Abstract
Cellesyklus protein uttrykk spiller en viktig rolle i patofysiologien av livmorhalskreft. Imidlertid er det få studier som har forsøkt å korrelere bruken av disse biomarkører med den kliniske progresjon av tumoren.
Mål
1) For å analysere ekspresjon av Ki-67, p53 og p16
INK4a i livmorhalskreft, 2) å relatere den relative uttrykk for disse proteinene samt kliniske parametre med den fasen av sykdommen, og 3) å bestemme HPV DNA utbredelse og subtype distribusjon.
Metoder
Tissue Micro-Arrays (TMA) fra pasienter med invasiv livmorhalskreft (ICC) og kontroller ble analysert. HPV DNA-påvisning ble utført ved PCR og in situ hybridisering. Ki-67, p53 og p16
INK4a ble analysert ved immunhistokjemi; kliniske data ble hentet fra diagrammet gjennomgang
Resultater
Avansert tumorstadium (III og IV) var sterkt assosiert (p 0,005). med høy alder ( 55 år), med mer enn fire svangerskap og med manglende formell utdannelse. HPV-DNA ble funnet i 94,3% av tilfellene med de mest utbredte typer er HPV16 (67,5%), etterfulgt av HPV33 (12,0%) og HPV35 (3,6%). Høy uttrykk for Ki-67 og p16 var mer vanlig i de avanserte Figo stadier (p = 0,023). Kvinner med HPV16 tendens til å være yngre (50,9 år, SE 1,9) enn kvinner med andre typer (59,9 år, SE 2,8).
Konklusjon
Vi fant at Ki-67 og p16 uttrykk uavhengig av hverandre ble forbundet med tumorstadiet. Vi har også registrert at ca 1/3 av livmorhalskreft i denne brasilianske kohort ikke var assosiert med HPV-typer direkte målrettet av de nåværende HPV-vaksiner
Citation. Amaro-Filho SM, Golub JE, Nuovo GJ, Cunha CB, Levi JE, Villa LL et al. (2013) En komparativ analyse av kliniske og molekylær Faktorer med Stage av livmorhalskreft i en brasiliansk Cohort. PLoS ONE 8 (3): e57810. doi: 10,1371 /journal.pone.0057810
Redaktør: Valli De Re, Centro di riferimento Oncologico, IRCCS National Cancer Institute, Italia
mottatt: 07.09.2012; Godkjent: 26 januar 2013; Publisert: 07.03.2013
Copyright: © 2013 Amaro-Filho et al. . Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering: Grant Support : AFN og SAF var forskere i den internasjonale AIDS Research and Training Program, som støttes av Fogarty International Center, National Institutes of Health (NIH) Research Grant to D 43 TW000010-23-AITRP. Dette arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra LIPMED-IOCFiocruz, RJ, Brasil, og Lewis Foundation (fra Dr Gerard J Nuovo Laboratory). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
til tross for lovende resultater oppnådd i løpet av de siste tiårene med screening av asymptomatiske kvinner ved celleprøver og mer nylig med bruk av vaksiner mot HPV, er livmorhalskreft fortsatt en vanlig sykdom med ca 530 000 nye tilfeller og 275.000 dødsfall per år [1]. Den klassiske forvaltning av invasiv livmorhalskreft (ICC) innebærer å vurdere tumorutbredelse som inkluderer tumorstørrelse, dybden av invasjonen, microvascular plass tumorinvasjon, spre seg til regionale lymfeknuter, og grad av differensiering. Behandlingen av livmorhalskreft er betinget på evaluering av den kliniske fasen av svulst i henhold til klassifiseringen av International Federation of gynekologi og fødselshjelp (FIGO). For tidlige stadier-(FIGO I-IIA) enten kirurgi eller radioterapi (RT) anvendes, mens for sen-trinn (FIGO IIB-IV) kjemoterapi er indisert [2]. Imidlertid har klinisk staging visse begrensninger på grunn av variabler som inter-observatør variabilitet. Avvik er rapportert hos opptil 25% av tilfellene i tidlig stadium sykdom og 65-90% i avansert (≥IIB) sykdom [3], [4].
