Abstract
PTEN er en potent tumor-suppressor protein. Aggressiv og metastatisk prostatakreft (PC) er assosiert med en reduksjon eller tap av ekspresjon PTEN. PTEN reduksjon skjer ofte uten genmutasjoner, og dens nedregulering er ikke fullt ut forstått. Heri viser vi at PTEN er inkorporert i lasten i exosomes avledet fra kreftceller. PTEN er ikke oppdaget i exosomes avledet fra normale, noncancerous celler. Vi fant at PTEN kan overføres til andre celler gjennom exosomes. I celler som har en reduksjon eller fullstendig tap av PTEN uttrykk, er det overført PTEN kompetent til å gi tumor undertrykkelse aktivitet for å akseptorvesikler celler. I PC-pasienter, viser vi at PTEN er innarbeidet i lasten i exosomes som sirkulerer i blodet. Interessant, normale personer har ingen PTEN uttrykk i deres blod exosomes. Videre fant vi at prostata-spesifikt antigen (PSA) er innlemmet i PC-pasienter og normale fagenes blod exosomes. Disse data tyder på at exosomal PTEN kan kompensere for PTEN tap i PTEN manglende celler, og kan ha diagnostisk verdi for prostatakreft
Citation. Gabriel K, Ingram A, Austin R, Kapoor A, Tang D, Majeed F , et al. (2013) Regulering av tumorsupressorproteinene PTEN gjennom Exosomes: A Diagnostic Potensial for prostatakreft. PLoS ONE 8 (7): e70047. doi: 10,1371 /journal.pone.0070047
Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 12 november 2012; Godkjent: 17 juni 2013; Publisert: 25.07.2013
Copyright: © 2013 Gabriel et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble tildelt av prostatakreft Canada og er stolt finansiert av Movember Foundation, Grant # D2013-2 for K.Al. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PC) er den hyppigst diagnostisert kreft og den nest høyeste årsaken til kreft dødsfall hos menn [1], [2], [3]. Tapet av en kopi av PTEN genet bidrar til prostata startfasen, mens ytterligere reduksjon i PTEN uttrykk støtter invasjonen og metastatisk oppførsel av PC [4]. PTEN er et protein /lipid fosfatase. Dens protein tyrosin fosfatase domenet har egenskapene til en dual-spesifisitet fosfatase som er i stand til å dephosphorylate både tyrosin og serin /treonin rester. Den viktigste lipidsubstrat av PTEN er fosfatidylinositol (3,4,5) trifosfat (PIP-3). Den viktigste mekanisme for tumorundertrykkelse ved PTEN er opprettholdelsen av cellulært PIP-3 på et lavt nivå, og dermed hemme PI3K-AKT-reaksjonsveien og å bidra til cellulær apoptose eller cellesyklus-stans [5]. Reduksjonen av PTEN protein ekspresjon forekommer ofte i fravær av genmutasjoner [6], [7], [8]. Til sammen ca 70-80% av primære PC svulster har en reduksjon i PTEN uttrykk [9]. Forskjellige mekanismer som bidrar til reduksjon av PTEN-ekspresjon i tumorer er blitt identifisert, inkludert promoteren metylering [10], [11], og negative regulator-proteiner [12]. Det har blitt foreslått at andre, ukjente mekanismer kan fungere i mange tumorer [10], [11]. Våre resultater peker mot en ny mekanisme som kreftceller regulere PTEN uttrykk gjennom exosomes.
