikant nedregulert i CD133
+ /CD326
+ celler som viste egenskaper cscs avledet fra docetaxel-resistente LAD celler. Også restaurering av MIR-200b kan hemme vedlikehold og reversere chemoresistance av cscs. Videre suppressor av Zeste-12 (Suz-12) ble identifisert som en direkte og funksjonell målet på MIR-200B, og stanse all Suz-12 phenocopied effektene av MIR-200b på cscs. I tillegg overekspresjon av histondeacetylase (HDAC) 1 ble identifisert som en sentral mekanisme ansvarlig for MIR-200b undertrykkelse i cscs gjennom en spesifisitet protein (Sp) en avhengig mekanisme, og restaurering av MIR-200b av HDAC1 undertrykkelse undertrykte betydelig cscs dannelse og reversert chemoresistance av cscs ved å regulere Suz-12-E-cadherin signalering. Også nedregulering av HDAC1 eller oppregulering av MIR-200b redusert
in vivo
tumorigenicity av cscs. Endelig Suz-12 ble omvendt korrelert med MIR-200b, positivt korrelert med HDAC1 og oppregulert i docetaxel-resistente LAD vev sammenlignet med docetaxel-sensitive vev. Til sammen kan det HDAC1 /MIR-200b /Suz-12-E-cadherin signale står for vedlikehold av cscs og dannelse av kjemoresistent fenotype i docetaxel-resistente LAD celler
Citation. Chen DQ, Huang JY, Feng B, Pan BZ, De W, Wang R, et al. (2014) histondeacetylase 1 /SP1 /mikroRNA-200b Melde Regnskap for vedlikehold av kreft Stilk-lignende celler i Human Lung Adenocarcinoma. PLoS ONE 9 (10): e109578. doi: 10,1371 /journal.pone.0109578
Redaktør: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 17 juni 2014; Godkjent: 01.09.2014; Publisert: 03.10.2014
Copyright: © 2014 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (https://www.nsfc.gov.cn/) (LBC Nei . 81272474, BF nr 81301914). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lung kreft står for de fleste kreftrelaterte dødelighet i både kvinner og menn over hele verden [1]. Kjemoterapi er en viktig del av de første-linje behandling for lunge adenokarsinom (LAD) som utgjør den vanligste histologiske formen for lungekreft. Imidlertid chemoresistance representerer en dominerende hindring mot kjemoterapeutisk behandling av LAD, noe som fører til dårlig prognose av pasientene. Dermed utforske mulige molekylære mekanismene som er involvert i chemoresistance har blitt et sentralt tema i klinisk behandling av menneskelige LAD.
Kreft stilk-lignende celler (cscs) eller tumor initiere stamceller er en sub-populasjon av kreftceller og spille sentrale roller i kreft initiering, progresjon, tilbakefall og chemoresistance [2] – [5]. Cscs, avledet fra både cscs og ikke-cscs, gi opphav til svulster gjennom selvfornyelse og er i stand til å differensiere i flere celletyper [6] – [9]. Mange kreftbehandlingen inkludert kjemoterapi som dreper mesteparten av kreftceller, kan til slutt mislykkes fordi de ikke eliminere cscs som deretter forårsaker et tilbakefall av svulster [10]. Nylig er det blitt fastslått at cscs er knyttet til epitel-mesenchymale overgang (EMT), metastase, medikamentresistens, progresjon og tilbakefall av lungekreft [11] – [15]. Som et resultat, har utnyttelse av de spesifikke behandlingsformer rettet mot på cscs vært en viktig sak i kjemoterapeutisk behandling av lungekreft. MicroRNAs (mirnas) stillhet genekspresjon ved å binde seg til det 3′-utranslaterte område av målgener og har blitt rapportert å regulere cscs selvfornyelse, tumorgenisitet, metastase, og chemoresistance i mange humane cancere [2], [7], [ ,,,0],16]. For eksempel fører MIR-34a undertrykkelse kolon cscs å utføre asymmetrisk celledeling og fremmer dattercellene til å forbli kolon cscs ved å regulere Notch signalering. Oppregulert MIR-143 i cscs differensiering fremmer prostatakreftceller metastase ved å modulere FNDC3B uttrykk. MiR-21 regulerer EMT fenotype og hypoksi-induserbar faktor-1α uttrykk i tredje sfære forming brystkreft stamcelleliknende celler. MiR-200b, et viktig medlem av MIR-200 familier, er plassert på MIR-200b /c /429-genklusteret, fungerer som en tumor suppressor i en rekke humane solide svulster, og har evnen til å hemme cscs vekst og reversere EMT fenotype av cscs [17], [18]. Nylig har vi identifisert MIR-200B som en viktig regulator av chemoresistance og restaurering av MIR-200b reverserer betydelig chemoresistance av docetaxel (DTX) -resistente LAD celler ved å indusere cellesyklus og apoptose forbedring [19]. Men om MIR-200b regulerer cscs avledet fra docetaxel-resistente LAD celler er fortsatt dårlig forstått og må belyses ytterligere.
