Abstract
Cisplatin motstand er en av de viktigste årsakene som fører til den høye dødeligheten av kreft i eggstokkene. Metyl-Capture sekvensering (MethylCap-seq), som kombinerer utfelling av metylert DNA ved rekombinant metyl-CpG-bindende domene av MBD2 protein med NGS, global og objektiv analyse av globale DNA metylering mønstre. Vi søkte MethylCap-seq å analysere genom-wide DNA metylering profilen av cisplatin sensitive eggstokkreft cellelinje A2780 og dens isogen derivat resistent linje A2780CP. Vi har innhentet 21763035 rå leser for resistente cellelinje A2780CP og 18,821,061reads for sensitive cellelinjen A2780. Vi identifiserte 1224 hyper-metylert og 1216 hypomethylated DMRs (differensielt denaturert region) i A2780CP sammenlignet med A2780. Våre MethylCap-seq data på denne eggstokkreft cisplatin motstandsdyktig modell gitt en god ressurs for forskersamfunnet. Vi har også funnet ut at A2780CP, sammenlignet med A2780, har lavere observerte til forventet denaturert CpG forhold, noe som tyder på en lavere global CpG metylering i A2780CP celler. Metylering spesifikk PCR og bisulfite sekvensering bekreftet hypermethylation av PTK6, PRKCE og BCL2L1 i A2780, sammenlignet med A2780CP. Videre behandling med demetylering reagens 5-aza-st i A2780 celler demetylert arrangører og restaurert uttrykk for PTK6, PRKCE og BCL2L1
Citation. Yu W, Jin C, Lou X, Han X, Li L: He Y, et al. (2011) Global Analyse av DNA Metylering av metyl-Capture Sekvense avslører epigenetisk kontroll av Cisplatin Resistance i Ovarian Cancer Cell. PLoS ONE 6 (12): e29450. doi: 10,1371 /journal.pone.0029450
Redaktør: Matteo Pellegrini, UCLA-DOE Institutt for Genomics og proteomikk, USA
mottatt: 21 oktober 2011; Godkjent: 29 november 2011; Publisert: 22.12.2011
Copyright: © 2011 Yu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av midler til BL av departementet for vitenskap og teknologi i Kina [2006AA02A303, 2006AA02Z4A2, 2006DFA32950, 2007DFC30360]. Dette arbeidet støttes av midlene til JZ fra National Science Foundation (30921140312), National Research Program for Basic forskning (2009CB825606, 2009CB825607 og 2010CB912802) og International Collaboration Grant (2009DFA31010) til XD). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Drug motstand er den viktigste grunnen fører til den høye dødeligheten av kreft i eggstokkene. Den kjemoterapeutisk middel cisplatin (cis-diamminedi-chloroplatinum (II)) er spesielt effektiv mot ovarialcancer med en innledende svarprosent på opp til 70% [1]. Men eggstokkreft slutt utvikler resistente mot cisplatin og 5-års overlevelse for pasienter er bare 15-20% [2]. Cisplatin medierer dens handlinger ved å danne DNA-addukter-primært intra-trådtverrbindings addukter [3] og aktiverer flere signaloverføringsveier omfatter ATR, p53, p73, og MAPK veier, noe som resulterer i apoptose [3], [4].
DNA metylering er ofte forbundet med transcriptional undertrykkelse av genekspresjon [5] og med respons på kjemoterapi [6], [7]. En klassisk eksempel er at metylering av den MGMT (O6-metylguanin-DNA-metyltransferase) promoter i gliomer er en nyttig indikator på respons fra svulstene alkyleringsmiddel karmustin [1,3-bis (2-kloretyl) -1-nitrosourea] , såvel som av den totale og sykdomsfri overlevelse in gliomas [6]. I eggstokkreft, Taniguchi et al. foreslå en modell for ovarial tumor progresjon i hvilken den første metylering av FANCF er etterfulgt av demetylering FANCF og til slutt resulterer i cisplatin motstand [7]. DNA-metylering av flere gener i eggstokk-kreft, inkludert HSulf-1 [8], ABCG2 [9], EZH2 [10] har blitt funnet å være assosiert med medikamentresistens. Boettcher et al. analysert HD-DNA metylering profiler av 800 CpG øyer (CGIer) av utvalgte gener og identifisert som hyper-metylering i CGIer av BRCA1, CDH1, DNAJC15 og SULF2 samt hypo-metylering av CGIer for ABCB1, viste APC og HIC1 gener økt doxorubicin toleranse [11]. Chang et al. brukte global genekspresjon profilering for å analysere kreftceller før og etter behandling av DNA-metyltransferase inhibitor5-aza-2′-deoksycytidin, som re-aktiveres metylering stilnet-genet [12]. De identifiserte flere hundre gener som ble nedregulert i cisplatin resistente kreftceller og reaktivert av DNA metyltransferase hemmer 5-aza-2′-deoxycytidine [12]. Li et al. sammenlignet metylering mønster av A2780 og deres stammer resistente cellelinje etter flere runder med legemiddelvalg med globale CGI metylering arrays og mRNA uttrykk mikromatriser [13].