Kreftceller slipper blemmer i sine omgivelser. Mikrovesikler er en rekke med skur vesikler, som genereres ved direkte spirende av cellemembranen. Exosomes er en annen, forholdsvis mindre type vesikkel som er lagret i multivesikulære organer, og frigjøres når multivesicular legeme sikringer med cellemembranen [13], [14]. Exosome innholdet gjenspeiler dens cellulære kilde [15], [16]. Interessant nok, kan disse innhold er onkogene proteiner, som vi tidligere har rapportert [17], [18], eller tumor suppressor proteiner, som rapportert heri. Således kunne man forutse at molekylene overført ved exosomes gi en ervervet fenotype til akseptor-celler, som fører til positive eller negative effekter i forhold til tumorprogresjon avhengig av naturen av molekylene som overføres. The last med exosomes kan dermed endre balansen mellom onkogene og tumorsupressorproteinene egenskaper. Analysen av en slik last kan indikere status ekspresjon av tumor-suppressor-proteiner i ondartede celler uten å direkte prøve malignitet. Exosomes er fremstår som en viktig kilde for kreft biomarkører og er beskrevet som biomarkør skattekister for PC [19]. Det har blitt foreslått at PTEN status i PC-pasienter kan være en prediktor for pasienter med risiko for kreft metastase eller tilbakefall etter radikal prostatektomi [20], [21], [22]. I flere tiår nå, har prostataspesifikt antigen (PSA) blitt brukt som standard biomarkør for påvisning av PC [23]. Imidlertid er bruken av PSA begrenset av mangelen på spesifisitet og manglende evne til å skille mellom lat og livstruende former av sykdommen på diagnosetidspunktet [24]. PSA screening kan redusere dødeligheten av PC, men det er også assosiert med en høy grad av overdiagnostikk og overbehandling [25], [26]. I sin studie, Harvey et al. konkluderte med at PSA-test har en høy falsk positiv og betydelig falsk negativ hastighet [27]. Denne mangelen på prognostisk verdi fører til en enorm økning i unødvendige biopsier og i overbehandling av lavrisiko PC pasienter [23], [25]. Gitt disse funnene, er det et stort behov for å finne nye markører for PC eller å øke spesifisiteten av PSA-test.
Materialer og metoder
Materialer
Monoklonale antistoffer for PTEN, AKT, Flotilin-1, p27, og cyclin D1 ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Alle de tilsvarende HRP-konjugert sekundære antistoffer ble kjøpt fra Cell Signaling. Alexa Fluor 488 sekundære antistoffer ble kjøpt fra Molecular Probes (Eugene, OR).
Cellelinjer.
DU145, PC-3 (human prostata kreft celler), U87 (human glioblastom astrocytom) og menneskelige normale celler [menneskelige aorta endotelceller (HAOEC), menneske aorta glatte muskelcellene (HAOSMC) og human prostata epitelceller (HPEC)] ble kjøpt fra ATCC (Manassas, Virginia). DU145 celler med PTEN knockdown (DU145Kd) og DU145 cellene transfektert med uspesifikke siRNA ble opprinnelig generert i en av våre laboratorier (D.T.) på Hamilton Kidney Research Centre (HKRC), McMaster University. DU145Kd celler ble generert ved hjelp av PTEN siRNA uttrykt av en retroviral basert H1 promoter-drevet shRNA vektor, og kontroll DU145-celler ble infisert med et retrovirus som uttrykker ikke-spesifikk siRNA, slik som tidligere beskrevet [12]. CHO og CHO-EGFR-celler ble oppnådd tidligere som en sjenerøs gave fra Dr Guha laboratorium på The Hospital for Sick Children, Toronto. Alle cellelinjer brukt i denne studien ble dyrket i mikrovesikkelassosiert-utarmet FBS (ved sentrifugering over natten på 100 000
g
). For standard kultur ble celler dyrket i Dulbeccos modifiserte essensielle medium (DMEM) supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS).
isolering av Exosomes fra det kondisjonerte medium og blodplasma
Exosomes ble samlet fra den media fra forskjellige cellelinjer og fra humant plasma, som tidligere beskrevet [18], [28], [29]. I korthet, ble kondisjonert medium oppsamlet fra cellene ved omtrent 80% konfluens, med mindre annet er angitt, og dette materialet ble underkastet to etterfølgende sentrifugeringer ved 300
g
i 5 minutter og deretter ved 12.000
g
i 20 minutter for å fjerne celler og rester. Til slutt, exosomes ble oppnådd etter sentrifugering i 2 timer ved 100000
g
og deretter vasket to ganger med et stort volum av fosfatbufret saltvann (PBS). Denne protokollen samler spesifikt exosomes og ekskluderer store blemmer. De exosome proteinene isolert ble målt ved hjelp av Bradford assay (Bio-Rad).
