Abstract
cyclin-avhengig kinase 5 (cdk5) er en cytoplasma serin /treonin kinase. Knockdown av cdk5 forbedrer paclitaxel følsomhet i menneske eggstokkreft celler. Denne studien undersøker mekanismer som cdk5 regulerer paclitaxel følsomhet i menneske eggstokkreft. Flere ovarie cancer-cellelinjer og xenotransplantater ble behandlet med cdk5 liten interfererende RNA (siRNA) med eller uten paclitaxel for å undersøke effekten på kreftcellelevedyktigheten, cellesyklus-stans og tumorvekst. Cdk5 protein ble målt ved immunhistokjemisk farging av en eggstokkreft vev microarray å korrelere cdk5 uttrykk med pasientene, og overlevelse. Knockdown av cdk5 med sirnas hemmer aktiveringen av AKT som i betydelig grad korrelerer med redusert cellevekst og forbedret følsomhet paclitaxel i ovarie cancer-cellelinjer. I tillegg cdk5 knockdown alene og i kombinasjon med paklitaxel indusert G1 cellesyklus-stans og caspase 3 avhengig apoptotisk celledød assosiert med post-translasjonell oppregulering og nukleær translokasjon av TP53 og p27
Kip1 samt TP53-avhengige transkripsjons-induksjon av p21
Cip1 i villtype TP53 kreftceller. Behandling av HEYA8 og A2780 villtype TP53 xenografter i nu /nu mus med cdk5 siRNA og paclitaxel produsert betydelig større veksthemming enn hver behandling alene. Økt uttrykk for cdk5 i menneskelig eggstokkreft korrelerer omvendt med total overlevelse. Cdk5 modulerer paclitaxel følsomhet ved å regulere AKT aktivering, cellesyklus og caspase-avhengig apoptose. Cdk5 hemming kan forsterke paclitaxel aktivitet i humane eggstokkreft celler
Citation. Zhang S, Lu Z, Mao W, Ahmed AA, Yang H, Zhou J et al. (2015) cdk5 Regulerer Paclitaxel følsomhet i eggstokkreft celler ved Moduler AKT Aktivering, p21Cip1- og p27Kip1-mediert G1 Cell syklus og apoptose. PLoS ONE 10 (7): e0131833. doi: 10,1371 /journal.pone.0131833
Redaktør: Peiwen Fei, University of Hawaii Cancer Center, UNITED STATES
mottatt: 02.03.2015; Godkjent: 06.06.2015; Publisert: 06.07.2015
Copyright: © 2015 Zhang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Anne og Henry Zarrow Foundation og hyggelige gaver fra Stuart og Gayle Lynn Zarrow, samt tilskudd fra Cancer Prevention and Research Institute Texas RP110-595, Utsmykkingsfondet for Cancer Research, MD Anderson SPORE i Eggstokkreft NCI P50 CA83639, U54 CA151668, UH2 TR000943-01, den RGK Foundation, og MD Anderson NCI CCSG P30 CA16672 (flowcytometrisystemer og Forskning Animal Støtte fasiliteter). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i USA i 2014 var det om lag 21 980 nye tilfeller av eggstokkreft og 14,270 dødsfall fra denne sykdommen, i samsvar med en kur rate på bare 30% for alle trinn. Bedre resultater kan oppnås dersom følsomhet for primær kjemoterapi ble forbedret. To hovedtyper av ovarialcancer er identifisert. Type I «low grade» kreft vokser sakte og er ofte oppdages i tidlig stadium. På et molekylært nivå, type I kreftformer har villtype
TP53 Hotell og drives av aktive mutasjoner i Ras og forskjellige medlemmer av PI3K signalveien. Type II «high end» kreft vokse raskere og er ofte diagnostisert i avansert stadium. Høy grad av eggstokkreft utviser mutert
TP53
samt hyppige abnormiteter i homolog rekombinasjon reparasjon av DNA og er drevet av en rekke DNA kopiantall unormalt, men bare svært sjelden med aktiverende mutasjoner. Begge typer eggstokkreft behandles med cytoreduktiv kirurgi og en kombinasjon av medikamenter som omfatter karboplatina og paclitaxel. For å forsterke effekten av paclitaxel for behandling av ovarialcancer, utførte vi en kinome siRNA-bibliotek skjerm i nærvær og fravær av paclitaxel for å identifisere kinaser som regulerer paclitaxel følsomhet. Knockdown av cdk5 forbedret paclitaxel følsomhet [1]. Cdk5 er nødvendig for riktig nevronal migrasjon, synapse formasjon, og overlevelse. Hyperaktive av cdk5 er forbundet med alvorlige nevrodegenerative lidelser, inkludert Alzheimers sykdom [2-5]. Nylig, feilregulering av cdk5 har vært knyttet til malignitet, inkludert kreft i prostata, bukspyttkjertelen, skjoldbruskkjertelen, lunge, cervix, myelom, og bryst [6-13].
