Abstract
Bakgrunn
Micro RNA er små, ikke-koding, enkelt-strandet RNA som negativt regulere genekspresjon på post-transkripsjonsnivået. Siden MIR-143 ble funnet å være nedregulert i prostatakreftceller, ønsket vi å analysere sitt uttrykk i menneskelig prostata kreft, og teste evnen til MIR-43 for å arrestere prostatakreft cellevekst in vitro og in vivo.
Resultater
uttrykk av MIR-143 ble analysert i menneskelige prostata kreft ved kvantitativ PCR, og ved in situ hybridisering. MIR-143 ble innført i kreftceller in vivo ved elektroporering. Bio-analyse og luciferase-baserte analyser ble anvendt for å bestemme MIR-143 mål. Vi viser i denne studien at MIR-143 nivåer er inverst korrelert med avanserte stadier av prostatakreft. Redning av MIR-143 uttrykk i kreftceller fører til pågripelsen av celleproliferasjon og oppheving av tumorvekst i mus. Videre viser vi at virkningen av MIR-143 er mediert, i det minste delvis ved hemning av ekstracellulære signalregulerte kinase-5 (ERK5) aktivitet. Vi viser her at ERK5 er en MIR-143 mål i prostatakreft
Konklusjoner
MIR-143 er som et nytt mål for prostatakreft behandling
Citation:.. Clape C, Fritz V, Henriquet C, Apparailly F, Fernandez PL, Iborra F et al. (2009) MIR-143 forstyrrer ERK5 signalering, og opphever prostatakreft Progresjon i Mus. PLoS ONE 4 (10): e7542. doi: 10,1371 /journal.pone.0007542
Redaktør: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, USA
mottatt: 23 juni 2009; Godkjent: 29 september 2009; Publisert: 26 oktober 2009
Copyright: © 2009 Clape et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. De bevilgende myndighet hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Agence Nationale pour la Recherche (ANR physio2006), Institut National du Cancer (INCA) Association pour la Recherche contre le Cancer (ARC), og Fondation pour la Recherche Medicale (FRM). CC er støttet av en bevilgning fra Region Languedoc-Roussillon, og ARC. PLF er støttet av Ministerio de Ciencia e Innovacion FIS-PI080274
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (CAP) er den hyppigste kreft og den nest største årsaken til kreft dødsfall hos menn i vestlige land. Androgen reseptor (AR) er sannsynligvis en avgjørende faktor i prostata kreft progresjon. Prostatakreft er i utgangspunktet avhengig av androgener for vekst, og androgen ablasjon bevirker regresjon av tumoren [1], sannsynligvis gjennom inaktivering av transkripsjon av AR målgener. Imidlertid er ofte forbigående respons på denne behandlingen og mange menn utvikle tilbakevendende androgen-uavhengig prostatacancer, som har en svært dårlig prognose fordi ingen effektiv behandling er for tiden tilgjengelig (se [2] for gjennomgang).
Nylig en ny klasse av små RNA er blitt beskrevet, betegnet microRNAs, som er funnet å regulere mRNA-funksjonen ved å modulere både mRNA stabilitet og oversettelsen [3], [4]. Mirnas er små, ikke-kodende, enkelt-trådede RNA av ~22 nukleotider som negativt regulerer genekspresjon ved post-transkripsjonelle nivå, primært gjennom baseparing til i det 3 «ikke-translatert region (UTR) av mål-mRNA. Økende bevis indikerer at mirnas kontrollere grunnleggende cellefunksjoner, som strekker seg fra proliferasjon til apoptose [5], [6], [7]. Omtrent 50% av miRNA gener befinner seg i kreft-assosiert genomiske regioner eller i sårbare områder [8] og noen av dem har vist seg å være direkte involvert i kreftutvikling og progresjon [9]. MikroRNA uttrykk profiler også klassifisere svulster av utviklings avstamning og differensiering tilstand [10]. Flere microRNAs har vist seg å ha onkogene egenskaper eller opptre som tumorsuppressorgener [9], [11]. Dette er tilfellet for MIR-15A og MIR-16-1, som uttrykk er tapt i avansert prostatakreft. Disse to mirnas viser anti-onkogen aktivitet ved målretting av cyclin D1 og Wnt3A, som er mediatorer av kreftcellevekst og overlevelse [12]. Redusert uttrykk for andre mirnas som MIR-23b, har -100, -145, -221 og -222 er også dokumentert. Videre ektopisk ekspresjon av disse mirnas resulterer i prostata kreftcelle hemming [13]. I motsetning til disse anti-onkogene miRNA, onkogene MIR-106b, eller MIR-32 er blitt identifisert i prostatakreft. Disse miRNA støtte celleproliferasjon og overlevelse av kreft celler trau målretting av p21 /WAF1 og Bim proteiner henholdsvis [14]. Mest interessant er den observasjon at noen miRNA, slik som MIR-141 utskilles av kreftceller, og er funnet i serum fra pasienter med prostatakreft. Disse resultater etablerer måling av tumor-avledet mirnas i serum eller plasma som en ny diagnostisk verktøy for en ikke-invasiv metode for påvisning av kreft hos mennesker [15].