PTEN Expression Profil
Cellene (DU145, DU145Kd, og DU145 med kontroll siRNA) og de primære celler (HAOEC , HAOSMC og HPEC), sammen med deres tilsvarende exosomes, ble lysert i 10 minutter på is i en lyseringsbuffer inneholdende: 10 mM Tris (pH 6,8), 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 30 mM natriumpyrofosfat, 2% (vekt ./vol) SDS, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), og 1 mM Na
3VO
4. Lysatene ble oppløst ved SDS-PAGE og utsatt for immunblotting med kanin monoklonale antistoffer for PTEN. Immundeteksjon ble oppnådd ved hjelp av riktig HRP-konjugert sekundært antistoff og chemiluminescence pluss kit (ECL kit, Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, Storbritannia), hvoretter blotter ble skannet og proteinbånd kvantifisert ved hjelp av Antall Én programvare (Bio-Rad, CA) .
Påvisning av Signa hendelser knyttet til PTEN
for å vurdere effekten av exosomes som inneholder PTEN på DU145Kd celler, sistnevnte ble belagt i 100 mm skåler i en tetthet på 2 × 10
5-celler /ml, dyrket kort, og sultet i 24 timer (enten i DMEM supplert med 0,5% FBS, eller i serumfritt DMEM). Kulturene ble deretter stimulert over natten med forskjellige konsentrasjoner av exosomes avledet fra DU145-celler. Etter exosome behandling, ble cellelysater forberedt og analysert for signale effektor innhold ved hjelp av anti-fosfo-AKT antistoffer (cellesignalisering), i henhold til leverandørens anbefalinger. Påvisning av uttrykket av p27 og cyclin D1 ble utført ved hjelp av de samme eksperimentelle innstillinger som brukes for påvisning av Pakt.
Fluorescent Imaging av Exosome Opptak
For
in vitro
analyse av PTEN ekspresjon ble cellene dyrket i kammers objektglass (Nalge Nunc, New York). Kulturene ble vasket med PBS og fiksert i forvarmet (37 ° C) 4% (wt./vol) paraformaldehyd (PFA) i fosfatbufret saltløsning i 5 minutter. Deretter ble de vasket tre ganger i PBS, og antiquenching ble utført i 50 mM NH
4Cl i 10 minutter ved romtemperatur. Deretter ble cellene vasket to ganger i PBS og inkubert med BSA [1% (wt./vol) i PBS] i 30 minutter. Inkubering med et primært antistoff ble utført i 1 time, etterfulgt av vasking i PBS, og deretter inkubering med et sekundært antistoff i 30 minutter. Etter farging ble platene montert ved hjelp av Dako fluorescerende monteringsmedium og sett under et konfokalt mikroskop for å påvise tilstedeværelsen av exosomal innhold (PTEN) i mottakercellene.
PTEN Activity Assay
Lysater fra DU145Kd celler, som ble behandlet med exosomes fra DU145 cellene ble utsatt for immunoutfelling hjelp PTEN antistoffer (cellesignalisering) og Protein G Sepharose. PTEN-aktivitet ble vurdert ved hjelp av de vannløselige substrat DiC8PtdIns (3, 4, 5) P3 (Echelon). De frigitte frie fosfater ble målt med BIOMOL grønn-reagens og normalisert mot en reaksjon inneholdende bare PIP3 substrat [12].
Påvisning av PTEN mRNA
DU145Kd-celler ble behandlet med exosome preparater avledet fra DU145, etterfulgt av omfattende vasking og ekstraksjon av RNA ved bruk av Trizol reagens (Invitrogen, New York). RT-PCR-analyse ble utført ved anvendelse av en enkelt-trinns metode (Qiagen, CA) hvor PTEN ble påvist ved anvendelse av primersettene: forstand 50-ATGACAGCCATCATCAAAGAG-30 og antisens 50-GTGCCACTGGTCTATAATCCAG-30 [12]. Reaksjonene ble utført i 50 pl med den første Taq aktivering ved 95 ° C i 30 minutter, etterfulgt av 30 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 30 sekunder, primer-hybridisering ved 60 ° C i 1 minutt og forlengelse ved 72 ° C i 30 sekunder. Produktene ble løst i 1% agarosegel og fotografert. GAPDH ble brukt som intern kontroll ved hjelp av primer settene: fornuftig 50-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-30 og antisense 50-TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT-30
Proliferation Assay
Analysen spredning ble utført ved hjelp av en analysesett (Chemicon. ) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet, 0,1 x 10
4 DU145Kd celler ble sådd i en 96-brønners plate; etter 24 timer ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av exosomes avledet fra DU145-celler. Andre DU145Kd celler ble behandlet med DU145Kd-avledede exosomes for å vise effekten av exosomes med downregulated PTEN. DU145-celler ble anvendt som en kontroll for å vise evnen til exosomes for å kompensere for PTEN nedregulering i DU145Kd. Denne prosedyren ble brukt for U87 og PC-3 celler.