I denne studien, har vi funnet at cdk5 knockdown hemmer fosforylering av AKT, og induserer G1 cellesyklus arrest, apoptose og forbedret følsomhet for paclitaxel i eggstokkreft cellelinjer. I tillegg induksjon av G1 arrest og apoptose ved cdk5 knockdown relatert til induksjon av TP53, p21
Cip1 og p27
Kip1 protein. Cdk5 hemming gir en ny strategi for å håndtere eggstokkreft med og uten villtype TP53 funksjon.
Materialer og metoder
Cellelinjer og kulturer
HEY, A2780, CAOV3, ES-2 og SKOV3 humane ovarie cancer-cellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). EF021, EF027, OAW42, OC316 og IGROV1 ble vennlig levert av Dr. Gordon Mills «laboratorium [14-17] og alle cellelinjene ble bekreftet med STR DNA fingerprinting som ble gjort av MDACC Preget cellelinje kjerne (støttet av NCI # CA016672). SKOV3 celler var kultur med Macoy sin 5A; OC316, EFO27, EFO21, IGROV1, ES-2, A2780 og Hei celler var kultur med RPMI 1640; CAOV3 og OAW42-celler ble dyrket med DMEM. Alle medier ble innhentet fra Media Forberedelse Kjerne Facility ved M. D. Anderson Cancer Center. SW626-celler ble dyrket med Leibovitz L-15 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Alle cellelinjer ble testet for mycoplasma med en MycoSensor PCR-analysesett fra Stratagene (La Jolla, California) og funnet å være fri for forurensning.
siRNA og plasmid transfeksjon
Alle cellelinjene var transfektert med en negativ kontroll siRNA eller en bestemt siRNA hjelp DharmaFECT 4 reagent (GE Dharmacon, Lafayette, CO). En blanding av siRNA (15 nM sluttkonsentrasjon) og DharmaFECT 4-reagens (12,5 nM sluttkonsentrasjon) ble inkubert i 20 minat rom temperert før de ble påført til cellene.
Cell vekstmålinger
A krystallfiolett analyse ble brukt for å bedømme forankringsavhengige cellevekst som beskrevet tidligere. I korthet HEI (6 x 10
3) eller A2780 (8 x 10
3) celler ble sådd ut i triplikat i 96-brønners cellekulturplater og enten omvendt transfektert i 24 timer med en negativ kontroll siRNA eller en cdk5 siRNA og inkubert i ytterligere 48 timer med eller uten paclitaxel (3 nM). Cellene ble vasket med PBS, fiksert i 1% glutaraldehyd, og farget med 0,5% krystallfiolett (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) oppløst i metanol. Det fargestoff som farget cellene på platene ble eluert med Sorenson buffer (0,9% natriumcitrat, 0,02 N HCl, og 45% etanol) og direkte målt ved bruk av en Vmax mikroplateleser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) ved en bølgelengde på 570 nm.
klonogene analyser
A klonogene analysen ble utført som tidligere beskrevet [18]. Kort sagt ble HEY eller A2780-celler sådd ut på 500 og 800 celler per brønn i triplikat etter transfektert i 24 timer med en negativ kontroll siRNA eller et cdk5 siRNA i 14 dager. Celler ble deretter fiksert i 1% glutaraldehyd og farget med 0,5% krystallfiolett i metanol. Kolonier med mer enn 30 celler ble tellet.
Strømningscytometri
Prosentandelen av celler i sub-G1-fasen av cellesyklusen (dvs. apoptotiske celler) ble bestemt basert på relative DNA-konsentrasjon målt med en strømningscytometri, som beskrevet tidligere [1]. Kort sagt ble HEY-celler transfektert i 24 timer med en negativ kontroll siRNA eller en cdk5 siRNA og behandlet med eller uten paclitaxel (3 nM) i 24 timer og ble deretter løsnet ved inkubering med 0,05% trypsin-EDTA, ble vasket med PBS, og faste over natten i 70% etanol. Fikserte celler ble deretter sentrifugert, vasket, resuspendert i PBS inneholdende RNase A og propidiumjodid (50 ug /ml hver) og inkubert i 20 minutter ved 37 ° C med forsiktig risting. Fargede celler ble filtrert gjennom nylon mesh (41-mikrometer porestørrelse) og analysert på en Coulter flowcytometer XL-MCL (Coulter Corporation, Miami, FL). Prosentene av sub-G1 befolkningen og cellesyklusfordeling ble fastsatt ved bruk av multicycle program (Phoenix Flow Systems, San Diego, California).