Vi har tidligere vist at en kombinasjonsbehandling ved hjelp av PPARy agonister og HDAC-hemmere fører til hemming av prostatacancer cellevekst hos mus [16]. Global analyse av mikro RNA uttrykk i disse behandlede celler korrelerte økt MIR-143 med vekst arrest. I den foreliggende studien undersøkte vi ekspresjonen av MIR-143 i prostatakreft og funnet at ekspresjonsnivået av MIR-143 ble betydelig redusert. Videre er ekspresjonsnivået var inverst korrelert med histopatologisk karakter i human prostatakreft. Transfeksjon av LNCaP og c4-2 celler in vitro med forløper MIR-143, eller elektroporering av MIR-143 i prostatakreft xenograft i mus viste at MIR-143 bidrar negativt til prostatakreft cellevekst. Til slutt, bioinformatikk analyser identifisert ERK5 som et potensielt mål genet for mir-143. ERK5 er kjent for å fremme cellevekst og proliferasjon i respons til vekstfaktorer og tyrosin-kinase-aktivering. Derfor vedvarende reduserte nivåer av mir-143 i cancerceller kan være direkte involvert i karsinogenese via aktivering av mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) kaskade via ERK5. Tatt sammen disse funnene tyder på at mir-143 kan være en svulst suppressor og en potensiell ny diagnostisk eller prognostisk markør i prostatakreft.
Resultater
Mir-143 uttrykk er redusert i løpet av prostatakreft progresjon
ble det observert en første indikasjon på deltakelse av MIR-143 i prostatakreft redusert ekspresjon av dette miRNA i LNCaP, og c4-2 prostatakreft, sammenlignet med normale epiteliale cellelinjer, som analysert ved kvantitativ RT-PCR (fig. 1A). I samsvar med denne observasjonen, ekspresjon av MIR-143 ble sterkt redusert i human prostata cancer, sammenlignet med normale vev prostata (Fig. 1B). Videre nivåer av transkribert MIR-143 ble omvendt korrelert med histopatologiske karakter i menneskelig prostata kreft, nå deteksjonsgrensen i høy grad kreft (Gleason 7, Fig. 1B). For mer nøyaktig å analysere uttrykk for MIR-143,
in situ
hybridisering ble utført i høy tetthet vev arrays, som inneholder 40 prostatakreft vev vs. 10 normale prostata vev. MIR-143 uttrykk kunne ikke påvises spesifikt i prostatakreftceller av høy Gleason score, mens MIR-143 ble uttrykt i normal prostata epitel, og prostata kjertler (Fig. 1C). Disse resultatene antydet at nedregulering av Mir-143 uttrykk kan være et nødvendig begivenhet for kreftutvikling eller progresjon.
En
, kvantitativ real-time PCR (QPCR) av MIR-143, normalisert til mengden RNU48 mål i prostata kreft cellelinjer. De relative nivåene av miRNA ekspresjon ble målt ved å bestemme ΔCt verdiene av den indikerte cellelinjen versus PNT2 celler. Dataene er gjennomsnitt ± SEM for tre uavhengige eksperimenter. Statistisk signifikans, her og i etterfølgende tall, * 0,05; ** 0,01; *** 0001.
B
, QPCR av MIR-143, normalisert til mengden av RNU48 mål i prostata vevsprøver. De relative nivåene av miRNA ekspresjon ble målt ved å bestemme ΔCt verdiene av den indikerte Gleason prostatakreft versus normal prostata. Dataene er midler ± SEM av elleve prostata prøver for hver gruppe.