prostatakreftpasienter og friske personer
Denne studien støttes av etisk godkjenning fra McMaster University etisk brett (REB # 02-2174) . Deltakerne ble informert om hensikten med studien, og skriftlig samtykke er innhentet fra alle personer som deltok i studien. Prøver fra 30 PC-pasienter ble anvendt i denne studien. Pasientene hadde avansert (T3 /T4) tumor stadium. Blodprøver ble oppsamlet før prostatektomi, og tumorvev ble oppsamlet etter kirurgi og hurtigfrosset i flytende nitrogen. Kliniske poster som Gleason score, Ptil, tumorstørrelse, tumor histopatologiske klasse og metastase ble samlet. Prøvene ble samlet i henhold til McMaster University etiske standarder, og pasienten samtykke ble innhentet før prøvetaking. Åtte friske frivillige menn i alderen 50-65 (matche PC pasientprøver) ble brukt i denne studien; alle var uten noen historie av kreft og med vanlige PSA-nivåer.
Statistical Analysis
Alle forsøk ble gjengitt i det minste tre ganger med lignende resultater. De kvantitative data er presentert som gjennomsnittsverdien av replika innenfor representative forsøk ± SEM. Statistisk signifikans ble evaluert ved anvendelse av en datastyrt to-halet t-test. Forskjellene ble ansett signifikant ved P . 0,05
Resultater
PTEN er uttrykt i Exosomes fra PC-Cells, men ikke normale celler
Vi bestemte statusen PTEN i følgende PC celler: DU145, DU145 stabilt transfektert med PTEN siRNA (DU145Kd) for PTEN downregulation eller knockdown, og DU145 transfektert med kontroll siRNA [12]. Exosomes ble oppsamlet fra det kondisjonerte medium av hver celletype, og like proteinkonsentrasjoner fra cellene, og de exosomes ble underkastet SDS-PAGE og immunblotting, deretter probet med PTEN antistoffer. Begge DU145Kd celler (figur 1A) og exosomes (Figur 1b) viste en nedregulering av PTEN uttrykk i forhold til villtype DU145 celler og DU145 celler transfektert med kontroll siRNA. Vi vurderte også fosforylering status av PTEN i exosomes avledet fra disse cellene. Fosforylering av PTEN holder det i en lukket tilstand beskyttet mot nedbrytning; senere PTEN vil være tilgjengelig for å bli aktivert i cytoplasma, fell cellemembranen ved defosforylering, og deretter sette i gang cellesignalisering [30], [31]. Vi fant ut at PTEN innlemmet i exosomes fosforyleres (figur 1B, midtre panelet). Flotilin-1 ble anvendt som en kontroll for lasting exosomes [32]. De spredning forekomst av DU145 foreldre celler, DU145 med kontroll siRNA og DU145Kd celler (figur 1C) viser at PTEN knockdown cellene viste en signifikant høyere spredning rente enn de to andre celletyper. Menneskelige primære celler (normal, ikke-kreft celler), som for eksempel menneskelige endotelceller fra aorta (HAOEC), menneskelige glatte muskelceller fra aorta (HAOSMC), og menneskelige prostata epitelceller (HPEC) uttrykker PTEN, men vi fant ut at PTEN ikke er innarbeidet inn i exosomes av disse cellene (figur 1D). Dette kan bety at inkorporering av PTEN i exosomes er en eksklusiv karakteristisk for kreftceller, men dette funnet krever ytterligere utforskning. Figur 1E er en scanning elektronmikroskop viser utgytelsen av exosomes fra kreftceller.