QRT-PCR-analyse
Celler ble høstet og total RNA ble ekstrahert fra cellene ved anvendelse av RNA lett kit (Qiagen, Hilden Strasse 1, 40724Germany) i henhold til produsentens instruksjoner. RNA renhet ble vurdert ved å måle absorpsjonen ved 260 nm (A260) og ved 280 nm (A280). Prøver som hadde A260 /A280-forhold på 1,9-2,1 ble ansett akseptabelt. Integriteten av RNA ble bestemt ved etidiumbromidfarging av 18S og 28S RNA i geler etter elektroforese. RNA-konsentrasjonen ble bestemt fra absorbans ved 260 nm (A260). QRT-PCR ble utført ved bruk av et prisme 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems Incorporated, Foster City, CA) og SYBR grønn Universal PCR Master Mix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), som beskrevet tidligere [1]. Total RNA isolert fra Hey-celler transfektert med individuelle sirnas ble reverstranskribert inn i cDNA ved anvendelse av et cDNA-sett (Invitrogen, Carlsbad, CA), og cDNA ble underkastet QRT-PCR for å vurdere mRNA-nivåer av p21Cip, TP53, p27Kip1 BCL2 og cdk5. TP53 (VHPS-9498) og p21Cip (VHPS-1770) primere ble kjøpt fra Real Time Grunning (Elkins, PA). P27Kip1 primere 5′-GAGTGGCAAGAGGTGGAGAA-3 «(F) og 5′-GCGTGTCCTCAGAGTTAGCC-3′ (R), BCL2 primere 5»-GGAGGATTGTGGCCTTCTTT-3 «(F) og 5′-GCCGTACAGTTCCACAAAGG-3′ (R) og cdk5 primere var 5»-ACTCCTACATGGGCAACGAG-3 «(F) og 5′-CGTTCTTCAGGTCGGAGAAG-3» (R). PCR ble utført i et totalvolum på 30 ul, som omfattet 15 ul av 2X universell PCR masterblanding, 3 ul av 10 x SYBR Green, 20 pM av hver forover og revers primer og 50 ng av hver cDNA-prøve. Amplifikasjoner ble utført i triplikat i 96-brønners mikrotiterplater. Termisk sykling var som følger: 95 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 10 sekunder og 59 ° C i 40 sekunder. En smelting kurve analyse ble brukt for alle primersett for å utelukke uspesifikke amplifikasjon og besto av 95 ° C i 15 sekunder, 59 ° C i 15 sekunder, etterfulgt av å øke temperaturen med 1 ° C i 2 sekunder til 95 ° C, og deretter 95 ° C i 15 sekunder.
Immunoblot og immunopresipitering
Celler ble ekstrahert med lyseringsbuffer (50 mM HEPES, 5 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% Triton X-100 pH 4) inneholdende fosfatase og proteaseinhibitorer. Proteinkonsentrasjonen av lysatene ble bestemt ved en BCA-proteinanalysesett (Pierce, Rockford, IL). Like mengder av totalt protein, ble kokt i prøvebuffer og separert ved SDS-PAGE og overført på en polyvinylidendifluorid (PVDF) membran (Millipore, Bedford, MA). Membranene ble inkubert med spesifikke antistoffer mot p-AKT (Cell Signaling, Danvers, MA), p53 (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA), p27Kip1 (BD Transduksjon laboratorium, Franklin Lakes, New Jersey), p21Cip (Santa Cruz Biotech , Santa Cruz, CA), caspase 3 (cellesignalisering, Danvers, MA). Aktin eller GAPDH (Cell Signaling, Danvers, MA) ble anvendt som en kontroll lasting i forsøkene med cellulære proteiner. HEY-celler (2 x 10
6) ble transfektert med enten siRNA i 72 timer og deretter lysert i RIPA-buffer (20 mM Tris-HCl [pH 7,5], 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP-40, 1% natriumdeoksycholat, 2,5 mM natriumpyrofosfat, 1 mM b-glyserofosfat, og 1 mM natrium ortovanadat). I korthet, ble porsjoner av hel-cellelysatene (~ 500 ug) ble inkubert over natten ved 4 ° C med muse anti-cdk5 antistoff (~ 1 mg) (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA). Museserum ble brukt en negativ immunoprecipitation kontroll. Antistoff-antigen-kompleksene ble samlet opp ved bruk av protein A-agarose perler (GE Healthcare, Piscataway, New Jersey) og vasket tre ganger vasking med RIPA-buffer.