Imaging teknologier, for eksempel computertomografi og ultralyd har blitt vedtatt for å bedre den kliniske iscenesettelsen nøyaktigheten av livmorhalskreft. Imidlertid har enkelte studier har rapportert lav følsomhet og høye falske negative resultater med disse metodene [2]. Dermed er nye prediktive markører for å identifisere pasienter med høy risiko for tilbakefall, dårligere prognose, og for å optimalisere sykdomshåndtering, spesielt tidlig invasiv livmorhalskreft (ICC).
Vedvarende infeksjon med visse humant papillomavirus typer (spesielt typene 16 og 18) har blitt godt dokumentert som et nødvendig co-faktor for livmorhalskreftutvikling. De høyrisiko HPV-typer er i stand til å påvirke de komplekse veier som til slutt fører til en invasiv kreft, delvis på grunn av evnen av E6- og E7-virale onkoproteiner å drive cellene inn i S-fase [5]. E7 forbinder med retinoblastom-protein (pRb), som er en tumor suppressor protein relatert til flere store kreft. pRb hindrer cellen fra å replikere skadet DNA ved å hindre dens progresjon langs cellesyklus gjennom G1 (første gap fase) til S (syntese fase) [6] – [9] og er involvert i å forebygge overdreven cellevekst ved å inhibere cellesyklusprogresjon inntil cellen er klar til å deles når pRb binder og hemmer E2F-familien av transkripsjonsfaktorer [10], [11]. Etter E7 og pRb forening, E2F proteiner er i stand til senere å transaktiverer cellulære cyclin-dependet kinaser (CDK) proteiner, som kreves for viral DNA replikasjon, som kan føre til kreft [6]. Videre ber, er E7 også i stand til å kommunisere med andre proteiner involvert i celle proliferasjon som histon deacetylases, komponentene i AP1 transkripsjon komplekset og cyklin-avhengige kinase-inhibitorer, inkludert p21 og p27 [12]. E6 er i stand til å formidle p53 ubiquitinering og degradering. Dette, i sin tur, reduserer effektiviteten av det cellulære DNA-skade reaksjon og tillater akkumulering av sekundære mutasjoner som i sin tur øker risikoen for kreftdannelsen [5].
Antigen KI-67 også kjent som Ki -67 eller MKI67 er et kjerneprotein som hos mennesker er kodet av MKI67 genet og er strengt forbundet med celleproliferasjon. Ki-67-proteinet er til stede under alle aktive faser av cellesyklusen (G1, S, G2, og mitose), men er fraværende i hvilende celler. Det har vist seg å være en pålitelig prediktiv faktor for tumorutvikling. Dermed blir Ki-67 proliferasjon indeks som gjengir prosentandelen av tumorceller som er aktivt prolifererende, er en vanlig brukt markør for å skille benign fra ondartede svulster i diagnostisk patologi [13] – [15]. P16
INK4a er et cyklin-avhengig kinase inhibitor som virker som en tumor suppressor ved binding til cyclin-avhengige kinaser som CDK4 og CDK6, hindrer fosforylering og etterfølgende inaktivering av retinoblastom protein (pRB), hos mennesker blir kodet av CDKN2A gen og spiller en viktig rolle i regulering av cellesyklusen. Dette genet genererer flere transkripsjon varianter som varierer i sine første eksoner. Nylig en studie funnet flere nye gener til å bli forskjellig uttrykt i livmorhalskreft og ble overuttrykt i livmorhalskreft, bekreftet av immunhistokjemi som MMP3, UBE2C og p16 protein [16]. Diffuse p16
INK4a uttrykk har vært knyttet til høyrisiko HPV (HR-HPV) infeksjon, spesielt i høy klasse cervikal intraepitelial neoplasi og kreft [17] -. [19]
Proteinet P53, kjent som protein 53 eller tumorprotein 53, er en tumor suppressor protein hvor det regulerer cellesyklusen og således fungerer som en tumor suppressor som er involvert i å forebygge kreft. P53 har en viktig rolle i å bevare stabilitet ved å forhindre genom mutasjon. Hos mennesker er p53 kodet av TP53 genet ligger på den korte arm av kromosom 17. I trykklette celler, p53-nivåer holdes lav gjennom en kontinuerlig nedbrytning av p53 imidlertid Dersom TP53-genet er skadet, tumor suppresjon sterkt redusert [20] . TP53-genet kan også bli skadet i celler av mutagener øker sannsynligheten for at cellen skal begynne decontrolled divisjon. Mer enn 50 prosent av humane tumorer inneholder en mutasjon eller sletting av TP53-genet. I livmorhalskreft, E6 HPV binder oncoproteinet til p53 og fremmer dens degradering av ubiquitin proteolyse vei [21] – [24]. Noen patogener, som HPV kan også påvirke p53 protein uttrykk. Motstridende resultater har blitt publisert om p53 uttrykk, noen studier har vist en positiv korrelasjon av p53 med høy klasse kreft og livmorhalskreft, mens andre erklærer ingen signifikante assosiasjoner [21], [25].