C
, representant
in situ
hybridisering farging av MIR-143 i human ikke-tumor og tumor prostata vev. TMA presenterer 40 prostatakreft vev vs. 10 normale prostata vev. (TMA, forstørrelse, 400 ×).
Redusert spredning og økt apoptose i MIR-143-uttrykke prostatakreftceller
Redusert uttrykk i prostatakreft antydet at MIR-143 kan ha anti-proliferative effekter. For å teste denne hypotesen MIR-143 ble ectopically uttrykt i c4-2 og LNCaP prostatakreftcellelinjer. MIR-143 ble uttrykt 5- og 12-ganger høyere i transfekterte LNCaP, og c4-2 celler henholdsvis, sammenlignet med kontrollceller transfektert med enten ikke-relevant miRNA, eller med anti-MIR-143, som er en MIR-143 hemmer (fig. 2A). Det ble ikke observert forskjeller i celle tall når ikke-relevant miRNA eller anti-MIR-143 ble brukt i disse cellene. I skarp motsetning til dette ble celletallet inverst korrelert til uttrykket nivåer av MIR-143 i begge LNCaP og c4-2 cellelinjer (Fig. 2B-C). Dette antydet at MIR-143 regulerer negativt celleproliferasjon. I samsvar med dette, BrdU-inkorporering eksperimenter viste at miRNA ekspresjon resulterer i hemming av DNA-syntese, og derfor oppheving av celle proliferasjon i disse kreftcellelinjer (figur 2D). Interessant nok har disse cytostatisk effekt ble også korrelert med økt celledød i miRNA uttrykkprostatakreftceller, som evaluert ved trypan blå eksperimenter (fig. 2E). Videre viste cellesyklusanalyse en økning i G
0-G
1 befolkningen, samtidig bruk av til en reduksjon i S-fase i MIR-uttrykkende celler 143 (fig. 2F). Interessant, FACS-analyse indikerte en økning i celle-død (fig. 2G). Apoptose ble imidlertid ikke endret i MIR-143, sammenlignet med kontrollceller som bestemt ved innlemmelse annexine eksperimenter (data ikke vist), eller ved caspase tre-nivå 48 timer etter transfeksjon (fig. 2 H). Dette antydet at den observerte celledød er ikke avhengig av apoptose, men heller nekroser arrangementer. Til sammen disse dataene antydet at MIR-143 styrer negativt celleproliferasjon og positivt kontrollerer celledød av prostata kreft celler.
En
, qPCR av MIR-143 i c4-2 celler (hvite striper ) og LNCaP celler (svarte søyler), normalisert til RNU48 48 timer etter transfeksjon med egge MIR (kontroll), MIR-143 forløper eller antimiR-143. Dataene er gjennomsnitt ± SEM for fem uavhengige eksperimenter.
B-C
, Cell vekst i LNCaP (B) eller c4-2 (C) celler i 48 timer etter transfeksjon med egge Mir (svart rombe), MIR-143 forløper (svart kryss) eller antimiR-143 (hvit trekant). Dataene er gjennomsnitt ± SEM for tre uavhengige eksperimenter.
D
, Kvantifisering av BrdU inkorporering 48 timer etter transfeksjon i c4-2 og LNCaP celler i fravær av MIR-143 (øverst), i nærvær av MIR-143 (i midten) eller antimiR-143 (nederst). Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
E
, Blue trypan innlemmelse i c4-2 (hvite søyler) og LNCaP (svarte striper) celler 48 timer etter transfeksjon i fravær eller nærvær av MIR-143 eller i nærvær av antimiR-143.
F
, Andel av celler i ulike faser av cellesyklus i LNCaP og c4-2 cellelinjer 36 timer etter transfeksjon med kontroll 5 (ikke relevant), MIR-143 eller antimiR-143. Lignende resultater ble oppnådd i to uavhengige eksperimenter. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (n = 2-4).
G
, FACS analyse av apoptose i c4-2 (hvite søyler) og LNCaP (svarte striper) celler 48 timer etter transfeksjon i fravær eller nærvær av MIR-143 eller i nærvær av antimiR-143.
H
, relativ aktiv caspase 3 konsentrasjons i c4-2 (hvite søyler) og LNCaP (svarte søyler) celler 48 timer etter transfeksjon i fravær eller nærvær av MIR-143 eller i nærvær av antimiR-143. Konsentrasjonen av aktive caspases 3 er normalisert med den globale proteinkonsentrasjonen.