Å dra nytte av neste generasjons sekvensering (NGS) teknologier den metylert brøkdel av genomet fanget av MeDIP-seq [14], methylCap-seq [15] og methylcap-seq [16] har vært profilert i en større dybde enn array-basert plattform, avsløre mange nye regioner som er forskjellig metylert med de biologiske innhold. Her rapporterer vi sammenligning av de globale DNA metylering mønstre av ciplatin sensitive (A2780) og resistente (A2780CP) eggstokkene cellelinjer for de viktigste epigenetiske kontrollene som er ansvarlige for cisplatin motstand. Vi identifiserte 1224 hyper-metylert og 1216 hypomethylated DMRs (differensielt denaturert region) i A2780CP sammenlignet med A2780. Vi har også funnet at A2780CP, sammenlignet med A2780, har en lavere global CpG metylering. Flere gener ble bekreftet å ha både arrangøren metylering og tilsvarende uttrykk endrer inkludert PTK6, PRKCE og BCL2L1, og behandling med demetylering reagens 5-aza-st i A2780 celler demetylert arrangører og gjenopprettet sitt uttrykk.
Resultater
Methylomic analyse av cisplatin motstandsdyktig A2780CP og dens isogen cisplatin sensitive A2780 cellelinje
Menneske ovarialcancer A2780CP cellelinje (cisplatin-resistent) ble avledet fra A2780 (cisplatin-sensitive) cellelinje, men viser økt bestandighet mot cisplatin [17]. A2780CP og A2780 er isogen (samme genomisk DNA). For å bekrefte at cellelinjen A2780CP vi fortsatt hadde opprettholdt cisplatin motstand, vi utført MTT analyse for å vurdere cisplatin narkotika reaksjoner fra A2780CP og A2780 celler. Vi fant at IC50 for A2780CP (5,0 ug /ml) er nesten tre ganger høyere enn den til A2780 (1,8 ug /ml) (fig. 1). Våre data er i overensstemmelse med den tidligere rapporterte cisplatin responsprofiler av A2780CP [17], noe som indikerer at cellelinjene som vi hadde i laboratoriet beholder forskjellen i cisplatin motstand.
Både A2780 og A2780CP ble behandlet med cisplatin i forskjellig doser fra 0 ug /ml til 16 ug /ml i 72 timer.
Vi har derfor søkt MethylCap-seq å analysere methylomic profiler av både A2780 og A2780CP celler. Vi har innhentet 21763035 rå leser for resistente cellelinje A2780CP og 18,821,061reads for sensitive cellelinjen A2780. 13950202 (64,1%) og 13671899 (72,6%) leser var unikt tilordnet menneskelige genom for henholdsvis A2780CP og A2780
Vi merket det står i forhold til de CpG øyer i det menneskelige genom (http:. //Genom .ucsc.edu /) og fant at omtrent 1,4% og 2,5% av den leser lokalisere inne CpG øyer henholdsvis for A2780CP og A2780.The gjennomsnitt sekvens dybde for de CpG øyer dekket er omtrent 16 og 24,5 ganger. Om 68% og 66% av de menneskelige CpG øyene ble dekket i vår analyse for henholdsvis A2780CP og A2780 (tabell 1). CPG dekning og dybden vi oppnådd i vår MethylCap-seq er likt det som tidligere utgitt [18].