I denne studien var utført for å undersøke hypotesen at proteinene som er involvert i cellesyklus Ki-67, p53 og p16
INK4a er overuttrykt i cervixuteri av pasienter med kreft i livmorhalsen og, mer spesifikt, for å evaluere korrelasjonen mellom disse biomarkører med FIGO trinnet og HPV genotype. Videre sosio-demografiske, atferdsmessige og kliniske egenskaper fra studiepopulasjonen ble også analysert, derfor våre viktigste mål var 1) å analysere uttrykk for Ki-67, p53 og p16
INK4a i livmorhalskreft 2) for å søke etter en differensial uttrykk som kan bistå i vurderingen av klinisk svulst staging etter FIGO klassifisering, og 3) å bestemme HPV DNA genotypefordeling i denne populasjonen.
Materialer og metoder
Vevsprøver og data samlingen
studien materialet bestod av 130 prøver tilfeldig valgt fra arkivene til Fernandes Figueira Institute, Oswaldo Cruz Foundation, Rio de Janeiro, Brasil. Prøver fra 87 pasienter som oppnås ved hals biopsi eller conization mellom 2003 og 2008 ble histopathologically bekreftet av en kirurgisk patolog som invasiv livmorhalskreft. Førti-tre pasienter som gjennomgår hysterektomi for benign leiomyomata sykdom brukt som kontroller.
sosiodemografiske og helsedata ble hentet fra pasientens individuelle diagrammer. Følgende data ble samlet inn: alder, historie og paknings år med tobakksrøyking, historie alkoholforbruk, prevensjonsmidler (hormonelle), alder av første samleie, antall graviditeter, utdanningsnivå, HIV-1 serologi og FIGO stadium. The Institutional Review Board (IRB) fra Oswaldo Cruz Foundation (Fiocruz), (CAE 0024.0.011.000-09-, Rio de Janeiro, Brasil) godkjent bruk av skriftlig samtykke i denne studien.
Tissue Micro-Array (TMA) blokk konstruksjon.
Tissue Micro-Array blokkene ble bygget som beskrevet av Pires et al, 2006 [26]. Kort fortalt alle hematoxylin-eosin (HE) lysbilder ble re-undersøkt av en annen erfaren patolog og to morfologiske representative felt av invasiv livmorhalskreft ble valgt og omkranset med en tusj. To kjerner fra hvert tilfelle ble stanset ut fra donor blokkene. Den tilsvarende H E lysbilder ble belagt med en spesialbygd 16 gauge Becton-Dickinson PrecisionGlide® kanyle (1,1 mm
2 område). Etterpå Kjernene ble festet med dobbeltsidet klebetape på en datamaskingenerert papir gitter å gi innretting på blokken formen, som deretter ble fylt med flytende parafin. Tre um tykke seksjoner ble oppnådd fra en optisk rotator standard mikrotom (Leica, Bensheim, Tyskland). Hver blokk gitt 40-50 lysbilder; bare eksempler som viser den opprinnelige lesjon ble anvendt. Tilsammen to TMA blokker ble bygget, en med livmorhalskreft biopsier og den andre med kontroller der fravær av cervikal intraepitelial neoplasi (CIN) ble bekreftet av gjennomgang av hematoxylin og eosin farget lysbilde.
