Abstract
Bakgrunn
retinoid 4-oxo-N- (4-hydroksyfenyl) retinamide (4-oxo-4-HPR) er en polar metabolitt av fenretinide (4-HPR ) meget effektiv i å drepe kreftceller i forskjellige histotypes, i stand til å inhibere 4-HPR-resistente cellevekst og for å virke synergistisk i kombinasjon med det opphavelige medikament. I motsetning til 4-HPR og andre retinoider, 4-okso-4-HPR inhiberer tubulin polymerisering, noe som fører til multipolar spindel-dannelse og mitotisk stopp. Her undersøkte vi hvorvidt 4-okso-4-HPR, som 4-HPR, utløst celledød også via reaktive oksygenarter (ROS) generering og om sin antimikrotubulær aktiviteten var knyttet til en ROS-avhengig mekanisme i ovarie (A2780), bryst ( T47D), cervical (HeLa) og neuroblastom (SK-N-BE) kreft cellelinjer.
metodikk /hovedfunnene
Vi gitt bevis for at 4-oxo-4-HPR, foruten skuespill som en antimikrotubulær agent, apoptose gjennom en signalkaskade fra ROS generasjon og involverer endoplasmatiske retikulum (ER) stress respons, jun N-terminal kinase (JNK) aktivering og oppregulering av proapoptotiske morkake benmorfogenetisk protein (PLAB). Gjennom tidsforløpet analyse og hemming av ROS-relaterte signalveien (oppstrøms av vitamin C og nedstrøms av PLAB stanse), har vi vist at det antimitotiske aktivitet av 4-okso-4-HPR var uavhengig av oksidativt stress indusert av retinoid . Faktisk, forekom ROS generasjon tidligere enn mitotisk stopp (i løpet av 30 minutter og 2 timer, henholdsvis) og oppheving av den ROS-relaterte signalveien ikke hindre den 4-okso-4-HPR-indusert mitotisk stopp.
Konklusjoner /Betydningen
Disse data indikerer at 4-okso-4-HPR anticanceraktivitet er på grunn av minst to uavhengige mekanismer, gi en forklaring på evnen av 4-okso-4-HPR å være mer potent enn det opprinnelige medikament og for å være effektiv også i 4-HPR-resistente cellelinjer. I tillegg kunne den doble virkningsmekanismen tillate 4-okso-4-HPR til effektivt å målrette tumor og for til slutt å motvirke utvikling av medikamentresistens
relasjon:. Tiberio P, Cavadini E, Abolafio G, F Formelli , Appierto V (2010) 4-oxo-N- (4-hydroksyfenyl) retinamide: To uavhengige måter å drepe kreftceller. PLoS ONE 5 (10): e13362. doi: 10,1371 /journal.pone.0013362
Redaktør: Andrei L. Gartel, University of Illinois i Chicago, USA
mottatt: 9 juli 2010; Godkjent: 20 september 2010; Publisert: 14 oktober 2010
Copyright: © 2010 Tiberio et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble støttet med tilskudd fra Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (https://www.airc.it), Milan, Italia, gjennom tilskudd og et fellesskap (P. Tiberio). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Retinoider er en klasse av kjemiske forbindelser som er strukturelt beslektet med vitamin A som modulerer fundamentale cellulære prosesser, inkludert celleproliferasjon, differensiering og apoptose [1]. Den syntetiske retinoid fenretinide eller N- (4-hydroksyfenyl) retinamide (4-HPR) er en ikke-toksisk analog av all-trans retinsyre [2] som allerede har vist lovende resultater i preneoplastiske [3] – [5] og neoplastiske