For å oppdage differensial metylering regioner (DMRs) i det humane genomet mellom følsomme og resistente celler, vi brukte MEDIPS, en nylig utviklet verktøy spesialisert for å analysere immunoprecipitation basert metylering analyse (f.eks MeDIP-seq og MethylCap-seq) [19]. Vi setter kriteriene for betydelige DMRs: lengden på toppene ble satt til 500 basepar og topper med 20 rpm (leser per million), p-verdi mindre enn 0,001 og forholdet mellom turtall mellom to cellelinje 20. Vi fikk 1224 DMRs som er hyper-metylert i A2780CP forhold til A2780 (tabell S1) og 1216 DMRs som er hyper-metylert i A2780 forhold til A2780CP (tabell S2). Disse DMRs ble annotert med sine genomiske steder og tilhørende gener innenfor -5 K bp til 5 K bp til transkripsjonsstartsider (Tabell S3 og 4).
Nesten halvparten av DMRs lå til innen 5 k bp av transkripsjon starte nettsteder (TSS) av gener. 190 og 270 DMRs ble plassert oppstrøms av TSS i henholdsvis A2780 og A2780CP (tabell 1). Resten kartlagt til andre deler av det menneskelige genom inkludert introner, eksoner, intergeniske regioner og gjentar (Ensembl menneskelige genom merknader) (figur 2A.). Hypermethylated regioner i promotorene av genene er kjent for å redusere genekspresjon [17], men effekten av hypermethylation regioner annet sted innen genet regionen forblir ufullstendig. Den hypermethylation av repetitive genomiske sekvenser kan hindre kromosom ustabilitet, trans, og genet avbrudd forårsaket av reaktivering av transposable DNA-sekvenser [17], [20].
A. Andel hypermethylated topper basert på deres lokaliserte genomiske funksjoner. B. Fordeling av CpG
o /e for hypermethylated toppene basert på deres lokaliserte genomiske funksjoner.
Li et al. sammenlignet isogen A2780 og deres valgte resistente cellelinje ved hjelp av 60-mer oligo microarray som inneholder 40.000 CpG-rike fragmenter fra 12.000 kjente genet arrangører (Agilent, Santa Clara, CA) [13]. Ved hjelp av en grenseverdi på 1,5 ganger, identifisert de 595, 870 og 1,176 hypermethylated gener for Round1, Round3 og Round5 resistente underlinjer sammenligne med foreldre ( «Round0») A2780 celler [13]. Teknologien som de som brukes er differensial metylering hybridisering (DMH) [21], hvor metylert DNA ble separert fra unmethylated ved metylering følsomt enzym diagestion for undersøkelser av oligonukleotid rekke av de humane CpG øya regioner. DMH er forskjellig fra MDB-seq, hvori metylert DNA ble utfelt ved rekombinant metyl-CpG-bindende domene av MBD2 protein, og deretter sekvensert. I DMH ble det isolerte DNA spaltet med metylering-insensitive Bfal restriksjonsenzym (C∧TAG), ligert til linkere, og spaltet på nytt med metylering følsomme enzymer HinP1I (G∧CGC) og HpaII (C∧CGG). Fordøyelsen produkter ble så forsterket ved hjelp av linkerne og merket med Cy3 eller Cy5 fargestoffer for komparative hybridizations [21]. Til tross for ulike teknologier som brukes, sammenlignet vi våre MDB-seq data med DMH data Li et al. S. Vi har funnet at 221 (av 1224, 18,1%) og 142 (av 1216, 11,68%) av hypermethylated og hypomethylated gener i A2780CP i sammenligning med A2780 var også på matrisen som Li et al. brukt (tabell S3, S4). Vi fant at 15 regioner (svarende til 13 gener) og 23 regioner (21 gener) som er felles mellom de to datasettene (Tabell 2), som er svært betydelig overlapping med hypergeometrisk sannsynlighetene for 1.11E-5 og 4.22E-20 hhv . De vanligste hypermethylated gener i de resistente cellene inkluderer retinoblastom bindende protein 8 (RBBP8), SRY-box 1 (SOX1), vingeløse-type MMTV integrering nettstedet familie (WNT9A), generell transkripsjonsfaktor IIIA (GTF3), og ofte hypomethylated gener i de resistente celler inkluderer oppløsningsmaterialet bærer familien 22 (extraneuronal monoamine transporter) (SLC22A3), aldehyd-dehydrogenase en familie (ALDH1A3), hyaluronan syntase 3 (HAS3) og CUB domene inneholdende protein 1 (CDCP1) (tabell 2).