subcellulære fraksjone
HEI-celler ble transfektert med negativ kontroll og cdk5 siRNA og deretter fraksjonert med bruk av en kjernefysisk og Cytoplasmatiske Extraction Kit (Promega, Madison, WI) i henhold til produsentens instruksjoner. Like mengder av protein fra de cytoplasmiske og nukleære ekstrakter (10 ug) ble underkastet immunoblotanalyse med antistoffer mot p21Cip1 (1: 300), p27Kip1 (1: 1500), PARP (1: 1000 fortynning, BD, Franklin Lakes, New Jersey ), og en-tubulin (1: 1000 fortynning, Sigma, St. Louis, MO)
kinasebestemmelsene
in vitro kinase analysen ble utført ved EnzyChrom kinase assay Kit (MEDIBENA Life. Science Diagnostiske Solutions, Wien, Østerrike) ifølge produserer «instruksjon. Kort, sette opp 75 mL reaksjonsblanding som inneholder rekombinant cdk5 /p25 (Invitrogen) som kinase, ATP og rekombinant p53 (Millipore, Billerica, MA), p27Kip1 (Abcam, Cambridge, MA), p21Cip1 (Abcam, Cambridge, MA), Histione H1 (Santa Cruz, Santa Cruz, California) og ARHI NTD (OriGene, Rockville, MD) som substrat i prøvebuffer, henholdsvis. Inkuber ved romtemperatur i 20 min. Delmengde 20 mL blanding inn i 3 separate brønner på 96 brønners plate, tilsett 40 mL arbeider reagens til hver analysebrønn. Inkuber ved romtemperatur i 10 min og lese fluorescensintensitet (eksitasjon = 530nm og emisjon = 590nm avleses). Beregn kinaseaktivitet som formelen nedenfor.
δFluorescence = (fluorescens-intensitet av prøvebrønnen-blank brønn) og helning er helningen av ADP standardkurven.
Luciferase promotor assays
luciferase-aktivitetsanalyser ble utført som følger. Celler ble sådd ut i 6-brønns plater, kotransfektert med siRNA eller dens negative kontroll og Renilla luciferase vektor (PRL-TK) tjente som en intern kontroll. Etter transfeksjon i 16 timer, ble cellene delt i 12-brønners plater, høstet etter 24 timer og Firefly og Renilla luciferase-aktivitet ble målt sekvensielt ved bruk av dual luciferase-assay kit (Promega, Madison, WI) og et luminometer (BD Parmingene, Sparks, MD). WWP-Luc 9p21 /WAF1 promoter ble kjøpt fra Addgene (16451, Cambridge, MA). Resultatene ble uttrykt som relativ luciferaseaktivitet etter normalisering med Renilla luciferase-aktivitet. Relative luminescens enheter (RLU) ble normalisert med proteinkonsentrasjonen i hver prøve, og endelige verdier av RLU ble uttrykt som RLU per mikro-gram protein per milliliter.
apoptose blokkering med caspase Inhibiton
HEY-celler ble behandlet i 2 timer med 20 uM av et pan-kaspaseinhibitor (Z-VAD-FMK, Promega, Madison, WI), eller en negativ kontroll (Z-FA-FMK, Promega, Madison, WI), etter transfekterte med en negativ kontroll siRNA eller et cdk5 siRNA i 24 timer. Cellene ble deretter fiksert i 70% etanol, farget med propidiumjodid, og underkastet analyse ved strømningscytometri. Den sub-G1 cellefraksjon er ansett som den apoptotisk cellepopulasjon.
Protein halveringstid assay
HEI-celler ble transfektert med en negativ kontroll siRNA eller et cdk5 siRNA i 24 timer, vasket, og behandlet med 5 pg /ml cykloheksimid (CHX) i de angitte tidsrom. Cellene ble høstet og bruke til preparerte hel-cellelysater, som ble underkastet immunoblotanalyse med antistoffer mot p27Kip1 og glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH).