A. DU145 PC celler ble transfektert med angitt siRNA. Cellene transfektert med PTEN-spesifikk siRNA viste en klar knockdown av PTEN ekspresjon, mens celler transfektert med kontroll mismatch siRNA viste ingen reduksjon i PTEN uttrykk. B. Exosomes avledet fra DU145, DU145Kd, og DU145 med kontroll siRNA viser samme mønster av PTEN uttrykk som observert med den cellen hvor de stammer fra. PTEN innlemmet i exosomes er fosforylert; fosforylering beskytter PTEN mot nedbrytning, og det kan aktiveres ved defosforylering ved overføring til andre celler. Exosomes er positive for Flotilin-en. C. Forskjeller i spredning av DU145, DU145 med kontroll siRNA og DU145Kd ble vurdert, med betydelig høyere spredning utstilt ved DU145Kd. D. Menneskelige primære celler, HAEC, HASMC og HPEC, og deres exosomes ble profilert for PTEN uttrykk. Alle tre cellene har PTEN uttrykk, men PTEN er ikke uttrykt i sine exosomes. Uttrykket for både celler og deres exosomes ble normalisert med Flotilin-1. E. En scanning elektronmikroskop viser utgytelsen av exosomes fra DU145 cellene.
inter Overføring av PTEN av Exosomes
For å undersøke inter utveksling av PTEN, exosomes avledet fra mors DU145 PC cellene ble samlet opp ved å bruke standard prosedyre for sentrifugering. DU145Kd celler ble inkubert med exosome preparat avledet fra paren DU145-celler. Den tilsynelatende opptak av microvesicular PTEN av DU145Kd celler ble observert ved hjelp immunocytochemistry (bakgrunn subtraksjon ble utført ved hjelp av ubehandlede celler som kontroll, og fluorescens ble trukket fra både ubehandlede og behandlede celler for å vise oppkjøpet av PTEN i exosome behandlede celler), og immunoblotting (figur 2 A og B).
DU145Kd celler ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av exosomes avledet fra DU145-celler i 24 timer. A. DU145Kd-celler ble dyrket i glide kamre og behandlet med DU145-avledet exosomes. Cellene ble vasket to ganger med fosfatbufret saltvann (PBS), og immunocytochemistry ble utført med PTEN primære antistoffer og Alexa fluor 488 sekundære antistoffer. Cellene ble visualisert ved hjelp av konfokal mikroskopi (hvis-immunfluorescens). DU145Kd celler kjøpt PTEN (grønn) etter inkubasjon med Du145-avledet exosomes. B. DU145Kd ble dyrket i 100 mm skåler og behandlet på samme måte som i (A) med forskjellige konsentrasjoner av DU145-avledet exosomes. Cellene ble vasket med PBS, lysert med RIPA-lyseringsbuffer, og analysert for ekspresjon ved hjelp av PTEN immunobloting. DU145Kd celler kjøpt PTEN uttrykk. C. Exosomes ha en hemmende virkning på transkripsjonen av PTEN. DU145Kd ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av exosomes avledet fra DU145 parentale celler. Total RNA ble oppsamlet fra de behandlede celler, DU145-celler, og DU145 med kontroll siRNA. RT-PCR ble utført ved anvendelse av primere spesifikke for PTEN. GAPDH ble anvendt som en kontroll. RT-PCR ble utført ved hjelp av en ett-trinns RT-PCR kit. Produktene ble løst på en 1,1% agarosegel. D. Exosomes overføring PTEN til U87 PTEN
– /- celler. U87-celler ble dyrket i glide kamre og behandlet med DU145-avledet exosomes. Cellene ble farget med PTEN antistoffer og Alexa fluor 488 sekundære antistoffer, og deretter ble visualisert ved hjelp av et konfokalt mikroskop (IF-immunofluorescent). U87-celler som ikke uttrykker PTEN som de har mutasjoner i begge PTEN alleler, kjøpte PTEN uttrykk (grønn).