I denne studien, viser vi først at Mir-200b fungerer som en tumor suppressor både
in vitro Hotell og i
vivo
i cscs som stammer fra menneskelige docetaxel-resistente LAD celler. Også identifiserer vi HDAC1 som en spesifikk regulator involvert i stanse av MIR-200b gjennom en SP1 avhengig mekanisme, og restaurering av MIR-200b mediert av HDAC1 undertrykkelse betydelig undertrykker vedlikehold av cscs og reverserer chemoresistance av cscs ved å regulere Suz-12-E -cadherin signalering. Så langt vi kjenner til, har det ikke vært noen rapporter om HDAC1 /MIR-200b /Suz-12 /E-cadherin regulatoriske nettverk i å regulere cscs vedlikehold og chemoresistance i menneskelige LAD celler og den nåværende arbeid vil gi en ny strategi for å reversere chemoresistance av menneskelig LAD
Materialer og metoder
etikk uttalelse
Denne studien ble godkjent av forskningsetisk komité Jinling Hospital of Nanjing University (Permit Number: 12-027). og ble utført i samsvar med Helsinkideklarasjonen. Alle dyrene ble holdt under spesifikke patogenfrie forhold. Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i henhold til Jinling Hospital over Nanjing University for omsorg og bruk av forsøksdyr.
microbeads sortering
Kort, 3,0 × 10
7 enkeltceller var passerte gjennom 30 pm nylonnett og sentrifugert ved 300 x g i 10 minutter. Supernatanten ble deretter sugd. Deretter ble 300 pl buffer og 100 pl FcR-reagens tilsatt og blandet. 100 ul CD326 mikroperler ble tilsatt, blandet godt og inkubert i 30 minutter i kjøleskap (2-8 ° C). Cellene ble deretter vasket ved tilsetning av 2 ml buffer og sentrifugert ved 300 x g i 10 minutter. Supernatanten ble deretter sugd. Celler ble resuspendert med 500 pl buffer. Deretter ble cellesuspensjonen ble påført på separatoren kolonne plassert i det magnetiske felt. Gjennomstrømningsinneholdende umerkede celler ble oppsamlet. Deretter ble kolonnen vasket og fjernet fra separatoren og plassert på en passende samling rør. Deretter ble den passende mengde buffer pipettert på kolonnen og gjennomstrømningen inneholdende CD326-celler ble samlet opp. Endelig ble det passende antall CD326
+ celler deretter sortert med CD133 microbeads for anriking av CD133
+ /CD326
+ celler som beskrevet ovenfor. Den CD133
+ /CD326
+ cscs ble deretter dyrket i serumfritt cscs-dyrking medium: Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) /F12 medium inneholdende 0,4% BSA, 2% B27, 4 mg /ml insulin og 40 ng /ml EGF.
Cells og kulturforhold
den menneskelige LAD cellelinjer (SPC-A1 og H1299) ble kjøpt fra tumor Cell Bank of Chinese Academy of Medical Science (Shanghai, Kina). Docetaxel-resistente LAD-celler ble fremstilt som beskrevet i vårt tidligere arbeid og bevart i 50.0μg /L docetaxel [19]. Celler ble dyrket som beskrevet i vårt tidligere arbeid [20]. Den CD133
+ /CD326
+ celler ble sortert fra docetaxel-resistente LAD celler ved CD133 og CD326 mikroperler (Miltenyi Biotec) i henhold til produsentens instruksjoner.