Menneskelige eggstokkreft xenotransplantater i nakne mus
Forsøk med Nu /Nu mus ble gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC ID: 00001052-RN00) (MD Anderson Cancer Center). 60 hunn nakne mus ble injisert intraperitonealt (i.p.) med 1×106 A2780 celler. På dag 7 etter injeksjon ble musene randomisert til følgende behandlingsgrupper (n = 10 mus per gruppe for hver cellelinje): 1) i.p. injeksjon med PBS (to ganger per uke, 100 ul /mus), 2) i.p. injeksjon med paclitaxel (en gang per uke, 30 pg /mus), 3) i.p. injeksjon med kontroll siRNA-DOPC (to ganger per uke), 4) i.p. injeksjon av cdk5 siRNA-DOPC (to ganger per uke, 5 ug /mus), 5) i.p. injeksjon med en kombinasjon av styre siRNA-DOPC (to ganger per uke) pluss paklitaxel (en gang per uke, 30 ug /mus), og 6) i.p. injeksjon med en kombinasjon av cdk5 siRNA-DOPC (to ganger per uke, 5 ug /mus) pluss paklitaxel (en gang per uke, 30 ug /mus). Alle mus ble behandlet i 3 uker og avlivet ved CO2 og cervikal dislokasjon ved slutten av studiet. Alle tumorer ble oppsamlet umiddelbart etter døden og veiet.
Immunhistokjemi
A formalinfiksert, parafin innleiret vev microarray (TMA) prøver av primære eggstokk-kreft (215 pasientprøver) ble erholdt fra MD Anderson Pathology avdeling. Protokollene for håndtering parafininnstøpte ovarialcancer prøver og analysere pasientdata ble godkjent av de etiske komiteer i MDACC Institutional Review Boards. Prøver og tilhørende klinisk informasjon ble samlet etter skriftlig informert samtykke, som ble signert av hver registrerte pasient under de etiske retningslinjer og godkjenning av MDACC Institutional Review Boards. For denne studien, ble vevet microarray konstruksjon utført som tidligere beskrevet [19]. Tissue microarray lysbilder ble utsatt for immunhistokjemisk farging i henhold til produsentens protokoll (Biocare Medical, Concord, CA, USA). Seks micron seksjoner ble kuttet fra hver TMA. Inkubering ved 60 ° C i 20 minutter ble brukt for å gjenopprette antigenisk reaktivitet etterfulgt av to 20 min inkubasjoner i xylen. Etter at snittene ble rehydrert, ble antigen gjenfinning utført i 6,5 mM natriumcitratbuffer (pH 6,0) i 10 minutter. 3% bovint serumalbumin i 0,1 M Tris-bufret saltløsning ble anvendt for blokkering. Seksjoner ble inkubert ved 4 ° C over natten med anti-cdk5-antistoff (1: 100, Sigma HPA018977). Anti-kanin immunoglobulin sekundære antistoffer ble deretter påført i 1 time ved romtemperatur etterfulgt av vasking 3 ganger i PBS i 10 min. DAB chromagen ble tilsatt i 1 min per lysbilde, fulgt av ytterligere 3 vaskinger i PBS i 10 min og deretter hematoxylin farging ble utført i 1 min per lysbilde, fulgt av ytterligere 3 vaskinger i PBS i 10 min. To gynekologiske patologer (J.L., R.M.) uavhengig analyserte immuno-histochemically fargede objektglass for cdk5 uttrykk.
Statistisk analyse
Data er representert som betyr +/- standardavvik med mindre annet er spesifisert. Statistisk signifikans ble bestemt ved uavhengige prøve Mann-Whitney U-test. Overlevelsesanalyse ble utført av Kaplan-Meier metoden. Den minimale nivået av betydning var P = 0,05.
Resultater
cdk5 knockdown hemmer cellevekst og øker paclitaxel følsomhet i eggstokkreft celler
Mens knockdown av cdk5 med siRNA kan endre cellevekst og paclitaxel følsomhet i eggstokkreft cellelinjer med mutert TP53 (EFO21, EFO27, IGROV1, CAOV3, OAW42 og ES-2, SKOV3 og OC316) (fig 1A), ble de markerte effekter observert i to eggstokkreft cellelinjer med villtype TP53 (HEY og A2780) (fig 1A og 1B). Dempe cdk5 betydelig redusert IC50 av paclitaxel i Hei og A2780 celler (fig 1b). Tvunget uttrykk for cdk5 forbedret vekst og redusert følsomhet for paclitaxel i HEY celler (S1 Fig). CDK inhibitor roscovitine hemmet også cdk5 aktivitet og cellevekst i Hey celler som gjorde cdk5 siRNA i HEY og A2780 celler (S1 Fig). I tillegg til å hemme veksten i kortsiktige analyser, knockdown av cdk5 betydelig hemmet kolonidannelse og økt følsomhet for paclitaxel i HEY og A2780 celler (figur 1B og S2 figur).