ERK5 er en MIR-143 målgenets
Vi ønsket å identifisere Mir-143 mål som kan bli innblandet i prostatakreft progresjon. Bioinformatikk analyse indikerte at 3 «UTR av den menneskelige ERK-5 genet havner en antatt enighet stedet for MIR-143 bindende (nukleotider 2917-2932) (fig 3a). For å eksperimentelt validere dette målet, må vi først analysert ERK5 uttrykk i prostata kreft cellelinjer. ERK5 protein ble sterkt økt i LNCaP, og c4-2 prostata kreft celler, sammenlignet med ikke-kreft PNT2 prostata epitelceller (Fig. 3B). Interessant nok ERK5 ekspresjon ble inverst korrelert med MIR-143-ekspresjon i disse cellelinjer (Fig. 1A). Videre analyse i humane prostatacancer i høy tetthet vev matriser viste at ERK5 uttrykk, som analysert ved hjelp av IHC ble sterkt øket i kreft, sammenlignet med normal prostata vev (figur 3C, nedre paneler). Påfallende, ERK5 uttrykk ble omvendt korrelert med Mir-143 uttrykk, som analyseres ved in situ hybridisering, noe som tyder på at ERK5 kan være et
bona fide
Mir-143 mål (Fig. 3C, sammenligne øvre til nedre paneler). For å bevise denne hypotesen overekspresjon eksperimenter ble utført. Ektopisk ekspresjon av MIR-143 i LNCaP, og c4-2 prostatakreftcellelinjer førte til en signifikant reduksjon i ERK5 proteinekspresjon, sammenlignet med celler transfektert med ikke-relevant miRNA, eller med antisense MIR-143. (Fig. 3D). Redusert ERK5 ekspresjon korrelerte med redusert proliferasjon i disse cellelinjer ved ekspresjon av MIR-143 (fig. 2). Videre redusert ERK 5 ekspresjon i mir-143 behandlede celler også korrelert med redusert ekspresjon av juni, som er en kjent ERK5 mål (fig. 3E).
A
, Skjematisk fremstilling av spådd målområde av MIR-143 i 3 «UTR av ERK5 mRNA. Seed-samsvarende sekvens er indikert. H.s ERK5 3’UTR er Homo Sapiens 3’UTRsequence.
B
, Western blot analyse av endogen ERK5 uttrykk i prostata normale og kreftcellelinjer. De relative uttrykk, normalisert til GAPDH, ble målt av Image J programvare som en fold av den indikerte situasjon versus egge MIR. Dataene er gjennomsnitt ± SEM for tre uavhengige eksperimenter. C, representant immunhistokjemisk farging av ERK5, og in situ hybridisering av MIR-143 i etterfølgende deler av høy tetthet vev array.
D
, Western blot analyse av endogen ERK5 uttrykk i c4-2 og LNCaP celler 48 timer etter transient transfeksjon av den indikerte MIR-143. Relativ uttrykk, kvantifisert av Image J programvare er normalisert til GAPDH, og målt ved fold av den angitte situasjon versus egge MIR. Dataene er gjennomsnitt ± SEM for tre uavhengige eksperimenter.
E
, Mål av luciferase aktivitet i COS-celler transfektert med en reporter luciferase genet pGL3 smeltet til ERK-5 3 «UTR mutert eller ikke med økende konsentrasjoner eller Mir-143 (0, 25, 50, 100 nM). Verdien er normalisert til beta-galaktosidase-aktivitet og uttrykt i folden i forhold til fravær av MIR-143. Svarte striper, ERK5 3’UTR, hvite barer, mutant 3 «UTR; data er middel ± SEM for fire eksperimenter utført i tre eksemplarer.
F
, Western blot analyse av endogen c-Jun uttrykk i LNCaP celler 48 timer etter transient transfeksjon av den indikerte MIR-143. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
G
, QPCR av ERK5 i c4-2 celler (hvite søyler) og LNCaP celler (svarte søyler), normalisert til 18 s gen 48 timer etter transfeksjon med pSuper-shNeo (kontroll) eller pSuper-shERK5. Dataene er gjennomsnitt ± SEM for tre uavhengige eksperimenter.