DNA-ekstraksjon .
fra hver parafin innebygd cervical biopsi, 4 skiver 5 mikrometer ble kuttet. I korthet, etter awoksing med xylen ved 48 ° C i 2 timer, etanol (100%, 70% og 50%) ble tilsatt for å fjerne resterende xylen, etterfulgt av rehydratisering og sentrifugering ved 12 000 rpm per 15 minutter i hvert trinn. Pelleten ble resuspendert i oppløsning med 300 pl proteinase K (100 ug /ml) og 10% SDS i 48 timer ved 48 ° C. Fem mikroliter av proteinase K (200 ug /ml) ble tilsatt etter 24 timer. DNA ble isolert ved en fenolekstraksjon inneholdende 300 pl fenol /kloroform /isoamylalkohol (25/24/1), etterfulgt av sentrifugering (12000 rpm per 10 min) for å oppnå den vandige fase. Etter gjentagelse av disse rensetrinn to ganger, ble DNA utfelt ved 20 ° C i 24 timer med 100 pl natriumacetat (endelig konsentrasjon 7,5 M) og to ganger den vandige fase volum 100% etanol. DNA-pelleten ble samlet opp ved sentrifugering i 15 minutter ved 12000 rpm ved 4 ° C, vasket med 70% etanol og resuspendert i 50 ul TE-buffer (10 mM Tris-base, 1 mM EDTA, pH 7,5). DNA kvantitet og kvalitet ble analysert ved Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA).
PCR forsterkning og HPV genotyping.
Forsterkning av HPV-L1 konsensus regionen ble utført med generisk primere GP5 + og GP6 + (syntetisert av Invitrogen, São Paulo, SP, Brasil) for å generere et PCR produkt av ca 150 bp som tidligere beskrevet (syntetisert ved Invitroge
n
, São Paulo, SP, Brasil, frem primer sekvens : GP5 +
TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC
; reverse primer sekvens GP6 +
GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC
) [27], [28]. Negative prøver med disse primere ble utsatt for nestet PCR ved hjelp av en første runde forsterkning med primere PGMY09 og PGMY11, tidligere beskrevet (syntetisert av Invitrogen, São Paulo, SP, Brasil, frem Primersekvensen: PGMY11A
GCACAGGGACATAACAATGG
, PGMY11B
GCGCAGGGCCACAATAATGG
, PGMY11C
GCACAGGGACATAATAATGG
, PGMY11D
GCCCAGGGCCACAACAATGG
, PGMY11E
GCTCAGGGTTTAAACAATGG
; revers primer sekvens: PGMY09F
CGTCCCAAAGGAAACTGATC
, PGMY09G
CGACCTAAAGGAAACTGATC
, PGMY09H
CGTCCAAAAGGAAACTGATC
, PGMY09I
GCCAAGGGGAAACTGATC
, PGMY09J
CGTCCCAAAGGATACTGATC
, PGMY09K
CGTCCAAGGGGATACTGATC
, PGMY09L
CGACCTAAAGGGAATTGATC
, PGMY09M
CGACCTAGTGGAAATTGATC
, PGMY09N
CGACCAAGGGGATATTGATC
, PGMY09P
GCCCAACGGAAACTGATC
, PGMY09Q
CGACCCAAGGGAAACTGGTC
, PGMY09R
CGTCCTAAAGGAAACTGGTC
, HMB01
GCGACCCAATGCAAATTGGT
) [29]. Hver PCR-analyse tatt med som en positiv kontroll Hela cellulært DNA (HPV18-DNA) og en negativ kontroll mal. Integriteten av prøven DNA ble verifisert ved forsterkning av 110 bp-fragment av β-globin-genet med primere PC03 og PC04. Amplifikasjonene ble utført i en GeneAmp PCR System 9700 thermal cycler (Applied Biosystems), og alle PCR-produktene ble analysert ved elektroforese i 1,5% agarose-gel.
En endelig reaksjonsvolum på 75 ul ble renset ved GF -1 DNA Recovery Kit (Vivantis, Oceanside, CA, USA), for å genotype. For å sekvensere en løsning som inneholder 3,2 pmol av hver primer (GP5 + eller GP6 +), 5-10 ng av PCR produkt, 2,5 mL Big Dye Terminator v 3.1 Cycle Sequencing Kit (delenummer 4337455, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) og MilliQ vann komponenter for endelig volum på 10 ul ble fremstilt. Blandingene ble analysert på en ABI Prism 3730 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) tilgjengelig på DNA PDTIS /Fiocruz Platform [30]. Justeringer ble hentet direkte fra on-line Blastn server eller fylogenetisk analysert av programvaren MEGA5 [31]. Saker ikke forsterket av PCR eller ute av stand til å bli sekvensert hvor sjekkes for HPV DNA ved hjelp av INNO-LIPA HPV Genotyping v2 (Innogenetics, Gent, Belgia). Tre tvetydige saker ble også analysert av PapilloCheck Kit (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Tyskland).