(A) Kortsiktig cellevekst analysen. Hei og A2780-celler i 96-brønners plater ble revers transfektert med kontroll siRNA eller cdk5 siRNA (Dhamarcon) i 24 timer og behandlet med 5 nM paclitaxel (Pac) eller fortynningsmiddel (kontroll) i ytterligere 48 timer. En krystallfiolett-celle proliferasjonsanalyse ble anvendt for å måle veksten av celler. (B) klonogene og cellevekstmålinger. HEI og A2780-celler ble transfektert med kontroll siRNA eller cdk5 siRNA i 24 timer, og deretter ble cellene behandlet med fortynningsmiddel (kontroll) eller 3 nM paclitaxel (Pac) i 14 dager (klonogene assay) eller celler ble behandlet med flere konsentrasjoner av paklitaxel ( Pac) eller fortynningsmiddel (Control) for ytterligere 48 h (cellevekstmålinger). De IC50s av paclitaxel med eller uten cdk5 siRNA behandling i Hei og A2780 celler ble beregnet i GraphPad.
cdk5 knockdown hemmer aktiveringen av AKT
phosphatidyinositol-3-kinase (PI3K ) -Akt overlevelse kaskade er antatt å være assosiert med sensitivitet overfor anticancer legemidler. For å utforske den mekanismen som cdk5 stanse inhiberte eggstokkreft cellevekst og forbedret følsomhet paclitaxel, vi først undersøkt effekten av cdk5 knockdown på aktivering av AKT ved å påvise Ser473 fosforylering av AKT. Etter behandling med cdk5 siRNA eller kontroll siRNA, ble Western analyse utført. Dempe cdk5 signifikant hemmet aktivering av AKT i to villtype TP53 (figur 2) samt i fire av åtte mutant TP53 ovarie cancer-cellelinjer (Fig 2). sirnas hemming av AKT-aktivering i 6 eggstokkreft linjer korrelerte signifikant med redusert cellevekst og forbedret følsomhet paclitaxel (figurene 1A og 2).
Western-analyse for måling av inhibisjon av AKT-fosforylering (Ser473) ved anvendelse av spesifikke anti-p- AKT antistoff. HEY celler ble behandlet med kontroll siRNA eller cdk5 siRNA i 72 timer. Cellelysater ble utsatt for immunoblot analyse.
cdk5 knockdown øker apoptose og G1 cellesyklus arrest i nærvær og fravær av paclitaxel
For å utforske flere mekanismer som cdk5 stanse hemmer vill skriver TP53 eggstokkreft cellevekst og forbedret følsomhet paclitaxel, undersøkte vi effekten av cdk5 knockdown med eller uten paclitaxel-behandling på induksjon av apoptose og cellesyklusarrest i hei celler som er TP53 villtype. Etter behandling med cdk5 siRNA eller kontroll siRNA, flowcytometrisk analyse ble utført. Dempe cdk5 indusert G1 arrest og produsert apoptotisk celledød med en økt andel av cellene i sub-G1 (fig 3A og 3B). Cdk5 lyddemping også forbedret paclitaxel-indusert apoptose (figur 3B).
(A, B) knockdown av p53 redusert cdk5 knockdown-indusert apoptose (A) og G1 arrest (B). HEY-celler ble transfektert med omvendt kontroll siRNA eller cdk5 siRNA i 24 timer og behandlet med 5 nM paclitaxel (Pac) eller fortynningsmiddel (kontroll) i ytterligere 48 timer, og deretter cellesyklus analysert ved flow-cytometri. Data er middelverdier fra tre uavhengige forsøk. (C) cdk5 knockdown økt uttrykk av p21
Cip1, p53 og p27
Kip1. HEI-celler ble behandlet med kontroll siRNA eller cdk5 siRNA i 24 timer og deretter med paclitaxel (3 nM) eller fortynningsmiddel i 48 timer. Immunoblot analyse ble utført med antistoffer mot p21
Cip1, p53, og P27
Kip. (D) knockdown av p53-ekspresjon redusert cdk5 siRNA-indusert veksthemming og redusert forbedring av paclitaxel følsomhet. Celler ble ko-transfektert med cdk5 siRNA og p53 siRNA i 24 timer og behandlet med paclitaxel (Pac) eller fortynningsmiddel. Proliferasjon av celler ble målt med en krystallfiolett celleproliferasjonsanalyse. (E, F) knockdown av p53 redusert cdk5 knockdown-indusert apoptose (E) og G1 arrest (F). HEI celler ble behandlet som i (A) og cellesyklus analysert ved flow-cytometri. Data er middelverdier fra tre uavhengige forsøk. (G) Western analyse bekreftet økende av TP53 uttrykk ved å kneble cdk5. HEI-celler ble behandlet med kontroll siRNA eller cdk5 siRNA i 24 timer og deretter med paclitaxel (3 nM) eller fortynningsmiddel i 48 timer. Celler lysatene ble utsatt for immunoblot analyse med p53, cdk5 og aktin antistoff.