det er 410 hypermethylated DMRs (Tabell S3) og 316 hypomethylated (tabell S4) i A2780CP sammenlignet med A2780 som ikke var på tabellen som Li et al. brukt, og ville ikke ha blitt identifisert av DMH tilnærming. Disse nye DMRs avslørte kraften av MDB-seq i å identifisere nye DMRs uten tidligere kjennskap til kandidatpromotorer for å bli satt på matriser som skal brukes i DMH. Videre kan disse nye DMRs være på grunn av forskjeller i de avledede resistente cellelinjer som ble brukt av Li et al. og oss.
En lavere global CpG metylering i cisplatin resistente A2780CP celler sammenlignet med cisplatin sensitive A2780 celler
For å forstå det globale mønster av CpG metylering i begge cellelinjene, analyserte vi karakteristikkene av hypermethylated CPGs over hele genomet ved å telle antall nabo CPGs innenfor de 500 bp regionene rundt hypermethylated områder og beregnet CpG observert /forventet ratio (CpG
o /e) for hver CpG ved hjelp av metoden beskrevet av Ruike et al . [22]. Vi fant ut at, generelt, har A2780CP lavere CpG
o /e enn for A2780, noe som tyder på en lavere global CpG metylering i A2780CP forhold til A2780 (Fig. 2B, venstre panel). Forskjellene var for det meste manifestert i høyere CpG
o /e i intron og gjenta sekvenser av A2780 sammenlignet med A2780CP. Sammenligning av CpG
o /e på tvers av ulike genomiske regionens kategorier (Fig. 2B), den CpG
o /e var større enn 0,6 i eksoner og arrangører for både resistente og sensitive cellelinjer, men mindre enn 0,6 i andre genomisk regioner (gjentar, introner og intergeniske regioner) (fig. 2B).
Funksjonell merknader og sti berikelse analyse for DMR genene
Vi utførte GO analyse for hypermethylated gener i både motstandsdyktig (tabell S5) og sensitiv cellelinje (tabell S6). Vi fant ut at hypermethylated gener i den sensitive cellelinjen ble beriket for GO termer: anti-apoptose (GO: 0006916), negativ regulering av celledød (GO: 0060548), og regulering av intracellulært protein kinase kaskade (GO: 0010627). De hypermethylated gener i resistente cellelinjen har flere beriket vilkår knyttet til transkripsjon faktor regulering som GO: 0030528 transkripsjonsregulator aktivitet og gå: 0003677 DNA bindende
Vi utførte også KEGG pathway analyse for DRM-gener og funnet. at gener med hypermethylated arrangører ble beriket i følgende KEGG trasé inkludert 11 gener i hsa04010 (MAPK signalveien), 18 gener i hsa05200 (pathways i kreft), 5 gener i hsa04310 (Wnt signalveien), 5 gener i hsa00982 (Drug metabolisme ), og 5 gener i hsa04115 (p53 signalveien) (tabell 3).
Interessant nok ble mange ECM-relaterte og membran kanal proteiner hypermethylated. For eksempel, KCNS1 og KCNA1, to kalium spennings gated kanal protein, og SLC15A4 (oppløst stoff carrier familie 15, del 4) er hypermethylated i A2780CP celler mens SLC4A11 (oppløst stoff carrier familie 4, natriumborat transporter, medlem 11) er hypermethylated i A2780 celler. COL18A1 (kollagen, type XVIII, alfa 1) er hypermethylated i A2780 celler mens KRTAP10-6 (keratin assosiert protein 10-6) og LRFN5 (leucine rik gjenta og fibronectin type III domene som inneholder 5) er hypermethylated i A2780CP celler. Vi identifiserte også hypermethylation på flere mikroRNA loci inkludert hypermethylation av MI6A2, MIR129-2, MIR124-1, MIR124-3, og MIR10A i A2780CP og hypermethylation av MIR185, MIR548Q, MIR642A og MIR661 i A2780 (tabell 4).