Immunohistochemistry (IHC).
IHC reaksjoner ble utført på TMA silane-belagt lysbilder (Sigma , St. Louis, MO, USA) som tidligere beskrevet [32]. I korthet, ble objektglassene avvokset i xylen, rehydrert gjennom en gradert etanolserie, vasket med destillert vann og deretter behandlet i oppløsning med metanol inneholdende 0,3% hydrogenperoksid i 10 minutter for å fjerne endogen peroksidaseaktivitet. Antigen gjenfinning for alle immunhistokjemi ble utført ved å koke vev med Target Retrieval Solution (Dako, Carpinteria, CA, USA). Ikke-spesifikk antistoff-binding ble inhibert ved å inkubere seksjoner med serumfritt protein-blokk (1% BSA). Vevssnitt ble sekvensielt inkubert over natten i et fuktet kammer ved 4 ° C temperatur med de primære spesifikke antistoffer (fortynninger): monoklonalt antistoff anti-Ki67 (klar til bruk – Dako, Carpinteria, CA, USA), monoklonalt antistoff anti-p53 (1 /10 – Santa Cruz, bioteknologi, Inc-CA-USA) og monoklonalt antistoff anti-p16
ink4a (1/250 – Santa Cruz, bioteknologi, Inc-CA-USA). Et sekundært biotinylert multi antistoff ble påført i 30 minutter, etterfulgt av streptavidin-peroksidase i 30 min. Den enzymatiske reaksjon ble utviklet i en oppløsning av 3.3′-diaminobenzidin (DAKO, Glostrup, Danmark) eksponering i 5 minutter, med unntak av p53 hvor FastRed kromogen ble anvendt (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Lysbilder ble kontra med hematoxylin i 1 minutt, vasket i destillert vann, dehydrert i gradert etanol, klarert med xylen og permanent montert i Entellan (Merck, Darmstadt, Tyskland).
Vurdering av IHC lysbilder og celletelling
To uavhengige observatører vurdert og kvantifisert uttrykk for alle immunhistokjemiske flekker. Ki-67 og p53 flekken inkludert eneste atomvåpen farging. To representative områder av hver kjerne ble tellet manuelt av observatørene og for Ki-67, klassifisert som: negativ, mindre enn 25% positive cancercellekjerner, 25-50% er positive eller mer enn 50% positive. For p53 poengsystemet var som følger: negativ, mindre eller lik 5% positive cancercellekjerner, 5-25% positiv og større enn 25%. Immunhistokjemisk uttrykk for p16
INK4a ble kvantifisert i henhold til nærværet (positiv eller negativ), cellulær beliggenhet (nukleær og cytoplasmisk), fargeintensitet (svak, moderat og sterk) og dispersjon mønster (diffus eller fokal).
Statistisk analyse.
data ble analysert ved hjelp av Stata /SE 10,1 programvare. Statistiske sammenligninger ble utført ved anvendelse av parametriske Student t-test for kontinuerlige variabler, så vel som den chi-square test og den Fishers eksakte test for kategoriske variabler. En test for trend over ordnede gruppene (nptrend) ble tatt med for å se om de biomarkører fulgte en lineær trend uttrykk for FIGO stadium. Den Univariated logistisk regresjon ble brukt for å bekrefte sammenhengen mellom demografiske, atferdsmessige og kliniske faktorer med ICC og kontrollgrupper. Følsomhet (sannsynlighet for en sann positiv), spesifisitet (sannsynlighet for en sann negativ) og Youden sin indeks (YI) (YI = følsomhet + spesifisitet-1), som et mål på generell diagnostisk effektivitet, ble beregnet for konsensus diagnoser av FIGO III- IV og II-IV. Alle p-verdiene er tosidig; p-verdier 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
studiepopulasjonen egenskaper analyse
Denne studien inkluderte 130 kvinner (gjennomsnittsalder 51,1 ± 13,1 år gammel,. område 24- 88). For å sammenligne kliniske variabler og FIGO stadium, ble sosio-demografiske, atferdsmessige og kliniske karakteristika samlet fra individuelle pasient diagrammer. Men noen data var ikke tilgjengelig for alle pasienter som følgende (N -%): alder (6 til 4,6%), utdanningsnivå (41 til 31,5%), tobakksrøyking (41 til 31,5%), alkoholforbruk (43 til 33,1 %), antikonsepsjonsmidler (48 til 36,9), første samleie (53 til 40,8%), tall graviditeter (33 til 25,4%), HIV-1-status (86 til 66,2%) og FIGO stadium (17 til 19,5%).