tilstander [6], [7]. I dyrkede celler, er 4-HPR blitt vist å indusere vekst-inhibering og apoptose i forskjellige cancercellelinjer og har forskjellige virkningsmekanismer har vært foreslått, blant annet dannelsen av reaktive oksygenarter (ROS) og påfølgende oksidativt stress [8], [9 ]. Vi har nylig rapportert at i eggstokkkreftceller, er 4-HPR-indusert apoptose mediert av proapoptotiske morkake benmorfogenetisk protein (PLAB), og at dens oppregulering av 4-HPR skjer gjennom aktivering av en signalkaskade som starter fra økning av ROS generasjon , som fører til induksjon av endoplasmatisk retikulum (ER) stressrespons og Jun N-terminal kinase (JNK) aktivering [9], [10]. Fra analyse av plasmaprøver av 4-HPR-behandlede pasienter, har vi identifisert en ny 4-HPR polar metabolitt, 4-okso-N- (4-hydroksyfenyl) retinamide (4-okso-4-HPR) [11], som er utstyrt med lovende biologiske egenskaper [12]. 4-okso-4-HPR utløser antiproliferative og apoptotiske virkninger i forskjellige kreftcellelinjer (dvs. ovarie, bryst, og neuroblastom tumorcellelinjer) og er to til fire ganger mer effektiv enn 4-HPR ved inhibering av cellevekst [12]. Interessant er 4-okso-4-HPR også effektive i 4-HPR-resistente celler og, i kombinasjon med 4-HPR, har en synergistisk effekt [12]. I likhet med 4-HPR, tumorvekst-hemmende effekter av 4-okso-4-HPR er uavhengige av nukleære retinoid-reseptorer (RARs). I tillegg, 4-HPR og 4-okso-4-HPR dele flere signaleringsmellomprodukter, slik som ROS generasjon, økning i intracellulære nivåer ceramid, og aktivering av kaspase-3 og kaspase-9 [12]. Despites disse likhetene, synes 4-okso-4-HPR å ha flere virkningsmekanismer i forhold til det opprinnelige legemidlet, også foreslått av dens evne til å være effektiv i 4-HPR-resistente celler [12]. Faktisk, i motsetning til 4-HPR, fører til 4-okso-4-HPR en markert akkumulering av celler i den mitotiske fase, spesielt i pre-anaphase, kombinert med aktivering av spindelen kontrollpunkt [13]. 4-okso-4-HPR-indusert arrest i mitose er assosiert med avvikende spindel formasjon (dvs. multipolar organisasjon uten tap av sentrosomen integritet), på grunn av evnen av 4-okso-4-HPR å målrette mikrotubuli og for å inhibere tubulin polymerisering gjennom en direkte molekylær interaksjon med tubulin [13] sikret foreliggende studien ble planlagt for ytterligere å dissekere 4-okso-4-HPR virkningsmekanismer underliggende sin antiproliferativ effekt, å undersøke hvorvidt anticancer aktivitet av retinoidet kan oppstå også fra dens evne til å øke ROS generasjon og hvorvidt det antimitotiske aktivitet av retinoidet er relatert til oksidativt stress. Vi har her vist at, som 4-HPR, 4-okso-4-HPR bevirker økning av ROS generasjon, fulgt av induksjon av ER stressrespons, aktivering av JNK og PLAB oppregulering og at denne signalkaskade er delvis involvert i den antiproliferative virkning av retinoid. Videre er 4-okso-4-HPR antimitotisk virkning funksjonsmessig uavhengig av nevnte apoptotiske kaskade og indikerer således at 4-okso-4-HPR antitumoreffekt er på grunn av minst to uavhengige virkningsmekanismer.