Validering av gener med DMRs av MS-PCR og bisulfite sekvense
uttrykket av gener med hypermethylated promoter ble sjekket av RT-qPCR, hvis uttrykket ble betydelig endret da metylering spesifikk PCR (MS- PCR) ble anvendt for å validere metylering status for DMR områder mellom to cellelinjer. Vi identifiserte følgende gener BCL2L1 (BCL2 lignende 1), PPKCE (protein kinase C, epsilon), PTK6 (PTK6 protein tyrosin kinase 6), RAC2 (ras-relaterte C3 botulinumtoksin substrat 2), SECTM1 (utskilt og trans 1) og DDIT3 (DNA-skade-induserbar transkripsjon 3) som endret både arrangøren metylering og uttrykk. Figur 3A viste uttrykk endringer av disse genene, og 3B viste arrangøren metylering mønstre av disse genene. DDIT3 ble hypomethylated i A2780-celler sammenlignet med A2780CP, mens resten viste det motsatte (Fig. 3B). For ytterligere å bekrefte DMRs mellom A2780 og A2780CP, brukte vi bisulfite sekvense å sekvensere promotorområdene av tre tilfeldig plukket gen fra de 6 gener. Figur 3C viste at alle promoter regioner av plukket genet PTK6, PRKCE og BCL2L1 ble hypomethylated i A2780CP sammenlignet med A2780.
A. Real-time PCR viser differensial uttrykk av utvalgte gener mellom cisplatin sensitive A2780 og cisplatin resistente A2780CP celler. B. MS-PCR data som viser differensial metylering stater i promoter regioner i de utvalgte gener mellom A2780 og A2780CP celler. C. Bisulfite sekvense resultat for promoter regioner av valgt genet PTK6, PRKCE og BCL2L1 (hvit syklus: unmethylated CpG, Black syklus: denaturert CpG).
Restaurering av genuttrykk fra DMR berørt gener ved treatmentwith 5 -aza-dc demetylering reagent
for ytterligere å bekrefte dataene våre, vi brukte 5-aza-2′-deoksycytidin (5-aza-dC) for å se om vi kan reaktivere metylering-silenced gener som vi identifisert. 5-aza-2′-deoksycytidin (5-aza-dC) er en analog av cytosin. Når inkorporert i DNA, den irreversibelt binder metyltransferase enzymer, noe som resulterer i passiv de-methylationand reaktivering av epigenetiske dempede gener [23]. Vi brukte 5-aza-dC for å behandle både A2780CP og A2780 celler i forskjellige doser fra 0 uM til 10 uM. Uttrykket av gener behandlet med lavest (0 mm) ble sammenlignet med behandling med høyest (10 mm) dose av demetylering reagens.
Vi viste at vi var i stand til å demethylate arrangører av hypermethylated PRKCE, BCL2L1, RAC2, PTK6, SECTM1 (fig. 4A, B), og gjenopprettet sitt uttrykk etter behandling med 5-aza-st i A2780 celler. På samme måte kunne vi demethylate arrangører av hypermethylated genet DDIT3, og restaurert dens uttrykk etter behandling med 5-aza-st i A2780CP celler (fig. 4A, B).
A. Validering av endringer av metylering status ved MS-PCR for de seks gener under behandling med 0 mM og 10 mm 5-aza-DC. B. genuttrykk endringer (Y-aksen, relative fold endringer) for de valgte seks gener etter behandling med forskjellig konsentrasjon (X-aksen) av demetylering reagens 5-aza-DC.
Diskusjoner
Vi beskriver her for første gang en MDB-seq analyse av en cisplatin respons modell av eggstokkreft celler. De epigenetiske endringene mellom isogen par av cisplatin sensitive A2780 og dens resistente avledede A2780CP celler foreslå en epigenetisk kontroll mekanisme for cisplatin motstand. Den globale MDB-seq datasett generert for denne par isogene celler vil være en nyttig ressurs for forskningsmiljøet interessert i cisplatin motstand og epigenetikk, og i eggstokkreft generelt. Globalt DNA metylering endres under kreftutvikling, og er ofte en prediktor for terapi svar. For eksempel Anisowicz et al. viste at til og med den normale delen av lungen fra en kreftpasient allerede har hatt et tap av global DNA-metylering i forhold til et normalt individ [24]. Kim et al. viste at den globale CpG metylering spiller en rolle i epigenetisk kontroll av radiosensitiviteten i lungecancercellelinjer [25]. I hjernesvulst, LINE-en metylering, en global DNA metylering markør, er proporsjonal med MGMT arrangøren metylering og høyere LINE-en metylering er en gunstig prognostisk faktor i grunnskolen GBMS, selv i forhold til MGMT arrangøren metylering [26]. Her observerte vi en lavere global CpG metylering i cisplatin motstandsdyktig A2780CP celler sammenlignet med cisplatin sensitive A2780 celler, noe som tyder på at den globale DNA-metylering mønstre kan være i stand til å forutsi cisplatin motstand for eggstokkreft. Videre eksperimentering er nødvendig for å vurdere denne hypotesen.