Sammenslutning av histopatologi og FIGO stadium med sosiodemografiske og kliniske kjennetegn
I denne populasjonen, ved univariated logistisk regresjonsanalyse, ble det bemerket at tobakksrøyking, alkoholforbruk, prevensjon (p-piller ), alder av første samleie, og HIV-1-status var relatert til livmorhalskreft. Men det var en statistisk signifikant sammenheng mellom livmorhalskreft og kontrollgrupper i følgende kategorier: pasienter eldre enn 55 (OR = 16,6; CI95% = 3,5 til 79,2; p 0,001), kvinner uten formell utdanning (OR = 8,0; CI95% = 1,5 til 43,4; p = 0,016) og kvinner med mer enn fire graviditeter (OR = 7,2; CI95% = 2,4 til 21,5; p = 0,001) (tab 1). Videre blant pasienter med livmorhalskreft, var det en statistisk signifikant sammenheng mellom økt antall graviditeter (3 eller flere), samt en manglende formell utdanning når man sammenligner FIGO stadium jeg å FIGO stadier II-IV (p = 0,005).
HPV prevalens og distribusjon
To av de 43 kontrollprøver gitt utilfredsstillende resultater for DNA-ekstraksjon og ble ekskludert fra HPV DNA utbredelsen analyser. Tre prøver negative ved PCR med GP5 + /6 + var positive for viral DNA av en nestet PCR ved hjelp PGMY09 /11 primere. Den totale forekomst av HPV DNA i kontroll- og livmorhalskreft gruppene var 29,3% (12/41) og 95,4% (83/87), respektivt. HPV-genotype fordelingen i kontroll og i livmorhalskreft gruppene er vist i tabell 2. Infeksjoner med mer enn to typer av HPV i en enkelt prøve var sjeldne; 2/92 HPV positive prøvene viste flere infeksjoner. I kontrollgruppen, HPV type 16 viste den høyeste prevalens (72,7%), etterfulgt av typene 35, 67 og 6 (9,1% for hver). Hos kvinner med cervical cancer, HPV type 16 var også den mest fremherskende (67,5%), etterfulgt av typen 33 (12,0%) og type 35 (3,6%). HPV type 58 og 6 ble funnet i to tilfeller (2,4%), mens HPV 18, 31, 52, 67, 70, 69 og 30 ble funnet i bare ett tilfelle (1,2%). Kvinner infisert med HPV16 viste en statistisk signifikant sammenheng (p = 0,012) med yngre gjennomsnitt (50.9, SE 1,9) sammenlignet med kvinner med andre typer (59.9, SE 2,8).
Protein uttrykk analyse
den relative graden av protein uttrykk som bestemmes av immunhistokjemi ble korrelert med FIGO stadium og til HPV genotype i HPV positive livmorhalskreft.