Pasientprøver
den nåværende arbeid ble godkjent av Ethic Komiteen våre sykehus og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasientene. LAD vev ble samlet fra pasienter med LAD på avansert stadium i våre sykehus fra september 2006 til desember 2008. Pasientene møtte alle de følgende kriterier: histologisk diagnose av primær LAD med minst en målbar lesjon; klinisk stadium IIIB-IV; førstelinje kjemoterapi enten med docetaxel 75 mg /m
2 og cisplatin 100 mg /m
2 eller docetaxel 75 mg /m
2 og carboplatin arealet under kurven 6 mg /ml /min administrert hver 3 uker for maksimalt 5 sykluser. Vevsprøver ble deretter delt inn i «følsom» (fullstendig eller delvis respons) og «ufølsomme» (stabil eller progressiv sykdom) grupper basere på pasientens responser bestemt ved medisinsk bildeanalyse og påvisning av serum tumor markører etter 4 eller 5 sykluser med docetaxel- basert kjemoterapi.
Plasmider og celle transfections
Nyere studier har rapportert at Mir-200B har to funksjonelle arrangører, ligger ~4 kb og ~ 2 kb oppstrøms for 5′-stemloop henholdsvis [ ,,,0],21]. Deretter de to kjerneområdene, ligger chr1: 1087797-1088137 (341 bp) og chr1: 1089316-1090354 (1039 bp), henholdsvis (UCSC Genome Browser mars 2006) ble forsterket ved PCR og klonet inn pGL3-basic vektor (Promega ) med KpnI og Hindlll setene, oppkalt (pGL3) promoter-en og promoter-2. Videre ble flere SP1 bindingssetene ble observert i de to kjerneområdene. Og SP1 bindingssteder lokalisert chr1: 1087926-1087932, chr1: 1088073-1088079 og chr1: henholdsvis 1089779-1089785,. Deretter ble Sp1-bindende-seterettet mutant reporter vektorer konstruert ved mutasjon PCR. Luciferase reporter inneholdende villtype-3′-UTR av Suz-12 (pLUC /Suz-12 /3′-UTR-wt) hvori nukleotider i Suz-12-3′-UTR komplementære til MIR-200b ble satt inn i pLUC vektor, og vi har også generert en mutant reporter (pLUC /Suz-12 /3′-UTR-mut), der de første seks nukleotider i Mir-200b frø region komplementære områder ble mutert. Alle de primersekvensene var oppført i tabell S1. MiR-200b uttrykk plasmid (pcDNA /MIR-200B), mock pcDNA-negativ kontroll (pcDNA /MIR-NC), MIR-200b inhibitor (Anti-MIR-200B) og uspesifikk miRNA kontroll (Anti-MIR-NC) var anvendes som vår tidligere beskrevet [18]. HDAC1-shRNA (eller kontroll shRNA), Sp1-shRNA (eller kontroll shRNA) vektorer ble hentet fra GenePharma. Suz-12 ekspresjonsplasmid (pcDNA /suz-12) ble konstruert ved subkloning suz-12 inn i pcDNA 3.0-vektoren (Invitrogen) ved PCR med primerne som er oppført i Tabell S2. Alle vektorene ble bekreftet ved DNA-sekvensering. Cellene ble transfektert med Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner.
Flowcytometrisk analyse av CD133
+ /CD326
+ celler
Flowcytometrisk analyse av CD133
+ /CD326
+ celler ble utført med CD133-PE og CD326-FITC antistoffer (Miltenyi Biotec) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet, omtrent 1,0 x 10
6-celler ble sentrifugert ved 300 x g i 10 minutter. Supernatanten ble så kastet. Cellene ble resuspendert med 80 ul av buffer. 20 ul av FcR Blokkering av reagens ble deretter tilsatt til bufferen. 10 ul av CD133 /CD326 antistoff ble tilsatt, blandet godt og inkubert i 10 minutter i mørket i kjøleskap (2-8 ° C). Deretter ble cellene vasket ved tilsetning av 1-2 ml av buffer og sentrifuger ved 300 x g i 10 minutter. Supernatanten ble deretter sugd. Til slutt, ble cellene resuspendert i 400μL buffer for analyse ved strømningscytometri.
Mammosphere dannelsesbestemmelsen
Mammosphere formasjon analyse ble utført for å vurdere evnen til CSC selvfornyelse. Mammosphere-analysen ble utført ved utsåing av enkeltcellesuspensjoner (1000 celler /brønn) i ultralave adherente 6-brønns plater. Deretter ble cellene dyrket i serumfritt cscs-dyrkningsmedium og supplert med medium hver 3. dag. Etter 7 dagers inkubering, ble platene analysert for måling av mammosphere nummer.