cdk5 knockdown induserer TP53 avhengig veksthemming, apoptose og G1 arrestere
For å teste effekten av cdk5 stanse på proteiner som regulerer cellesyklus og apoptose, utførte vi Western analyse av TP53, p21Cip1 og p27Kip1 etter behandling av HEY celler med kontroll siRNA og cdk5 siRNA i nærvær og fravær av paclitaxel. Knockdown av cdk5 betydelig økt TP53, p21
Cip1 og p27
Kip1 (Fig 3C). Behandling med paclitaxel ytterligere økte nivåer av disse tre proteinene (figur 3C). I tillegg knockdown av cdk5 indusert veksthemming og knockdown av TP53 redusert stanse cdk5-mediert veksthemming i nærvær eller fravær av paclitaxel (Figur 3D). I tråd med dette økte cdk5 siRNA kreftcellen G1 cellesyklus og apoptose, men knockdown av TP53 redusert cdk5 siRNA-indusert G1 cellesyklusarrest i nærvær eller fravær av paclitaxel (figur 3E og 3G) og reduserte cdk5 siRNA indusert apoptose (fig 3F og 3G) i HEY celler. I SKOV3-celler som er TP53 null, knockdown av cdk5 øker fraksjonen av celler i G2 /M etter behandling med paclitaxel (S3 Fig). Tvunget uttrykk for villtype TP53 i SKOV3 celler økt brøkdel av celler i G1 (S3 figur).
cdk5 knockdown produserer post-translasjonell oppregulering og kjernefysisk translokasjon av TP53 og p27
Kip1 og induserer TP53-avhengige transkripsjon av p21
Cip1
cdk5 knockdown i HEY celler betydelig forlenget halveringstid på TP53 og p27
Kip1 proteiner (fig 4A). Stanse av cdk5 økt kjernefysiske lokalisering av TP53 og P27
Kip1 proteiner og cytoplasmatiske nivåer av p21
Cip1 (fig 4B). Den p27
Kip1 proteinnivå er i hovedsak regulert post-transcriptionally [20, 21]. Cdk5 siRNA redusert fosforylering av p27Kip1 ved Thr187 (figur 4C), som er nødvendig for binding til ubiquitin ligase og fører til 26S proteasomet degradering. TP53 har blitt rapportert å være et direkte substrat av cdk5 [22-24]. Ved hjelp av renset cdk5 protein og en fluorescens-basert in vitro kinaseanalyse, observerte vi fosforylering av TP53 og p27
Kip1 (figur 4D), ved bruk av en ikke-relatert protein, ARHI-NTD, som en negativ kontroll og Histone H1 som en positiv kontroll (S4 fig) [25, 26]. Fordi p21
Cip1 kan reguleres ved TP53 på transkripsjonsnivået og cdk5 lyddemping også kan oppregulere ekspresjonen TP53, testet vi effekten av cdk5 knockdown og TP53 knockdown på p21
Cip1 promoter-aktivitet. Sammenlignet med kontroll siRNA, cdk5 siRNA økt promoter aktivitet av p21 vesentlig
Cip1, som ble avskaffet ved ko-transfeksjon med TP53 siRNA (Fig 4E). Videre knockdown av p21
Cip1 og p27
Kip1 samtidig (figur 4F) reduserte cdk5 siRNA-indusert økning i apoptose (figur 4G) og reduserte cdk5 siRNA-indusert G1 cellesyklusarrest i nærvær eller fravær av paclitaxel (fig 4H) i HEY celler. Således stanse av cdk5 fremstilt post-translasjonell oppregulering av TP53 og p27
Kip1 forbundet med TP53-avhengige transkripsjons-induksjon av p21
Cip1.