Ki-67 uttrykk evaluering
Ki-67 flekker var kjernekraft og til stede i 34 (82,9%) av kontrollene og 82 (94,3%) av livmorhalskrefttilfellene. Men det var en markant forskjell i fordelingen mønster av Ki-67 i livmorhalskreft versus normale cervical epitel. Nærmere bestemt, ble Ki-67 positive celler begrenset til basal epitellaget på vanlig cervical vev, mens, i livmorhalskreft prøvene, Ki-67 ekspresjon var diffus og til stede i de fleste kreftceller fra den basale aspektet til overflaten av ondartet svulst. For å differensiere og kvantifisere den uttrykksmønster mellom livmorhalskreft prøver og kontroll, ble Ki-67 ekspresjon tilordnet bokstaver (A, B, C, D og F). «A» referert til ingen Ki-67 signal, «B» betegnet positive celler til stede utelukkende i basal /parabasal epitel, «C» er representert positiv celle bevis i basal /parabasal og mellomliggende epitel, «D» henvist til et signal fra basen til overflaten av epitel med mindre enn 25% av positiv kjernen, «E» henvist til et signal fra basestasjonen til overflaten av epitel med 25% til 50% av positiv kjernen og «F» ble knyttet til en signal fra basestasjonen til overflaten av epitel med mer enn 50% av positiv kjerne (figur 1). Som det fremgår i tabell 3, var det en signifikant økning trend med Ki-67 ekspresjon med en øket FIGO trinn (np
trend = 0,008) (tabell 3)
A, B og C:. Kontroll epitel; D, E og F: invasiv livmorhalskreft epitel. (A) Negativ; (B) Strict positiv flekk i basal laget; (C) positiv flekk i basal og mellomliggende lag; (D) mindre enn 25% av positive celler over hele epitelet; (E) 25-50% av positive celler over hele epitelet; (F) mer enn 50% av positive celler over hele epitel (DAB, brun flekk,. Mag 40 ×).
P16
INK4a uttrykk evaluering
Ulike mønstre av p16
ble observert INK4a signal basert på mobilnettet plassering (kjernekraft og cytoplasmatic), fargeintensitet (svak, moderat og sterk) og spredning mønster (diffust eller fokale). Bare fem (11,6%) av kontrollene var p16
INK4a positivt, i motsetning, 83 (95,4%) av livmorhalskreft vev ble positive (figur 2). En diffus mønster av p16 uttrykk var statistisk (p 0,001) forbundet generelt med livmorhalskreft (85,5%) tilfeller versus kontrollene. Saker som utgjør en moderat p16
INK4a uttrykket var mer vanlig i den avanserte FIGO stadier III-IV (56,5%), mens svake uttrykk var assosiert med tidlig FIGO stadium I (66,7%) (p = 0,023) (tabell 4). Det ble ikke observert mellom mobil plassering mønster av p16
INK4a flekker og enten svulsten klasse eller FIGO stadium (p = 0,152 og p = 0,183, henholdsvis)
A:. Kontroll epitel; B, C, D, E og F: invasiv livmorhalskreft epitel. (A) Negativ; (B) Focal moderat kjernekraft og cytoplasmatic uttrykk; (C) Diffus svak kjernekraft og cytoplasmatic uttrykk; (D) Diffus moderat cytoplasmatic uttrykk; (E) Diffus sterk kjernekraft og cytoplasmatic uttrykk; (F) Negative (DAB, brun flekk,. Mag 40 ×).
P53 uttrykk evaluering
Positiv p53 uttrykk ble påvist i 43 av 87 (49,4% ) livmorhalskrefttilfeller og negativ i alle kontroll tilfeller. p53 ble uttrykt utelukkende i den kjernefysiske rommet i alle positive tilfeller. Farging av mindre enn 5%, 5-25% og mer enn 25% av positiv kreft cellekjerner ble observert i 26 (29,9%), 15 (17,2%) og 2 (2,3%), henholdsvis av livmorhalskreft (Figur 3) .
A, B, C og D: invasiv livmorhalskreft epitel. (A) negativ; (B) mindre enn 5% kjernekraft flekken positivitet; (C) 5% til 25% nukleær flekk positivitet; (D) høyere enn 25% (FastRed, rød flekk, Mag 40 ×, Fig A Mag.20 ×)
Ki-67, p16
INK4a og p53 klinisk ytelse
.
Vi har også undersøkt klinisk ytelse (sensitivitet, spesifisitet og Youden-registeret) av ulike positive endepunkter for p16
INK4a, Ki-67 og p53 flekker, og markørene kombineres, i forhold til konsensus diagnoser av FIGO III- IV (FIGO III +) og FIGO II-IV (FIGO II +). Kombinere positive intensitet endepunkt for p16
INK4a farging med Ki-67 og p53, farging økt spesifisitet og nøyaktighet for FIGO III + og FIGO II + deteksjon (tabell 5). Den høyeste sensitivitet og spesifisitet ble observert i de avanserte stadier (FIGO II +) ved Youden indeks; tilpasse en cutoff på mer enn 25% av cellene uttrykker Ki-67 og p16
INK4a med moderat eller sterk intensitet 93,5%, 100% og 93,5%.