resultatene
ROS generasjon deltar i 4-okso-4-HPR-indusert apoptose i celler A2780
Vi har nylig rapportert at 4-HPR utløser apoptose gjennom aktivering av en signalkaskade som starter fra ROS generasjon og som innebærer ER stressresponser, JNK aktivering og PLAB oppregulering [9]. For å undersøke om signalkaskade er ansvarlig for 4-HPR-indusert apoptose ble også involvert i apoptose indusert av 4-okso-4-HPR, vi først analysert involvering av ROS generering i apoptose indusert av 4-okso-4-HPR i A2780, til en human ovarie karsinom-cellelinje, valgt fordi det allerede er kjent for å være responsive til retinoidet (IC
50 = 0,6 uM i en 72 timers analyse) og for å generere ROS i respons til 4-okso-4- HPR behandling [12]. Involvering av ROS-produksjon ble målt ved å evaluere effekten av antioksidanten vitamin C med 4-okso-4-HPR-indusert apoptose. Fem uM 4-okso-4-HPR behandling i 4 timer forårsaket en økning av ROS produksjon, som ble forhindret ved tilsetning av 100 pM vitamin C (figur 1A). Oppheving av ROS generering av vitamin C forårsaket en reduksjon (1,7 ganger) med 4-okso-4-HPR-indusert apoptose, evaluert som DNA-fragmentering av en ELISA-analyse (figur 1B). En tilsvarende reduksjon av apoptose er observert ved bestemmelse av sub-G
en populasjon av propidiumjodidfarging fulgt av strømningscytometri-analyse (se figur 5 og relativ resultat avsnitt). Disse data antydet at ROS-generering fremkalt av 4-okso-4-HPR var involvert i 4-okso-4-HPR-indusert apoptose.
(A) Analyse av ROS produksjon i A2780-celler ble behandlet i 4 timer med 5 uM 4-okso-4-HPR, med eller uten 100 pM vitamin C. analysen ble utført ved flow-cytometri etter tilsetning av redoks-følsomt fargestoff CM-H
2DCFDA. Grafen viser representative flowcytometri fluorescens profiler i ulike forhold av behandlingen (en representativt eksperiment av tre). En omlegging til høyre fra kontroll indikerer økt ROS nivåer. (B) A2780-celler ble behandlet i 24 timer med 5 mM 4-okso-4-HPR, med eller uten 100 pM vitamin C og apoptose, evaluert som DNA-fragmentering, ble målt ved en ELISA-analyse. Dataene er hjelp av tre uavhengige forsøk; vertikale linjene er standardavvik. Stjerne indikerer signifikant forskjell (P 0,05).
4-oxo-4-HPR induserer ER stressrespons i A2780 celler
Vi analyserte om 4-oxo-4-HPR, som 4-HPR [9], aktivert, nedstrøms for ROS generasjon, en ER stressrespons, ved å evaluere ER-stress-spesifikke signaler: post-transkripsjonell spleising av transkripsjonsfaktoren X-box bindende protein-1 (XBP-1), ekspresjonen av chaperon proteinene glukoseregulerte protein 78 KD (GRP-78) /immunglobulin-bindende protein (BIP) og varmesjokkproteinet 70 (HSP70), og fosforyleringen status for alfa-subenheten av eukaryotisk initiering faktor 2 ( eIF2α) [14]. I A2780-celler, 5 uM 4-okso-4-HPR behandling i 24 timer indusert spleising av en 25 bp intron fra XBP-en forløper mRNA, forårsaket oppregulering av GRP78 /Bip og HSP70 og fosforylering av eIF2α (figur 2A). Aktiveringen av disse ER stress-assosierte bivirkninger ble opphevet (XBP-1, GRP78 /Bip og HSP70) eller sterkt redusert (eIF2α) ved tilsetning av vitamin C (figur 2A). Resultatene viste at 4-okso-4-HPR skyldes induksjon av ER stressrespons, som nedstrøms tilfelle av ROS generasjon.
(A) A2780-celler behandlet i 24 timer med 5 mM 4-okso-4-HPR , med eller uten 100 pM vitamin C, ble underkastet RT-PCR-analyse for å analysere spleising av den 25 bp intron fra XBP-1 transkripsjon og western blot-analyse for ekspresjon av GRP-78 /Bip, peIF2α, eIF2α. For revers transkripsjon-PCR, ble β-actin forsterkes som intern kontroll. For western blot-analyse, som en kontroll for lasting, ble blottet inkubert med aktin antistoff. (B) celler ble behandlet som i (A) ble underkastet Western blot-analyse for ekspresjon av pJNK og JNK.