Western blotting-analyse
De primære antistoffer mot E-cadherin, Sox-2 og Oct-4 (Abcam, HongKong ), Bmi-en, HDAC1, Suz-12 (Cell Signaling Technologies) og GAPDH (Santa Cruz Biotechnology) ble brukt i denne studien. GAPDH ble anvendt som en intern kontroll. Totalt protein lysatet ble separert ved 10% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). Proteinene ble deretter overført til polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner (Millipore). Deretter immunoblotting ble utført og visualisert med en chemiluminescence kit (Thermo Scientific).
Sanntids kvantitativ revers-transkripsjon polymerase chain reaction (QRT-PCR) assay
Total RNA ble ekstrahert med TRIzol reagens (Takara). Revers transkripsjon ble utført med PrimeScript RT reagent Kit (Takara) basere på produsentens instruksjoner. QRT-PCR ble utført med SYBR PrimeScript RT-PCR Kits (Takara) i henhold til produsentens instruksjoner. Mir-200b eller mRNA nivåer ble beregnet med to
– △△ Ct metode med U6 rRNA eller GAPDH mRNA som referanse gener. Uttrykket nivåer ble målt i forhold til folden endring av kontrollcellene som ble definert som 1,0. Alle forsøk ble utført in triplo. Alle primerpar ble oppført i tabell S3.
Drug følsomhet og celleviabilitet analysen
Drug følsomhet og celleviabilitet analysen ble målt med Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay ( Dojindo) i henhold til produsentens instruksjoner. For Drug sensitivitetsanalyse, 3 x 10
3-celler ble sådd på 96-brønners plater 24 timer etter transfeksjon. Etter festing, ble nylaget docetaxel deretter lagt på ulike sluttkonsentrasjon. 48 timer senere ble 10 ul av CCK-8 ble tilsatt og inkubert i 4 timer ved 37 ° C. Absorbans ble deretter målt ved 450 nm. For celleviabilitet assay, 2,0 x 10
3-celler ble sådd på 96-brønners plater 24 timer etter transfeksjon med de angitte vektorer. 12, 24 eller 48 timer senere ble 10 ul av CCK-8 ble tilsatt og inkubert i 4 timer ved 37 ° C. Absorbans ble deretter målt ved 450 nm. Alle forsøk ble utført in triplo og gjentas minst tre ganger.
luciferase reporter-analyse
Omtrent 2,0 x 10
3 /brønn cscs ble sådd på 96-brønners plater og deretter kotransfektert med de spesifikke luciferaserapportørplasmid plasmider, MIR-NC eller MIR-200b. Renila-TK plasmid (Promega) ble kotransfektert inn i alle prøver. 48 timer etter transfeksjon, ble luciferase aktiviteter målt med Dual-luciferaserapportørplasmid Analyse sett (Promega). Luciferase aktiviteter ble normalisert ved Renilla luciferasepreparater aktiviteter. Dataene var i forhold til folden endring av de tilsvarende kontrollgruppene som ble definert som 1,0. Alle forsøkene ble utført i tre eksemplarer.
Co-immunoprecipitation analysen
The Co-immunoprecipitation Analysen ble utført ved hjelp av Co-Immunoutfellingsunder Kits (Thermo Scientific Pierce) basere til produsentens instruksjoner. Kort, 75μg av affinitetsrensede antistoffer (SP1, HDAC1, Cell Signaling Technologies) ble koblet inn i spinnkolonner. Cellelysat ble deretter utarbeidet og pre-ryddet med kontroll agarose harpiks. Deretter ble cellelysatet ko-immunopresipitert og eluert. Til slutt ble prøvene målt ved Western blotting-analyse.