H
, Kvantifisering av BrdU innlemmelse i c4-2 celler (hvite søyler) og LNCaP celler (svarte søyler) 48 etter transfeksjon med pSuper-shNeo (kontroll) eller pSuper-shERK5. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Neste, for ytterligere å demonstrere hypotesen om at de observerte effekter på spredning er et resultat av ERK5 hemming, ble støydempere eksperimenter utført. shRNA uttrykk rettet til ERK5 resulterte i en signifikant reduksjon i celleformering i LNCaP og c4-2, sammenlignet med celler transfektert med ikke-relevante shRNA (fig. 3F). ERK5 Ekspresjonsnivået var redusert ca. 90% i begge cellelinjene transfektert med den spesifikke shERK5 (Fig. 3G).
Til slutt, for ytterligere å bevise at ERK5 er en MIR-143 mål-gen forbigående transfeksjon eksperimenter ble utført ved anvendelse av 3’UTR region av ERK5 inneholdende det antatte MIR-143 samsvarende område, mutert eller ikke, nedstrøms for luciferase-åpne leseramme. Luciferase-aktivitet av de 3 «UTR ERK-Luc konstruktet ble redusert i nærvær av MIR-143, mens luciferaseaktiviteten av mutert -Luc konstruksjonen ikke ble påvirket, noe som tyder på at MIR-143 modulerer ERK5 ekspresjon ved binding til ERK5-3’UTR ( fig 3F).
redning av Mir-143 uttrykk reduserer tumorprogresjon hos mus
for å undersøke effekten av MIR-143 på tumorvekst, ble atymiske nakne mus subkutant podet med prostatakreft LNCaP og c4-2 celler. To uker etter inokulering av cellene, når tumorene nådde et midlere volum på 392 mm
3, MIR-143 rednings eksperimenter ble utført. Intratumoral injeksjon av MIR-143, etterfulgt ved elektroporering som beskrevet i materiale og metoder seksjon resulterte i oppheving eller reduksjon i tumorvekst i mus implantert med LnCap og c4-2-celler henholdsvis (fig. 4A og 4B), mens elektroporering av kontroll non -relevant MIR hadde ingen effekt på tumorvekst (fig. 4A og 4B). På tross av den forventede MIR-143 hurtig nedbrytning in vivo ekspresjon av MIR-143 forble signifikant økt i MIR-143 elektroporerte tumorer (fig. 4C). I samsvar med den observerte reduksjon i tumorvekst, forholdet spredning av LNCaP og c4-2 tumorer ble også redusert, som kvantifisert ved farging PCNA i tumorer elektroporert med MIR-143 (fig. 4D). Endelig, analyse av ERK5 protein nivå ved immunhistokjemi indikerte at ERK5 uttrykket ble redusert i nærvær av MIR-143 i LNCaP og c4-2 svulster (fig. 4E). Til sammen disse resultatene viste at MIR-143 fungerer som en tumor suppressor i prostatakreftceller.
A-B
, tumorvekst av LNCaP (A) eller c4-2 (B) celler injisert subkutant og electroporated tre ganger med ikke-relevant MIR (control, hvit kvadrat) eller MIR-143 forløper (svart rombe). Dataene er gjennomsnitt ± SEM for syv mus analysert per hver gruppe.
C
, QPCR analyse av Mir-143 uttrykk i c4-2 (hvite søyler) og LNCaP xenografter (svarte søyler), normalisert til RNU48. Dataene er gjennomsnitt ± SEM for syv mus analysert per hver gruppe.
D
, Analyse av celleproliferasjon ved PCNA flekker på xenograft deler av atymiske Nude mus injisert subkutant med c4-2 (hvite søyler) eller LNCaP (svarte striper) celler etter tre electroporations med egge MIR eller MIR-143 forløper . Dataene er gjennomsnitt ± SEM for syv mus analysert per hver gruppe.
E
, representant immunhistokjemi farging av ERK5 i c4-2 og LNCaP svulster. Nude mus injisert subkutant med c4-2 (hvite søyler) eller LNCaP (svarte striper) celler etter tre electroporations med egge MIR eller MIR-143 forløper. Dataene er representative for sju mus analysert per hver gruppe. (Forstørrelse, 400 ×).