(A) Transfeksjon med cdk5 siRNA økte halveringstiden av p53 og p27
Kip1 protein. HEI-celler ble transfektert med kontroll siRNA eller cdk5 siRNA i 24 timer og deretter behandlet med 5 pg /ml cykloheksimid (CHX) for de angitte intervaller. Cellelysater ble underkastet Western-analyse med antistoffene angitt. (B) cdk5 siRNA økte kjernefysiske lokalisering av p53 og p27
Kip1. HEI-celler ble transfektert med kontroll siRNA eller cdk5 siRNA i 24 timer og underkastet fraksjonering i cytoplasmiske og kjernekomponenter. Cytoplasmatiske (CE) og kjernefysiske (NE) ekstrakter ble analysert ved immunoblotting. (C) cdk5 siRNA redusert fosforylering av p27Kip1 ved T187. Cellen Immunoblot analyse ble utført med antistoffer mot fosforylert og total p27Kip1. (D) cdk5 økt fosforylering av TP53 og p27
Kip. En fluorescens-basert in vitro kinase analyse ble anvendt for å evaluere interaksjonen av cdk5 med TP53 og p27
Kip1. (E) cdk5 siRNA transcriptionally regulert uttrykk av p21
Cip1. HEI-celler ble transfektert med cdk5 siRNA alene eller i kombinasjon med TP53 siRNA og et luciferase reporter-analysen ble anvendt for å måle p21
Cip1 promoter-aktivitet. (F) cdk5, p21
Cip1 og p27
Kip1 knockdown redusert uttrykk for cdk5, p21
Cip1 og p27
Kip1. HEI-celler ble behandlet med kontroll siRNA eller cdk5 /eller p21 p27 pluss siRNA i 48 timer og deretter med paclitaxel (6 nM) eller fortynningsmiddel i 24 timer. Immunoblot-analyse ble utført med antistoffer indikert. (G, H) knockdown av p21and p27 redusert cdk5 knockdown-indusert apoptose (G) og G1 arrest (H). HEI celler ble behandlet som i (F) og cellesyklus analysert ved flow-cytometri etter siRNA transfeksjon. SubG1 celler ble ansett apoptotiske celler. Data er middelverdier fra tre uavhengige eksperimenter.
cdk5 knockdown-induserer apoptose som er avhengig av caspase-3-aktivering og er assosiert med BCL-2 downregulation
For å belyse den mekanismen som cdk5 knockdown indusert apoptose, spurte vi om cdk5 knockdown og paclitaxel behandling aktivert caspase-3. Western-analyse viste at cdk5 knockdown kan indusere aktivering av caspase-3, og dette ble ytterligere øket ved behandling med paclitaxel (Figur 5A). Z-VAD-FMK, en pan-caspase inhibitor, blokkerte apoptose i celler transfektert cdk5 siRNA (Fig 5B). Følgelig er apoptotisk celledød indusert ved cdk5 lyddemping var kaspase avhengig. Bcl-2 er et viktig inhibitor av apoptose. Cdk5 lyddemping ble funnet å redusere ekspresjonen av Bcl-2-mRNA-nivå ved QRT-PCR (figur 5C), som kan gjøres rede for oppregulering av p27Kip1, som vi tidligere har rapportert [1]. Kombinasjonen av cdk5 siRNA og paclitaxel viste økt inhibisjon av Bcl-2-mRNA enn gjorde cdk5 siRNA alene.
(A) cdk5 knockdown indusert kaspase-3 aktivering i nærvær og fravær av paclitaxel. HEI-celler ble transfektert med kontroll siRNA eller cdk5 siRNA i 24 timer, behandlet med paclitaxel (3 nM) eller fortynningsmiddel i 48 timer, lysert og totalt protein analyseres ved immunoblot ved å bruke antistoffer mot aktivert kaspase-3 og GAPDH. (B) En pan-caspase hemmer blokkert cdk5 knockdown-indusert apoptose. HEI-celler ble forbehandlet i 2 timer med 20 uM av et pan-kaspaseinhibitor (Z-VAD-FMK), eller negativ kontroll (Z-FA-FMK), etterfulgt av behandling i 24 timer med eller uten paclitaxel (3 nM). Cellene ble deretter fiksert i 70% etanol, farget med propidiumjodid, og underkastet cellesyklusanalyse ved strømningscytometri. Den sub-G1 cellepopulasjon ble ansett apoptotiske og uttrykt som en prosentandel av det hel-celle-populasjonen. (C) cdk5 knockdown redusert ekspresjon av Bcl-2-mRNA.