Chromatin immunoprecipitation (chip) assay
ChIP analysen ble utført med Immunpresipitasjon analysen Kits (Millipore) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet ble cellene kryssbundet med 1% formaldehyd i 10 minutter ved 37 ° C. Cellene ble deretter resuspendert i 200 ul lyseringsbuffer og inkubert i 10 minutter på is. Lysatet ble skåret til lengder mellom 200 og 1000 basepar ved sonikering. Supernatanten ble pre-erte med en laksesperm DNA /Protein A Agarose-50% suspensjon. Det gjenvunne Supernatanten ble inkubert med Suz-12 immunoutfelling antistoff (Abcam), Histone H3 trimetyl-lysin 27 (H3-trimetyl-K27) immunoutfelling antistoff (Millipore), acetyl-Histone H3 (Lys9) (Millipore), eller et isotype kontroll IgG over natten ved 4 ° C med rotasjon. Deretter ble det antistoff /DNA-kompleks oppsamlet under anvendelse av laksesperm DNA /Protein A Agarose Slurry i en time ved 4 ° C med rotasjon. Komplekset ble eluert med elueringsbuffer. Deretter ble de tverrbindinger reversert med 5 M NaCl oppvarming ved 65 ° C i 4 timer. DNA-prøvene ble deretter renset og målt ved QRT-PCR. Primerne ble oppført i tabell S4.
Xenotransplantat transplantasjon
BALB /c atymiske nakne mus (Mann, SPF, 4-6 uker) ble gitt av Institutt for forsøket dyr sentrum av vårt sykehus . Og in-vivo studien ble etisk godkjent og utført i henhold til institusjonelle retningslinjer. For å utføre tumorigenicity i nakne mus, cscs fra SPC-A1 /DTX celler stabilt transfektert med MIR-200b, MIR-NC, sh-kontroll eller SH-HDAC1 # 2 vektorer ble subkutant injisert i høyre flanke av nakne mus. Svulster ble høstet mens de var følbar. For å undersøke effekten av MIR-200b uttrykk eller HDAC1 undertrykkelse på
in vivo
regulering av LAD celler, 3,0 × 10
6 H1299 /DTX celler stabilt transfektert med sh-kontroll, sh-HDAC1, speil NC eller MIR-200b vektorer, ble subkutant transplantert inn i den høyre side av den bakre flanke av nakne mus. Tumorvolumene ble målt som tidligere beskrevet [19]. Mens den gjennomsnittlige tumor dimensjon nådd omtrent 50 mm
3, en konsentrasjon på 1,0 mg /kg docetaxel (DTX), en dose annenhver dag, med tre doser totalt, ble administrert ved intraperitoneal injeksjon [19]. Etter 5 uker ble alle musene avlivet, og tumorvev ble brukt for senere studier.
Statistisk analyse
All statistisk analyse ble utført SPSS program versjon 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL , USA). Data er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet, og feilstolper er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. De gjennomsnittlige verdier av to grupper ble sammenlignet ved Student «s
t
test. Forskjeller mellom flere grupper ble analysert ved en-veis ANOVA-analyse. Alle
P
verdier 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
CD133
+ /CD326
+ celler utviser egenskaper cscs
for bedre å forstå de underliggende mekanismene ansvarlig for chemoresistance i LAD, CD133
+ /CD326
+ celler ble sortert fra docetaxel-resistente LAD celler ved CD133 og CD326 mikroperler. Renheten av CD133
+ /CD326
+ celler sortert fra SPC-A1 /DTX og H1299 /DTX var 93,13% ± 4,06% og 92,74% ± 3,12%, henholdsvis, og CD133
+ /CD326
+ celler kan differensiere til docetaxel-resistente LAD celler mens under differensiering tilstand (figur 1A
1, A
2 og A
3). Deretter fant vi ut om CD133
+ /CD326
+ celler vises egenskapene cscs. Først analyserte vi mammosphere forming evne CD133
+ /CD326
+ celler, og dataene viste at antall mammosphere i CD133
+ /CD326
+ celler var betydelig mer enn det i de tilsvarende docetaxel-resistente LAD-celler (figur 1B). Også CD133
+ /CD326
+ celler uttrykte høyere uttrykk nivåer av stamcellemarkører (for eksempel Sox-2, oktober-4, Suz-12, og BMI-en) enn den tilsvarende docetaxel-resistente LAD -celler (figur 1C, 1D
1 og D
2). For det andre, analyserte vi tumorigent kapasiteten på CD133
+ /CD326
+ celler, og deretter om 1,000~100,000 CD133
+ /CD326
+ celler eller de tilsvarende docetaxel-resistente LAD celler subkutant inokulert i nakne mus. 1000 CD133
+ /CD326
+ celler var tilstrekkelig til å danne tumorer i alle de nakne mus, er imidlertid opp til 1,0 x 10
5 docetaxel-resistente LAD-celler var ikke i stand til med hell å danne tumorer i hver naken mus, noe som indikerte at CD133
+ /CD326
+ celler besatt høyere evne tumorigenitet enn foreldre docetaxel-resistente LAD celler (figur 1E). Derfor CD133
+ /CD326
+ undergruppe celler vises egenskapene cscs.