Diskusjoner
Vi har analysert uttrykket og effekten av MIR-143 på prostatakreft utvikling og progresjon. Noen studier har tidligere vist at MIR-143 kan spille en rolle i tumorgenese siden dens ekspresjon er redusert i flere krefttyper [19]. Vi rapporterer to viktigste funnene i denne studien. Først viser vi at Mir-143 uttrykk er tydelig nedregulert i løpet av prostatakreft progresjon. Screening strategier har resultert i påvisning av prostatakreft ved gradvis tidligere stadier og lavere nivåer av prognostisk risiko [20]. I mange menn, prostata kreft har en lang naturhistorie, mens andre vil utvikle seg til metastatisk scenen og dør av sin sykdom (anmeldt i [21]). Til tross for den aksepterte verdien av å måle prostata-specifc antigen nivåer (PSA) til skjermen for prostata kreftdiagnose, er dens verdi som en prognostisk markør fortsatt et spørsmål om debatt. Andre kreftrelaterte parametere inkludert klinisk staging bruker TNM-systemet, Gleason biopsi score og forbehandling serum prostata-spesifikt antigen (PSA) nivået er for tiden brukes til å klassifisere pasienter som å være lav, mellomliggende gruppe eller høy risiko for utvikling av aggressiv kreft [22] – [24]. Ingen enkelt analyse er i stand til, men å tilstrekkelig identifisere alle pasienter med lokalisert prostatakreft som har en høy sannsynlighet for progresjon etter behandling. Våre funn at MIR-143 er på deteksjonsgrensen i aggressiv prostatakreft kan bidra til å identifisere slike pasienter. I overensstemmelse med våre funn ekspresjon av MIR-143 er blitt funnet å være redusert også i andre krefttyper, så som kreft i tykktarmen [25], B-cellemaligniteter [26], prostatakreft [27], hypofysesvulster [28], eller cervikal kreft [29]. Denne nedreguleringen av MIR-143 i prostata cancerprøver er blitt foreslått for å reflektere den nedre differensiering fasen av tumorvev sammenlignet normalt vev [30]. Videre prospektive studier for å validere MIR-143 som en prediktiv mål av prostatakreft progresjon er garantert.
Den andre store funn i vår studie er observasjonen at redningen av Mir-143 uttrykk i prostatakreftceller resulterer i opphevelse av kreftcellevekst, både in vitro og hos mus. Vi viste for første gang at MIR-143 er en tumor suppressor i mus. Andre studier har pekt på en tumor suppressor rolle MIR-143 i tykktarm og andre kreftceller [26], særlig gjennom hemming av KRAS, og ERK5 proteiner [26], [31]. Det har vist seg at ERK5 kan være en direkte eller indirekte mål for MIR-143 [32]. Vi viser nå, og vi gir nok bevis til å vise at ERK5 er et direkte mål på MIR-143 i prostatakreft. Dette støttes av tilstedeværelsen av MIR-143 bindingssete i 3’UTR av ERK5 mRNA. Videre hemmer MIR-143 ekspresjon av et rapportørprotein når dette bindingssete erstatter 3’UTR av luciferase mRNA. Til slutt blir ekspresjon av ERK5 protein inverst korrelert til MIR-143-ekspresjon i humane prostatakreft. ERK5 har vært implisert i regulering av celleproliferasjon, og er den mest nylig identifiserte MAPKK [33]. Aktivitetene til flere transkripsjonsfaktorer, for det meste er implisert i kreft har vist seg å være regulert av ERK5, inkludert MEF2, c-Fos og Fra1, Sap-1, c-Myc og NF-kappaB [34] – [37]. I samsvar med våre resultater ERK5 overekspresjon er assosiert med metastatisk prostatakreft og induserer spredning, motilitet og invasjon i prostatakreftceller [38].
I sammendraget har vi vist at MIR-143 er en tumor suppressor miRNA i prostatakreft , som kontrollerer cellevekst og overlevelse gjennom modulering av, i det minste delvis ERK5 uttrykk. Redningen av miRNA uttrykket i prostatakreft bør derfor betraktes som nytt mål for prostatakreft behandling.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Alle humane prøver ble kjøpt. Våre leverandører Biochain (Hayward, CA), Cytomix (Lexington, MA) har de nødvendige tillatelsene.
Kliniske prøver
Tretti-sju ikke-paret (13 normal og 24 kreft RNA fra forskjellige pasienter ) og en paret prostata svulst og dens omkringliggende upåvirket vev RNA ble oppnådd fra Biochain (Hayward, CA), Cytomix (Lexington, MA).