For å sikre at økningen av PTEN i DU145Kd celler etter inkubasjon med DU145-avledet exosomes ikke resulterte fra stimulering av PTEN transkripsjon av exosomes, utførte vi RT-PCR for PTEN i DU145Kd celler behandlet med ulike konsentrasjoner av DU145-avledet exosomes. Vi observerte en hemmende effekt på PTEN transkripsjon (figur 2C). For ytterligere å sikre at vi observerte det intercellulære overføring av PTEN-protein, i motsetning til stimulering av transkripsjon, har vi brukt glioblastoma cellelinje U87, en null genotype, som inneholder en mutasjon i begge alleler PTEN [33]. Når behandlet med exosomes avledet fra DU145 cellene, U87-celler testet positivt for PTEN (figur 2D). Disse data bekrefter at det oppkjøpte PTEN i DU145Kd og U87 er utelukkende knyttet til det intercellulære overføring av PTEN protein gjennom exosome utveksling. I tillegg har vi behandlet prostatakreft cellelinje PC-3, som er PTEN null, med exosomes avledet fra DU145 cellene, viser kjøpet av PTEN (figur S1). Vi har fastslått PTEN ekspresjon i exosomes fra forskjellige kreftcellelinjer, dvs. lungekarsinom (A549), brystkreft (MDA-MB-231), kolorektal karsinom (HCT116), og pankreas adenokarsinom (BxPC-3) (fig S2, A), for å viser at PTEN er utgytt gjennom exosomes fra andre kreftcelletyper. Vi behandlet også PC-3 celler med exosomes avledet fra HCT116 kolorektal karsinom celler, og funnet ut at PC-3 celler kjøpt PTEN uttrykk (Figur S2, B).
Exosomes Transfer Aktiv PTEN mellom kreftceller
for å vurdere om PTEN overføres via exosomes er aktiv, behandlet vi DU145Kd celler med ulike konsentrasjoner av exosomes avledet fra DU145 cellene. De behandlede celler ble underkastet immunoutfelling for PTEN. Immunopresipitatene ble vurdert for PTEN aktivitet ved anvendelse av et lipid-fosfatase analyse. DU145Kd celler viste en betydelig økning i fosfatase-aktivitet ved behandling med exosomes avledet fra DU145-celler (figur 3A).
A. DU145Kd celler ble behandlet med exosomes avledet fra DU145-celler. PTEN ble immunopresipitert med PTEN antistoffer, og PTEN fosfatase aktivitet ble vurdert ved hjelp av de vannløselige substrat DiC8PtdIns (3, 4, 5) P3 (Echelon). De frigitte frie fosfater ble målt med BIOMOL Grønn reagent og normalisert mot en reaksjon som bare inneholder PIP3 underlaget. Resultatene representerer gjennomsnittet av tre forsøk ± SEM, og de er signifikant ved P 0,01. B. PTEN-positive exosomes (fra DU145) forårsaket en reduksjon i AKT-fosforylering i akseptor-celler (DU145Kd); AKT fosforylering redusert til et nivå som kan sammenlignes med DU145 celler med kontroll siRNA, og (henholdsvis to siste banene til høyre,) foreldre motstykke DU145 cellene. C. DU145Kd celler ble sådd ut i 100 mm cellekulturskåler og behandlet med forskjellige konsentrasjoner av DU145-avledet exosomes. Cellene ble lysert og analysert ved immunobloting med P27 og cyklin D1 antistoffer. PTEN indusert ekspresjon av p27 og redusert ekspresjon av Cyclin D1 (C). De to hendelsene førte til cellene inn i celle-syklus arrest. Uttrykket ble normalisert til p-aktin.
For å undersøke om den overførte PTEN er kompetent til å endre cellesignalisering i akseptor celler, ble DU145Kd celler behandlet med exosomes avledet fra DU145 cellene i 24 timer. Fosforyleringen status av fosfatidylinositol-3′-kinase /serin-treonin-kinase (AKT), den viktigste substrat for PTEN, ble vurdert. I DU145Kd celler, fant vi en nedgang i fosforylering av AKT som nådde nivåer sammenlignes DU145 foreldre celler (PTEN positiv) og DU145 celler transfektert med kontroll siRNA (figur 3B).