(A
1, A
2, A
3) Prosent av CD133
+ /CD326
+ cscs som analyseres med flowcytometri ved den angitte tiden etter dyrke CD133
+ /CD326
+ cscs (kjøpt opp av sortering SPC-A1 /DTX og H1299 /DTX celler, henholdsvis) henhold differensiering forhold. (B) Mammosphere dannende evne av de angitte celler (1000 celler) etter 7 dager under CSC-dyrke betingelser. (C) QRT-PCR-påvisning av relative mRNA-nivåer av CSC-relaterte markører i de angitte celler. Data ble beregnet ved 2
– △△ Ct-metoden ved hjelp av GAPDH RNA som referanse genet. Ekspresjonsnivået ble målt i forhold til folden endring av foreldrecellene gruppene som ble definert som 1,0. (D
1, D
2) Protein nivåer av CSC-relaterte markører i de angitte celler. GAPDH ble anvendt som en intern kontroll. (E) Tumor forekomst i nakne mus som ble injisert subkutant med de angitte celler. Resultatene ble presentert som gjennomsnitt ± SD av minst tre uavhengige eksperimenter. *
p
0,05, **
p
. 0,01
MiR-200b hemmer cscs dannelse og reverserer chemoresistance av cscs
Tidligere har vi vist at oppregulering av MIR-200b kan reversere chemoresistance av docetaxel-resistente LAD celler ved å hemme cellevekst, indusere cellesyklus arrest og styrke apoptose. Deretter utførte vi QRT-PCR-analyse for å påvise uttrykk av MIR-200B i cscs og tilsvarende docetaxel-resistente LAD celler, og viste at det relative nivået av MIR-200b i cscs var lavere enn i docetaxel-resistente LAD celler (Figur 2A). For ytterligere å undersøke om har MIR-200b effekt på cscs i docetaxel-resistente LAD celler, pcDNA /MIR-200B (eller pcDNA /MIR-NC) eller anti-MIR-200B (eller anti-MIR-NC) var stabilt eller midlertidig transfektert inn i SPC-A1 /DTX eller H1299 /DTX celler. Som vist i figur 2B, ble den relative ekspresjonsnivået av MIR-200b signifikant oppregulert i docetaxel-resistente LAD-celler stabilt transfektert med pcDNA /mir-200b, mens dens relative ekspresjonsnivået ble betydelig nedregulert i de celler forbigående transfektert med anti-speil 200b. Flowcytometri analyse viste at oppregulering av MIR-200b betydelig redusert andelen av CD133
+ /CD326
+ cscs vekst i docetaxel-resistente LAD celler og nedregulering av MIR-200b hadde motsatt effekt (figur 2C). Den lignende fenomen ble observert i mammosphere dannende evne assay samt (figur 2D). I mellomtiden, restaurering av MIR-200B kan føre til redusert IC
50 Verdien av DTX i cscs fra SPC-A1 /DTX eller H1299 /DTX celler (figur 2E). Resultatene indikerte at Mir-200B kan spille en avgjørende rolle i cscs vekst og chemoresistance av menneskelig LAD.