4-okso-4-HPR induserer JNK-aktivering i A2780 celler
Vi analyserte enten 4-okso-4-HPR, som 4-HPR [9], indusert JNK-aktivering. Western blot-analyse, på A2780 celler, viste at 5 uM 4-okso-4-HPR behandling i 24 timer forårsaket JNK-fosforylering, og at tilsetningen av vitamin C sterkt redusert aktivering av kinasen (figur 2B). Dataene indikerte at 4-okso-4-HPR indusert aktivering av JNK og at denne hendelsen inntraff gjennom en ROS-avhengig mekanisme.
PLAB oppregulering er funksjonelt involvert i apoptose indusert av 4-okso-4-HPR
Vi har tidligere rapportert at PLAB oppreguleres ved 4-HPR i en ROS avhengig måte [9], og at den spiller en funksjonell rolle i apoptose indusert av retinoidet i A2780-celler [10]. Vi vurderte derfor om også 4-oxo-4-HPR modulert PLAB uttrykk. Western blot analyse viste at 5 uM 4-okso-4-HPR behandling i 24 timer indusert oppregulering PLAB og at denne effekten var sterkt redusert ved tilsetning av vitamin C (figur 3A). For å undersøke om PLAB oppregulering spilt en funksjonell rolle i apoptose indusert av 4-oxo-4-HPR, vi tok fordel av PLAB stanse i A2780 celler, tidligere generert av stabil transfeksjon [10]. Som forventet, PLAB upmodulation indusert av 4-okso-4-HPR ble sterkt redusert i celler transfektert med den PLAB siRNA plasmidet sammenlignet med celler transfektert med et plasmid egge anvendt som kontroll (figur 3B). Som vist i figur 3C, apoptose indusert av 4-okso-4-HPR i celler transfektert med PLAB siRNA var omtrent 2-ganger redusert i forhold til cellene transfektert med det forvrengte plasmidet. Reduksjonen av apoptose indusert av 4-okso-4-HPR i PLAB stilnet celler har også blitt bekreftet ved evaluering av sub-G
en populasjon etter propidiumjodidfarging (data ikke vist). Resultatene viste at 4-okso-4-HPR indusert oppregulering PLAB som en hendelse på nedstrømssiden av ROS generasjon og det PLAB bidro til 4-okso-4-HPR-indusert apoptose. Alle de nevnte dataene antydet at 4-okso-4-HPR som skyldes aktivering av ROS relatert signaleringskaskade som allerede er vist å bli aktivert av 4-HPR (ROS → ER stress → JNK → PLAB) [9].
(A) Western blot-analyse for ekspresjon i PLAB A2780-celler behandlet i 24 timer med 5 mM 4-okso-4-HPR, med eller uten 100 pM vitamin C. Som en kontroll for lasting, ble blottet inkubert med antistoff aktin . (B) Western blot-analyse for ekspresjon i PLAB A2780 celler som er stabilt transfektert med et plasmid som inneholder et siRNA PLAB eller en kryptert nonsilencing siRNA etter tilsetning av 5 mM 4-okso-4-HPR i 24 timer. Som en kontroll for lasting, ble det blot inkubert med aktin antistoff. (C) Påvisning av 4-okso-4-HPR-indusert apoptose i A2780 stabilt transfektert med et plasmid som inneholder et siRNA PLAB (svarte søyler) eller et omkastet nonsilencing siRNA (grå kolonner). Transfekterte celler ble behandlet i 24 timer med 5 mM 4-okso-4-HPR og apoptose, evaluert som DNA-fragmentering, ble målt ved en ELISA-analyse. Dataene er gjennom fire uavhengige forsøk; vertikale linjene er standardavvik. Stjerne indikerer signifikant forskjell (P 0,01).