Animals., og in vivo electroporation
Mann atymiske nude Mus (Foxn1 nu /nu) (Harlan, Grannat, Frankrike) ble brukt i en alder av 7 uker. Alle prosedyrer ble utført i samsvar med den europeiske konvensjonen om beskyttelse av virveldyr brukes til forsøk og godkjent av Comite d’Ethique du IRCM de Montpellier, som er den lokale etikkutvalg. Xenotransplantater ble etablert av subkutant injisert 2 × 10
6 LNCaP eller c4-2 celler i 100 ul av en Matrigel løsning. Tumor volum-målinger ble tatt hver to dager før elektroporering. Ved aktiv dødshjelp, ble tumorer skåret ut og enten frosset for RNA ekstraksjon eller fiksert i 4% formalin for immunhistokjemi analyse. For intra-xenograft Elektro-, ble musene bedøvet ved intra-peritoneal injeksjon av en ketamin (30 mg /kg) og xylazin (10 mg /kg) oppløsning. 500pmole av MIR-143 forløper eller egge Mir ble injisert i 100 mL PBS inn i xenograft. Før injeksjoner, ble ekkografisk gel påført, transkutane elektriske pulser ble påført ved hjelp av to spesiallagde rustfrie stålplater elektroder plassert på hver side av xenograft som tidligere beskrevet (Takei et al., 2008). Kort fortalt ble 8 firkantet bølge elektriske pulser av 50 msek lengde, og en utgangsspenning på 100 V /cm generert av en electropulsator ECM-830 (BTX, San Diego, CA, USA).
cellekultur og trans
PNT2 prostata epitelisk cellelinje ble oppnådd fra ECACC (Sigma-Aldrich, Lyon, Frankrike). Androgen-sensitive LNCaP og androgen-uavhengig c4-2 menneskelige prostata carcinom cellelinjer ble kjøpt fra ViroMed Laboratories (Minnetonka, MN). Disse cellelinjer ble opprettholdt som tidligere beskrevet [16]. Transfections med MIR-143 forløper, ble anti-MIR 143 (HSA-mir-143, Ambion) utført ved konsentrasjon på 50 nM med Dharmafect 2 (Dharmacon, Lafayette, CO). Kontrollen er en ikke-relevant MIR forløper, som vil bli modnet i en stabil form ved den RNAi maskineri. Den anti-MIR-143 er i stand til å inhibere MIR-143 er tilstede i celler ved hybridisering. For å knockdown ERK5 proteinnivå transfections ble utført med 2 pg plasmid pSuper-shERK5 eller med en negativ kontroll, pSuper-shNeo med JetPEI transfektant. Etter 48 timer ble cellene behandlet med BrdU og deretter fiksert med 4% paraformaldehyde for videre analyse.
RNA isolering, revers transkripsjon og kvantitativ real-time PCR
Total RNA og qPCR eksperimenter ble utført som beskrevet [17] .Den oligonukleotidsekvenser brukes til ulike eksperimenter i dette manuskriptet er tilgjengelig på forespørsel.
Kvantitativ real-Time PCR for moden mikroRNA
cDNA ble revers transkribert fra 10 ng av total RNA prøver ved hjelp av spesifikke primere fra Taq Man mikroRNA Analyser og reagenser fra Taq Man mikroRNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems). Den resulterende cDNA ble forsterket ved PCR ved bruk av Taq-Man mikroRNA Analyse primere med Taq Man universell PCR Master Mix og analysert med en 7300 ABI PRISM Sequence Detector System ifølge produsentens instruksjoner (Applied Biosystems). Ved hjelp av den komparative CT-metoden, brukte vi endogen kontroll (RNU48) for å normalisere uttrykket nivåer av miRNA. Analyse navn for MIR-143 og U48 var som følger:. HSA-mir-143 for MIR-143 og RNU48 for U48 RNA
mikroRNA mål prediksjon
Vi brukte miRBase Targets (http: //microrna.sanger.ac.uk/targets/v5/) og TargetScan (https://www.targetscan.org/) for mikroRNA mål prediksjon.
Mir Reporter luciferase Analyser
den 3’UTR eller mutant 3’UTR av ERK5 ble klonet i Xbal stedet for det pGL3-kontrollvektor, umiddelbart nedstrøms for stoppkodonet av luciferase-kodende sekvens. COS-celler ble ko-transfektert med 0,5 pg av pGL3-baserte vektorer og forskjellige konsentrasjoner av MIR-143-forløper, som angitt, ved hjelp av Lipofectamine 2000. luciferase aktivitetsmålinger ble normalisert for β-galaktosidase-aktivitet for å korrigere for forskjeller i transfeksjonseffektivitet.
immunoblot
proteinekstraksjon, og western blot-analyser ble utført som tidligere beskrevet [18]. Filtrene ble inkubert over natten ved 4 ° C med kanin-anti-ERK5-antistoff (Cell Signal Technology, Danvers, MA) og deretter i 1 time ved romtemperatur med et anti-kanin-peroksidase-konjugat sekundært antistoff. Komplekset ble visualisert med forbedret chemiluminescence (Interchim, Montluçon, Frankrike).