Vi har innhentet 1,224 og 1,216 DMRs som er hyper-metylert eller hypo-metylert i A2780CP forhold til A2780 celler (tabell S1, S2). Vi fant ut at hypermethylated gener i den sensitive cellelinjen ble beriket for GO vilkår for anti-apoptose (GO: 0006916) og negativ regulering av celledød (GO: 0060548), noe som tyder på en mulig generell mekanisme for epigenetisk stanse av anti-apoptose gener, resulterer i følsomhet for cisplatin. Vi fant også at DMRs er beriket på flere signalveier inkludert hsa04010 (MAPK signalveien), hsa04310 (Wnt signalveien), og hsa04115 (p53 signalveien) veier (tabell 3). Wnt signalveien har vært innblandet i eggstokkreft progresjon og chemoresistance [27]. Aktivering av JNK /p38 MAPK trasé som reaksjon på cisplatin kan føre til Fas-ligand induksjon og celledød i eggstokk-carcinoma celler [4]. P53 og dens signalveien ble også vært implisert i cisplatin motstand i eggstokkreft celler [28], [29]. Våre data tyder på at epigenetisk regulering av disse signalveier er en av mekanismene for involvering av disse banene i cisplatin motstand i eggstokkreft celler.
Vi har også identifisert hypermethylation på flere mikroRNA loci inkludert hypermethylation av MI6A2, MIR129- 2, MIR124-1, MIR124-3, og MIR10A i A2780CP og hypermethylation av MIR185, MIR548Q, MIR642A og MIR661 i A2780 (tabell 4). MicroRNAs har vært implisert i cisplatin motstand i eggstokk-kreft [30]. For eksempel, Yang et al. viste at mange mirnas er deregulert i menneskelig eggstokkreft inkludert MIR-214, MIR-199A *, MIR-200A, MIR-100, MIR-125b, og la-7 klynge, og at MIR-214 induserer celleoverlevelse og cisplatin motstand ved målretting PTEN [30]. Epigenetiske forstummet microRNAs har vært innblandet i kreft [31], [32]. Men metylering av miRNA locus har ikke blitt rapportert tidligere for eggstokkreft; verken er rapporter om forholdet mellom miRNA metylering og cisplatin motstand. Våre data kan peke til en ny retning for studiet av metylering av mikroRNA loci og cisplatin motstand.
Vi fant at BCL2L1 (BCL2 lignende 1), PPKCE (protein kinase C, epsilon), PTK6 (PTK6 protein tyrosinkinase 6), RAC2 (ras-beslektede C3 botulinumtoksin substrat 2), SECTM1 (utskilt og transmembran-1) er hypermethylated i cisplatin følsomme A2780 celler og DDIT3 (DNA-skade-induserbar transkripsjon 3) er hypermethylated i cisplatin motstandsdyktig A2780CP celler. Deres ekspresjon ble også også endret tilsvarende til den hypotese at hypermethylation ville slå genekspresjon. Vi bekreftet metylering mønster av disse genene hos MS-PCR, og også var i stand til å demethylate arrangører av disse genene og gjenopprette deres uttrykk etter behandling med 5-aza-DC, en agent som de-methylates og reaktiverer av epigenetiske forstummet gener [ ,,,0],23].