4-oxo-4-HPR induserer Bcl-2 og Mcl-en nedregulering i en ROS-uavhengig måte
Siden det har blitt rapportert at 4-HPR kan indusere apoptose ved regulering av medlemmer av Bcl-2-familien, som nedstrøms tilfelle av ROS generasjon [15] – [17], analyserte vi effekten av 4-okso-4-HPR på antiapoptotic proteiner B-celle lymfom gen-2 (Bcl-2) og myeloid celle leukemi-1 (Mcl-1) og på den proapoptotiske proteinet Bcl-2-assosiert protein X (Bax). I A2780-celler, 5 uM 4-okso-4-HPR behandling i 24 timer forårsaket en reduksjon av Bcl-2 og Mcl-1-protein ekspresjon nivå, mens ikke hadde virkning på Bax ekspresjon (fig S1). Den nedregulering av både Bcl-2 og Mcl-1 ble ikke forhindret ved tilsetning av vitamin C (figur S1), således som tyder på at 4-okso-4-HPR forårsaket en slik reduksjon i et ROS-uavhengig måte.
mitotisk stopp og dannelsen av multipolar spindler er uavhengige fra ROS-relaterte signalkaskade i A2780 celler
i motsetning til 4-HPR, som bare er litt påvirker G
1 fasen av cellesyklusen, 4- oxo-4-HPR bevirker en markert akkumulering av celler i G
2-M-fasene [12]. Vi har nylig rapportert at 4-okso-4-HPR-indusert cellesyklus perturbasjon var på grunn av evnen til å inhibere retinoid tubulin polymerisering stanse celler i mitose [13]. Dessuten ble det antimitotiske virkning av retinoidet vist seg å være kombinert med dannelsen av abnormt formede spindler (dvs. multipolars) på grunn av dens virkning på tubulin polymerisering [13]. For å undersøke om 4-oxo-4-HPR-indusert mitotisk arrest og dannelsen av multipolar spindler var knyttet til ROS-indusert signalkaskade vi først utført en tidsforløpet analyse av både ROS generasjon og cellesyklus forstyrrelse indusert av 4- oxo-4-HPR. ROS generasjon ble observert så tidlig som 30 minutter etter retinoid behandling (figur 4A) og bodde hele 24-timers-kurset. I motsetning til dette en liten G
2-M celle akkumulering ble observert bare ved 2 timer og økningen av prosentandelen av G
2-M-stansede celler var tidsavhengig opp til 16-24 timer (figur 4B) . Tidsforløpet analyse avslørte dermed at oksidativt stress indusert av 4-okso-4-HPR skjedde tidligere enn cellesyklus-stans og at de to hendelsene presentert forskjellige kinetikk. For å undersøke om 4-oxo-4-HPR-indusert ROS generasjon spilt en rolle i mitotisk arrest, analyserte vi effektene av vitamin C på cellesyklus forstyrrelse og dannelse av avvikende spindler indusert av retinoid. I A2780-celler eksponert i 24 timer til 5 uM 4-okso-4-HPR, tilsetning av 100 pM vitamin C ikke hindre opphopning av G
2-M cellepopulasjon (figur 5 og S2) eller dannelse av multipolar spindler (figur 5). Konsistente resultater i cellesyklusfordeling, samt dannelse av multipolar spindler ble oppnådd ved å hemme ROS-relaterte signalkaskade på en nedstrøms plan gjennom PLAB lyddemping: transfeksjon med PLAB siRNA forhindret ikke 4-okso-4-HPR-indusert mitotisk stopp og dannelse av multipolar spindler (data ikke vist). Resultatene viste at i A2780 celler, mitotisk stopp indusert av 4-okso-4-HPR var verken en hendelse på nedstrømssiden av ROS generasjon, og heller ikke et trinn i ROS-relaterte signalkaskade.