For å finne ut om den overførte PTEN påvirker nedstrøms cellesignalveier i forbindelse med AKT, vurdert vi cyclin-avhengig kinase (CDK) inhibitor p27 (KIP1) uttrykk. p27 regulerer celleproliferasjon, celle motilitet, og apoptose. En reduksjon i p27-ekspresjon observert i de fleste dødelige epiteliale cancere og er assosiert med dårlig pasientresultatene [34]. Pakt regulerer negativt p27 å støtte antiapoptotic aktivitet i kreft progresjon. Vi fant ut at p27 uttrykk økes i DU145Kd celler ved behandling med DU145-avledet exosomes (Figur 3C). Det har blitt rapportert at G1 cellesyklus-stans koordineres av PTEN lipid fosfataseaktivitet ved oppregulering av p27 og ved PTEN proteinfosfatase aktivitet gjennom nedregulering av cyclin D1 [35]. Vi fastslått at cyclin D1 er nedregulert i DU145Kd celler behandlet med Du145 exosomes, som forventet (figur 3C).
PTEN Overført gjennom Exosomes påvirker biologiske funksjoner i akseptor Cells
For å vurdere om de biokjemiske endringer observert i figur 3 er forbundet med modifikasjon av biologisk funksjon, vurderte vi effekten av PTEN-positive exosomes (avledet fra DU145-celler) på proliferasjonen av tre cellelinjer som mangler PTEN uttrykk. DU145Kd, PC-3, og U87-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av DU145 exosomes, og spredningsrater ble hemmet i alle tre cellelinjer på en doseavhengig måte (figur 4 A, B og C). Exosomes mangler PTEN uttrykk, utledet fra DU145Kd, viste liten effekt på spredning priser.
Tre cellelinjer som mangler PTEN uttrykk, DU14Kd, PC-3, og U87 (A, B og C, henholdsvis), ble behandlet med ulike konsentrasjoner av DU145 exosomes. En proliferasjonsanalyse ble utført ved anvendelse av et analysesett. I alle tre cellelinjer, ble sprednings priser inhibert på en konsentrasjonsavhengig måte. De spredningsrater DU145Kd celler nådd et nivå som tilsvarer DU145 cellene, som viser at exosomes helt kompensert for tapet av PTEN (A). Exosomes avledet fra DU145Kd, som mangler PTEN, viste ingen virkning på celleformering i alle tre cellelinjer. Resultatene er vist som gjennomsnittet av tre forsøk ± SEM. Forskjellene fra kontrollen (0 exosomes) er betydelig * P 0,05, ** P. 0,01, og # forskjellene er ikke signifikante
Innlemmelse av PTEN inn Exosomes er regulert av Onkogener
for å undersøke mekanismen for inkorporering av PTEN inn exosomal last, testet vi rollen som onkogene reseptoren epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) i denne prosessen. Vi brukte kinesiske hamstere (CHO) cellelinje, som er spontant udødelig [36] og har ingen EGFR uttrykk. CHO-celler stabilt transfektert til å uttrykke EGFR hadde tilsvarende nivåer av PTEN uttrykt i exosomes som foreldre CHO-celler (figur 5A). Ved stimulering av CHO-EGFR-celler med forskjellige konsentrasjoner av EGF (5, 10 og 20 ng /ml), var det en økning i mengden av PTEN i exosomes, på en konsentrasjonsavhengig måte (figur 5B). I tillegg har vi testet effekten av inhibering av EGFR i DU145-celler på PTEN inkorporering i exosomes. Vi behandlet cellene med EGFR-inhibitor CI-1033 (5, 10 uM). Hemme EGFR redusert inkorporering av PTEN inn exosomes i en konsentrasjonsavhengig måte (figur 5C).
A. Innføring av EGFR i CHO-celler viste ingen effekt på ekspresjonen av PTEN i celler og exosomes. B. Stimulering av CHO-EGFR-celler med de indikerte konsentrasjoner av EGF (5, 10 og 20 ng /mL) førte til en økning i PTEN inkorporering i exosomes. C. DU145-celler ble behandlet med to konsentrasjoner (5 uM, 10 uM) av CI-1033, en irreversibel inhibitor av EGFR. PTEN inkorporering i exosomes ble inhibert på en konsentrasjonsavhengig måte; Flotilin-en ble brukt som en lasting kontroll for exosome konsentrasjon.