Vi fant BCL2L1 er hypermethylated i de følsomme A2780 celler. BCL2L1 (BCL-XL) koder for et protein som tilhører BCL-2 proteiner familie, hvis protein medlemmer fungerer som anti eller pro-apoptotiske regulatorer [33]. Over-ekspresjon av Bcl-xL-protein er kjent for å gi resistens mot et bredt spekter av potensielt apoptotiske stimuli i karsinogenisitetsstudier prosesser inkludert onkogen aktivering, hypoksi og matrise løsgjøring [34] – [37]. Våre resultat viser at hypometylering av BCL2L1 i de resistente celler (det vil si hypermethylation av BCL2L1 i de sensitive celler) vil resultere i økt ekspresjon BCL2L1, således som utviser resistens mot cisplatin. Våre data er konsistent med den observasjon ved Williams et al. som uttrykk for BCL-XL i ovarialcancer er assosiert med chemoresistance og tilbakevendende sykdom [38]. Tar sammen, dette tyder på at modulerende uttrykk for BCL2L1 (BCL-XL) av epigenetiske hjelp kan være en måte å overvinne cisplatin motstand i eggstokkreft celler.
Vi har også identifisert PTK6 (protein tyrosin kinase 6) som hypermethylated i cisplatin sensitive A2780 celler sammenlignet med A2780CP celler. PTK6 direkte fosforylerer AKT og fremmer AKT aktivering i respons til epidermal vekstfaktor [39]. Forholdet av PTK6 med cisplatin har ikke tidligere vært studert. Videre funksjonell analyse av PTK6 rolle i moduler cisplatin motstand er berettiget. PPKCE (proteinkinase C, epsilon) er et annet gen som er hypermethylated i cisplatin følsomme A2780-celler sammenlignet med A2780CP celler. PPKCE er medlem av protein kinase C (PKC) familie, hvis medlemmer fosforylere et bredt utvalg av protein mål og er involvert i ulike cellulære signalveier [40]. Interessant, cisplatin var i stand til å indusere fosforylering og translokasjon av PPKCE fra plasmamembranen til kjernemembranen og til den cytosoliske fraksjonen [41]. Den hypermethylation av PPKCE i de sensitive celler ville redusere dets ekspresjon, noe som resulterer i mindre translokasjon til kjernemembranen eller cytosoliske fraksjon ved tilsetning av cisplatin. Men om redusert uttrykk for PPKCE overfører følsomhet for cisplatin i eggstokkreft celler gjenstår å bli undersøkt.
Til slutt, vi identifisert DDIT3 (DNA-skade-induserbar transkripsjon 3) som hypermethylated i cisplatin resistente A2780CP celler i forhold til A2780 celler. Også kalt GADD153 (Vekst arrest og DNA-skader-induserbar protein 153), koder DDIT3 medlem av CCAAT /enhancer-bindende protein (C /EBP) familie av transkripsjonsfaktorer, og aktiveres av endoplasmatisk retikulum stress, og fremmer apoptose. DDIT3 (GADD153) uttrykket kan være forårsaket av cisplatin [42]. Vi observerte at det er hypermethylation i resistente celler, noe som vil resultere i redusert uttrykk for DDIT3. Det er mulig at cisplatin virker gjennom DDIT3 for å fremme vekst og apoptose, og redusert ekspresjon av DDIT3 i cellene ville gjøre dem mer resistente overfor cisplatin. Imidlertid forble detaljert mekanisme for å bli undersøkt.
I sammendraget, vi generert et globalt datasett for en eggstokkreft cisplatin motstand modell og identifisert flere gener som ble utsatt for epigenetisk kontroll for å modulere cisplatin motstand. Disse genene kanskje fungerer som mål å overvinne chemoresistance til cisplatin i eggstokkreft.
Metoder
Cellelinjer
A2780 og A2780CP var dyrket i RPMI 1640 medium (Invitrogen) som inneholder 10 % føtalt bovint serum (10099-141) ved 37 ° C og 5% CO
2. Celler ble vennlig levert av Dr. Stephen Collins fra UC San Diego (CA, USA).
Cytotoksisitet analyse
Både resistente og sensitive celler ble sådd på 96 brønners plater i en konsentrasjon på 4000 celler /brønn i fem replikater med fullstendig kulturmedium. Da celler ble behandlet med cisplatin i annen dose fra 0 ug /ml til 16 ug /ml. Etter 72 timers inkubering ble både levedyktige og døde celler tellet ved hjelp av MTT-analyse, og bare de levedyktige celler ble inkludert i dataanalysen.