Immunohistochemistry av ERK5
Tissue Arrays (TMA) AccuMax Array inneholder 7 normal og 39 adenokarsinom flekker fra ulike pasienter ble hentet fra Alphelys (Plaisir, Frankrike). For immunhistokjemisk farging ble TMA utarmet av parafin med xylen, rehydrert og kokt (95 ° C, 30 min) i 0,01 M natrium-citrat-buffer. Etter blokkering av Fc-reseptorer med PBS inneholdende 5% geiteserum ble snittene inkubert med anti-ERK5 kanin polyklonalt antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) over natten ved 4 ° C. Immunfarging ble avslørt ved hjelp av peroksydase-konjugert anti-kanin eller anti-mus sekundært antistoff (Jackson Immunoresearch, West Grove, Pennsylvania) og diaminobenzidin kromogen (Dako, Carpinteria, CA) som et substrat. Seksjoner ble kontra med hematoksylin (Vector, Burlingame, CA). Monteringsløsning (Dako) og dekkglass ble lagt til seksjonene.
BrdU flekker
prolifererende c4-2, LNCaP og PNT2 celler ble inkubert i 6 timer med BrdU. Celler dyrket på dekkglassene ble fiksert med 4% formaldehyd i PBS i 15 min ved 4 ° C og deretter vasket i PBS og permeabilisert i 10 minutter i 0,25% Triton X-100 i PBS. Etter permeabiliseringen, ble DNA denaturert i 2N HCl i 10 minutter, og cellene ble inkubert med blokkeringsbuffer (PBS-1% BSA). BrdU ble deretter påvist med anti-BrdU monoklonalt antistoff (Dako, Carpinteria, CA) og visualisert med et FITC-anti-muse-sekundært antistoff (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA).
In situ hybridisering
LNA-modifisert sonder (Exiqon) var 3′-end merket med digoxigenin-ddUTP med terminal transferase med Dig-3′-ende merking kit (Roche Diagnostics, Frankrike). 5 um tynne snitt ble tømt for parafin med xylen og rehydrert i en seriell fortynning av etanol (2 x 100%, 75%, 50%, 25%). Platene ble vasket med PBS, fordøyet med proteinase K (10 pg /ml) i 5 minutter ved 37 ° C, skyllet i 0,2% glycin /PBS og deretter i PBS, og postfiksert med 10% formaldehyd i PBS (10 min). Glassene ble deretter skylt med PBS (2 X). Objektglassene ble deretter prehybridisert ved 54 ° C i 2 timer i hybridiseringsbuffer (50% formamid, 5xSSC, 0,1% Tween-20, ble justert til pH 6,0 med 9,2 mM sitronsyre, 50 ug /ml heparin, 500 ug /ml gjær tRNA) . Deretter objektglass ble hybridisert i ruge kammer over natten ved 54 ° C i en ovn med konstant bevegelse, ved bruk av 2 ul av probe i rundt 200 ul av forvarmet hybridiseringsbuffer. Snittene ble skylt to ganger i 2xSSC, etterfulgt av 3 vaskinger av 30 minutter ved 54 ° C i 50% formamid /2xSSC. Snittene ble deretter vasket 5 ganger i PBS /0,1% Tween-20 (PBST) og blokkert i 1 time i blokkeringsløsning (2% saueserum, 2 mg /ml BSA i PBST). Anti-digoksigenin antistoff (Roche) ble preadsorbert ved 1:1000 fortynning i blokkeringsløsning i 2 timer og deretter påført på seksjonene over natten ved 4 ° C. Deretter Objektglassene ble vasket 3 ganger i PBST og vasket 2 ganger i AP-buffer (100 mM Tris-HCl pH 9,5, 50 mM MgCl
2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween-20), etterfulgt av NBT /BCIP utvikle oppløsning (50 ml Staining løsning, 240 ul av 50 mg /ml NBT, 175 ul 50 mg /ml BCIP, 1 mM levamisol).