PTEN Status i PC-pasienter kan vurderes ved hjelp Blood Exosomes
For å studere rollen exosomes i vurderingen av PTEN status på PC-pasienter, samlet vi blod fra 30 PC-pasienter før prostatektomi, og 8 normale personer som samsvarer med alder av pasientene (50-65 år). Den normale frivillige hadde ingen historie av kreft eller tidligere dokumentert forhøyet serum PSA. Blodet ble fraksjonert, og plasmaet ble anvendt som en kilde for exosomes. PTEN-exosomes ble immunopresipitert ved bruk av PTEN antistoffer og Sepharose protein-G. Inkorporering av PTEN inn i exosomes fra PC pasienters blod ble bestemt ved immunblotting, og forskjellige nivåer av ekspresjon ble påvist blant pasienter. Interessant, fant vi PTEN uttrykk i exosomes fra alle PC-pasienter, og ingen PTEN uttrykk i exosomes fra blodet til normale individer (Figur 6 A, B); t-test analyse viste resultatene var meget signifikant P 0,001. I tillegg kan vi vurdere konsentrasjonen av PTEN i PC-pasientenes exosomes ved immunoblotting med standard konsentrasjoner av rekombinant PTEN, og konsentrasjonen av PTEN ble bestemt som (ng av PTEN /mg protein exosome) (figur 6C).
A. Exosomes ble samlet inn fra plasma på 30 pre-prostatektomi PC pasienter og 8 friske personer. Exosomes ble underkastet standard-immunblotanalyse for status av PTEN. Figuren viser evne exosomes å vurdere status for PTEN. Som vist i figuren, de friske personer hadde ingen PTEN uttrykk i sine plasma exosomes. B. Optiske tettheter for PTEN band (A) ble vurdert ved hjelp Mengde-en programvare. Exosomal-PTEN uttrykk i PC-pasienter og friske personer ble beregnet som gjennomsnittet ± SEM, og forskjellene mellom de to gruppene var svært signifikant (P 0,001). C. PTEN-konsentrasjonen i exosomes fra PC pasientens blod ble fastslått ved immunoblotting standard konsentrasjoner av rekombinant PTEN sammen med pasientprøvene. Resultatene er gjennomsnittet av PTEN uttrykk ± SEM og er statistisk signifikante P. 0,01
Blood exosomal-PTEN Gir et enkelt verktøy for å vurdere PTEN Status
PC svulster er heterogene i PTEN uttrykk som vist i (figur 7 A, B, C). PTEN status i svulstene av fire PC-pasienter ble bestemt ved immunhistokjemi. Figuren viser vanskeligheten med å danne en konklusjon om PTEN ekspresjon ved hjelp av denne teknikken. PTEN uttrykk i blod exosomes av de samme pasientene blir vurdert i Figur 7D, viser en enkel og direkte måte å vurdere PTEN konsentrasjon i PC-pasienter. Figur 7E er en scanning elektronmikroskop viser homogen befolkning på blod exosomes.
Dette tallet gir en sammenlignende studie av PTEN vurdering ved hjelp exosomal PTEN, og Immunohistochemistry av PC pasient svulster. Immunhistokjemi av tumorvev fra fire PC-pasienter demonstrerer heterogenitet av PTEN uttrykk i prostatakreft. A. Eosin hematoxylin farging. B. Farging med sekundære antistoffer. C. Farging med PTEN spesifikke antistoffer, piler indikerer PTEN positive celler. D. Vurdering av PTEN uttrykk ved hjelp plasma exosomes fra de samme pasientene. E) En scanning elektronmikroskop mikroskopibilde som viser homogen populasjon av exosomes hentet fra pasientblod. Exosomes var festet til et dekkglass ved hjelp polylysin, og behandlet for scanning elektronmikroskopi.
Uttrykk av PSA i Exosome Emner av PC Pasienter og normale personer
Ved hjelp av 30 PC-pasienter og 8 normale personer, vi har oppdaget PSA i exosomes fra både PC pasienter og friske personer (figur 8A): optiske tettheter av PSA-band (fra figur 8A) ble brukt for statistisk analyse. Forskjellene i exosomal PSA mellom PC-pasienter og friske personer var ikke signifikant (figur 8B).