Forholdet mellom HPV genotyper til immunhistokjemiske funn
Vi undersøkte om HPV 16 eller visse kombinasjoner av HPV-genotypene kan påvirke uttrykket av biomarkører analysert i ICC prøvene. Høy uttrykk for Ki-67 ble assosiert med andre HPV-typer, sammenlignet med HPV 16 eller når segregert i ulike grupper (HPV 16 enkelt infeksjon, andre med høy risiko, lav risiko og ubestemmelig, og flere infeksjoner) som vist i tabell 6. Ingen sammenheng ble observert mellom P16
INK4a uttrykk og HPV gruppe genotyper. Det var ingen signifikant korrelasjon med p53 uttrykk og HPV genotype (tabell 6).
Diskusjoner
Vi har observert en økende uttrykk for Ki-67, p53 og p16
INK4a i invasiv kreft eksemplarer sammenlignet med normale kontroller. Siden Ki-67 er en klassisk markør proliferasjon og har vært brukt for å skille godartet versus maligne tumorer på forskjellige områder, er den sterke korrelasjonen av Ki-67 og cervikal kreft forventet [33]. Ki-67 ble uttrykt i alle lag av plateepitel med invasiv kreft. Det ble også funnet i normalt vev, men er begrenset først og fremst til parabasal lag regionen. Disse dataene er i overensstemmelse med flere studier, hvor Ki-67 har utstilt høy forekomst av spesifisitet og sensitivitet som en biomarkør for cervikal intraepitelial neoplasi [33], [34].
p53 proteinet ikke viser merking i normal epitel. I de invasive livmorhalskreft prøver fant vi at 49,4% (43/87) var positive, men viser ekspresjon i langt færre kjerner av carcinomceller i forhold til uttrykket mønster av andre markører. Litteraturen beskriver motstridende data for p53 uttrykk i livmorhalskreft, med priser som spenner fra svært lave prosenter til 62,0% av kreftceller [21], [25]. Selv om grunnlaget for denne markant forskjell på resultatene er uklart, kan det forholde seg til ulike årsaker, inkludert ulike vev fiksering, samt antigen gjeninnhentingsmetodene og vedtatt skjære punkter [35]. Det er også kjent at i mange typer av kreft hos mennesker, er p53 overuttrykt som et resultat av mutasjoner som modifiserer deres transkripsjonelle aktivitet, som kan i sin tur påvirker andre regulatoriske proteiner for eksempel MDM2 (også kalt HDM2 for det humane protein) . Imidlertid, i tilfelle av livmorhalskreft, synes det å være annerledes, ettersom E6 proteinet fra HPV høy risiko er forbundet med ubiquitinering av p53 og etterfølgende nedbrytning av proteasomet. Likevel er dette ikke utelukker muligheten for at noen livmorhals karsinom vise punktmutasjoner av p53 [36]. Våre data om p53-ekspresjon er i overensstemmelse med tidligere studier som ved Bahnassy et al. (2007) og Skomedal et al. (1999) som fant henholdsvis 44,2% (19/43) og 55,4% (41/74) av invasiv livmorhalskreft prøver positive for p53 og i begge studiene var positiv i kontrollprøver [33], [37 ingen sak ].
Når det gjelder p16
INK4a, flere studier har dokumentert overekspresjon, med en diffus og sterk mønster, ikke bare i høygradig cervikal intraepitelial lesjoner, men også med invasiv kreft i forhold til de vanlige prøvene [13] , [18], [33]. Vår studie bekrefter denne økningen i uttrykket i invasiv kreft i forhold til kontrollene prøvene. Vi fant 95,4% (83/87) av invasiv kreft var positive for p16
INK4a sammenlignet med 11,6% (5/43) av kontrollene. Noen papirer har observert p16
INK4a uttrykk i normalt vev [36], [38], [39]. Likevel er det vel etablert at ikke dysplastiske epitelceller kan uttrykke p16
INK4a, for eksempel under visse fysiologiske betingelser, slik som forkortelse av telomerer i eldre vev. Her er uttrykk for p16
INK4a umiddelbart induserer cellesyklus arrest og kan til slutt indusere apoptose med sluttresultatet blir et samlingsmønster med svak intensitet [40].
Når det gjelder klinisk stadium av livmorhalskreft, vår