(A) QRT-PCR påvisning av MIR-200b i cscs. Data ble normalisert til U6 rRNA og bestemt i forhold til tilsvarende foreldrecellegrupper. (B) QRT-PCR deteksjon av relativ mRNA nivå av MIR-200b i docetaxel-resistente LAD celler etter transfeksjon med de angitte vektorer. Data ble normalisert til U6 rRNA og bestemt i forhold til tilsvarende kontrollgruppene. (C) Prosent av CD133
+ /CD326
+ cscs som analyseres med flowcytometri etter transfeksjon med de angitte vektorer. (D) Mammosphere dannende evne av de angitte celler (1000 celler) etter transfeksjon av de angitte vektorer. (E) Cellenes levedyktighet ble målt ved celletelling leder-8 (CCK-8) assay. Resultatene ble presentert som gjennomsnitt ± SD av minst tre uavhengige eksperimenter. *
p
0,05, **
p
. 0,01
Suz-12 er oppregulert i cscs og identifisert som en funksjonell mål av speil 200b
Suz-12 er en komponent av polycomb undertrykkende komplekset 2 (PRC2) og er essensiell for PRC2-mediert genet Slå ved å generere trimethylation på lysin 27 rest av histon H3 (H3K27Me3). I cscs generert fra transform bryst epitelceller (MCF-10A), har Suz-12 er bekreftet som et mål gen av MIR-200b. Men om MIR-200b kan målrette Suz-12 i cscs avledet fra docetaxel-resistente LAD cellene er uklart. QRT-PCR og Western blotting analyser indikerte at Suz-12 var oppregulert i cscs sammenlignet med tilsvarende docetaxel-resistente LAD celler på både transkripsjons og translasjonsforskning nivåer (figur 3A og B). Deretter analyserte vi effektene av MIR-200b på uttrykk for Suz-12 i cscs. Oppregulering av MIR-200B førte til redusert uttrykk for Suz-12 i cscs av SPC-A1 /DTX og H1299 /DTX celler, mens tie av MIR-200B førte til økt uttrykk av Suz-12 i de cscs (Figur 3C og D). For å oppnå ytterligere direkte bevis for at Suz-12 var et mål av MIR-200b, undersøkte vi bindingssetet av MIR-200b i 3′-UTR sekvens av Suz-12 mRNA. Vi bygget en luciferase reporter (pLUC /Suz-12 /3′-UTR-wt) der nukleotider i Suz-12-3′-UTR komplementære til Mir-200b ble satt inn i pLUC vektor, og vi har også generert en mutant reporter (pLUC /Suz-12 /3′-UTR-mut), der de første seks nukleotider i Mir-200b frø region komplementære områder ble mutert. Luciferaseaktiviteten i pLUC /Suz-12 /3′-UTR-wt-transfekterte celler ko-transfektert med pcDNA /mir-200b ble signifikant redusert enn at de pLUC /Suz-12 /3′-UTR-mut-transfekterte celler ko-transfektert med pcDNA /MIR-200b (Figur 3E). Disse resultatene antydet at Suz-12 kan være et direkte mål for MIR-200b i cscs avledet fra docetaxel-resistente LAD celler.
(A) QRT-PCR deteksjon av relativ Suz-12 mRNA uttrykk i indikerte cellene. Data ble normalisert til GAPDH RNA og bestemt i forhold til tilsvarende foreldre-cellegrupper. (B) Protein nivåene av Suz-12 som målt ved Western blotting i de angitte celler. GAPDH ble anvendt som en intern kontroll. (C) QRT-PCR-påvisning av Suz-12-mRNA-ekspresjon i cscs etter transfeksjon av de angitte vektorer. (D) Western blotting påvisning av Suz-12 proteinet uttrykket i cscs etter transfeksjon med de angitte vektorer. GAPDH ble anvendt som en intern kontroll. (E) Luciferase aktivitet av cscs (SPC-A1 /DTX) ko-transfektert med pcDNA /MIR-200B (eller pcDNA /MIR-NC) eller pLUC /Suz-12 /3′-UTR-vekt (eller pLUC /Suz -12 /3′-UTR-mut). Data var i gjennomsnitt ± SD av minst tre uavhengige eksperimenter. *
p
0,05, **
p
. 0,01
For å kunne fastslå om Suz-12 var involvert i reguleringen av cscs, Suz- 12-shRNAs (Suz-12-shRNA # 1, # 2 og # 3) ble konstruert, og transfektert inn i docetaksel bestandig LAD-celler, og den inhiberende effekt av Suz-12-shRNA3 var størst (figur 4A). Stanse av Suz-12 kan redusere mammosphere dannende evne SPC-A1 /DTX og H1299 /DTX celler (figur 4B). Også andelen av CD133
+ /CD326
+ cscs vekst i Suz-12-shRNA3-transfektert SPC-A1 /DTX eller H1299 /DTX celler var betydelig redusert enn i kontrollgruppen-shRNA-transfekterte celler ( Figur 4C). Så, vi videre analysert virkningene av Suz-12 uttrykk på tumorigenitet og kjemosensitivitet av cscs. Først må vi har oppdaget protein ekspresjon av Suz-12 i cscs fra Suz-12-shRNA3 eller kontroll-shRNA-transfekterte SPC-A1 /DTX og H1299 /DTX-celler, og viser at ekspresjonsnivået av Suz-12 protein i Suz- 12-shRNA3-transfekterte celler var betydelig lavere enn i kontroll-shRNA-transfekterte celler (Figur 4D). Funksjonell analyse indikerte at stanse av Suz-12 kan hemme
in vitro
vekst og
in vivo
tumorigenicity av cscs (figur 4E og F). Videre stanse av Suz-12 kan betydelig redusere IC
50 Verdien av DTX i cscs (figur 4G). Dermed kunne stanse av Suz-12 etterligne effekten av MIR-200b på cscs vekst og chemoresistance, noe som tyder på at Suz-12 ble engasjert i reguleringen av cscs indusert av MIR-200b.