Bisulfite-modifisert DNA-sekvensering og Metylering-spesifikke PCR
Vi har fremstilt genomisk DNA fra dyrkede celler ved hjelp av DNeasy Blood & Co. vev Kit (Qiagen). Omtrent 200 ng av DNA var bisulfitt-behandlet med EZ DNA Metylering-gull kit (Zymo Research) i henhold til fremstillingen protokoll. ZymoTaq forblanding ble benyttet for Metylering-spesifikke PCR (MSP) og i henhold til disse primere (tabell S7). Metylering-spesifikk PCR ble utført i et totalt volum på 25 ul ved hjelp av ZymoTaq Premiks (ZYMO forskning). MSP reaksjoner ble underkastet første inkubering ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 30 sekunder, og glødning ved passende temperatur i 35 sekunder og 72 ° C i 40 sekunder. Endelig ekstensjon ble utført ved inkubasjon ved 72 ° C i 7 minutter. MSP produkter ble separert på 2% agarosegel og visualisert ved etidiumbromidfarging
De primere for sulfitt-modifiserte sekvensering (tabell S7) og MSP ble designet av web-verktøy MethPrimer (http:. //www.urogene. org /methprimer /index1.html) [43]. Betingelsene for bisulfitt-modifisert sekvenseringsreaksjon er samme som MSP. Produktene ble renset ved hjelp MinElute PCR rensing Kit, klonet inn i PMD 18-T vektor (Takara) og sekvensert.
RNA isolering og Real time RT-PCR
RNA ble ekstrahert ved hjelp av protokollen for Trizol reagens (Invitrogen). 2 mikrogram RNA ble først revers-transkribert i 25 mL med et arkiv Kit (Applied Biosystems) og 2 mL ble forsterket av Real Time PCR (Bio-Rad CFX96 Rea-Time System). cDNA prøvene ble forsterket med SYBR® Pre-mix Ex Taq ™. Den termiske sykluser profilen besto av innledende denaturering ved 95 ° C i 30 sekunder og 40 sykluser ved 95 ° C i 5 sekunder, 60 ° C i 15 sekunder og 72 ° C i 30 sekunder. Hver prøve ble behandlet i tre eksemplarer.
5-aza-2′-deoksycytidin behandling
Menneskelige ovarian carcinoma celler A2780 og A2780CP ble dyrket i 5 dager i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av 5-Aza -DC (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5 og 10 uM). Frisk stoffet ble lagt til hver 24 timer.
denaturert DNA Binding Protein sekvensering (MethylCap-seq)
3 ug av genomisk DNA isolert som beskrevet ovenfor ble fragmentert ved ultralyd med Bioruptor (Diagenode, Belgia) og slutt reparert, A-tailed, og ligert til 2,5 mmol av «parvise end» adaptere (IDT Inc.) etter produsentens anbefaler protokoll (Illumina Inc.). 1,2 pg av DNA ble fraksjonert på en hjemmelaget GST-MBD-harpiks med en buffer av en trinnvis økt saltkonsentrasjon [16]. Den høye salt Fraksjonen ble direkte amplifisert ved 12-syklus PCR [18]. Den 350-450 bp brøkdel av PCR-produktene ble gel-renset og kvantifisert ved hjelp av en Agilent DNA 1000.
250-400 bp DNA-fraksjoner ble skåret ut og renset som beskrevet ovenfor. Produktene ble vurdert og kvantifisert ved hjelp av en Agilent DNA 1000-serien II-analyse og henholdsvis Qubitfluorometer (Invitrogen). Hvert bibliotek ble fortynnet til 8 nM for sekvensering på en Illumina Genome Analyzer II følgende fremstillingen anbefalte protokollen. Innhentet bilder ble analysert og basen kalles bruker Illumina gitt GA rørledning programvare OLB 1.6.0 med standardinnstillingen. Den rå leser fra MethylCap-seq ble sendt til GEO database som tiltredelse antall isGSE31418.
250-400 bp DNA brøkdel av den forsterkede fraksjonen var gel-renset. Hvert bibliotek ble fortynnet til 8 nM for sekvensering av Illumina Genome Analyzer II følgende fremstillingen anbefalte protokollen. Innhentet bilder ble analysert og base kalles bruker Illumina gitt GA rørledning programvare OLB 1.6.0 med standardinnstillingen. Den rå leser fra MethylCap-seq ble sendt til GEO databasen (tiltredelse antall GSE31418).
Kartlegging av Sequence Reads
Menneskelig genomsekvens og kartinformasjon (februar 2009, GRCh37 /hg19) ble