(A) Proteinet nivået av Suz-12 i docetaxel-resistente LAD-celler etter transfeksjon med de indikerte sh-RNA-vektorer (sh-RNA-Suz12 # 1, sh-RNA-Suz12 # 2, og sh-RNA-Suz12 # 3). (B) Mammosphere forming evne docetaxel-resistente LAD celler (1000 celler) etter transfeksjon av de angitte vektorer. (C) Strømningscytometri-analyse av prosenten av CD133
+ /CD326
+ cscs som analysert ved i docetaxel-resistente LAD-celler etter transfeksjon med de angitte vektorer. (D) Proteininnholdet av Suz-12 i cscs etter transfeksjon med det sh-RNA-kontroll eller sh-RNA-Suz12 # 3 vektorer. (E) CCK-8 analyse av cellelevedyktigheten av de cscs transfektert med de angitte vektorer på den angitte tid. (F) Effekt av Suz-12 hemming på
in vivo
tumorigenicity av cscs fra SPC-A1 /DTX celler. (G) Effekt av Suz-12 hemming på chemoresistance av cscs. Cellelevedyktigheten ble målt ved hjelp av CCK-8-analyse. GAPDH ble anvendt som en intern kontroll. Resultatene ble presentert som gjennomsnitt ± SD av minst tre uavhengige eksperimenter. *
p
0,05, **
p
. 0,01
For ytterligere å bekrefte at Suz-12 var et funksjonelt mål på MIR-200b i regulering av cscs, pcDNA /Suz-12 eller pcDNA /kontroll ble transfektert inn cscs (SPC-A1 /DTX) stabilt transfektert med pcDNA /MIR-200b eller pcDNA /MIR-NC. 48t etter transfeksjon, ble Western Botting analyse utføres for å påvise uttrykk av Suz-12 protein, og vi viste at pcDNA /Suz-12 kan reversere redusert uttrykk for Suz-12 i cscs fra SPC-A1 /DTX celler indusert av MIR -200b oppregulering (figur 5A). I mellomtiden, overekspresjon av Suz-12 kan ikke bare snu redusert andelen CD133
+ /CD326
+ cscs vekst og mammosphere forming evne, men også reversere redusert vekstevne og IC
50 Verdien av docetaxel i de cscs fra SPC-A1 /DTX celler indusert av MIR-200b oppregulering (figur 5B-E). Dermed kunne overekspresjon av Suz-12 reversere effektene av MIR-200b oppregulering på regulering av cscs, noe som tyder på at Suz-12 var et funksjonelt mål på MIR-200b i reguleringen av cscs fra docetaxel-resistente LAD celler.
(A) protein~~POS=TRUNC av Suz-12 i cscs fra SPC-A1 /DTX-celler transfektert med de angitte vektorer. GAPDH ble anvendt som en intern kontroll. (B) Flowcytometri analyse av andelen CD133
+ /CD326
+ cscs i SPC-A1 /DTX celler etter transfeksjon av de angitte vektorer. (C) Mammosphere dannende evne av SPC-A1 /DTX-celler (1000 celler) etter transfeksjon av de angitte vektorer. (D) CCK-8 analyse av cellelevedyktigheten til cscs (SPC-A1 /DTX) transfektert med de angitte vektorer på den angitte tid. (E) Suz-12 oppregulering partianlly reddet effektene av tvangs MIR-200b uttrykk på rygging chemoresistance. Cellelevedyktigheten ble målt ved CCK8 assay. GAPDH ble anvendt som en intern kontroll. GAPDH ble anvendt som en intern kontroll. GAPDH ble anvendt som en intern kontroll. GAPDH ble anvendt som en intern kontroll. GAPDH ble anvendt som en intern kontroll.