(A) Analyse av ROS produksjon i A2780 celler behandlet med 5 uM 4-okso-4-HPR i 30 minutter, 1 time, 2 timer, 4 timer, 6 timer, 16 timer og 24 timer. Analysen ble utført ved flowcytometri etter tilsetning av redoks-følsomt fargestoff CM-H
2DCFDA. Grafene viser representative flowcytometri fluorescens profiler i ulike forhold av behandlingen (én representant eksperiment av tre). En omlegging til høyre fra kontroll indikerer økt ROS nivåer. (B) Strømningscytometrisk analyse av propidiumjodid-farget A2780 celler behandlet med bærer eller 5 mM 4-okso-4-HPR i 30 minutter, 1 time, 2 timer, 4 timer, 6 timer, 16 timer og 24 timer. Tallene i figuren angir prosentandelen av celler i den fase av cellesyklusen, i henhold til analyse utført med ModFit LT programvare. Ett eksperiment representant for tre vises.
Flowcytometrisk analyse av propidiumjodid–farget A2780 celler behandlet i 24 timer med 5 mikrometer 4-oxo-4-HPR med eller uten 100 mikrometer vitamin C. Tall i figuren angir prosentandelen av celler i den fase av cellesyklusen, i henhold til analyse utført med ModFit LT programvare. Ett eksperiment representant for tre vises. På høyre er avbildet en representant mitotisk celle bilde for hver behandling, oppnådd ved farging med α-tubulin antistoff (
grønn
) og kjernekraft farging med Hoechst 33342 (
Blå
). Scale bar = 5 mikrometer.
4-oxo-4-HPR virker gjennom en dobbel virkningsmekanisme også i kreftcellelinjer av ulik histotypes
For å avgjøre om involvering av to uavhengige mekanismer i 4-okso-4-HPR aktivitet var begrenset til A2780-celler eller representerte den karakteristiske virkningsmåte av retinoidet, utvidet vi analysen av 4-okso-4-HPR effekter til tre andre humane kreftcellelinjer som reagerer retinoid: T47D (mamma adenokarsinomer), HeLa (epitel cervical adenokarsinom) og SK-N-BE (neuroblastom) celler (Figur 6A). Vi først vurdert intracellulære generering av ROS indusert av 4-okso-4-HPR viser at i de tre cancercellelinjene, 5 uM 4-okso-4-HPR i 4 timer øket ROS-produksjon sammenlignet med kontroller, og at tilsetningen av 100 pM vitamin C inhiberte ROS generasjon indusert av retinoid (figur 6B). I de tre testede cellelinjer, ble 4-okso-4-HPR behandling indusert oppregulering PLAB og denne effekten reduseres ved tilsetning av vitamin C (figur 6C). Vi utførte cellesyklusanalyse viste at 4-okso-4-HPR behandling induserte en markert G
2-M cellesyklusarrest i alle de testede cancercellelinjer (figur 7 og S2). I likhet med det som observeres i A2780 celler i disse cellelinjer ved inhibering av ROS generasjon med vitamin C førte til en markert reduksjon av sub-G
1 befolkningen, men ikke redusere prosentandelen av celler arrestert i G
2- M fase (figur 7 og S2). Videre 4-okso-4-HPR behandling forårsaket dannelsen av multipolar spindler i T47D, HeLa og SK-N-BE-celler (figur 7), og i alle av dem tilsetning av vitamin C ikke hindre dannelsen av avvikende spindler induserte av retinoid (figur 7). Resultatene antydet at det også i T47D, HeLa og SK-N-BE-celler, ROS-avhengig signalkaskade er involvert i 4-okso-4-HPR-indusert apoptose. Videre 4-oxo-4-HPR-indusert cellesyklus arrest og dannelsen av multipolar spindler var uavhengig av ROS-assosiert signalkaskade, ikke bare i eggstokkene, men også i bryst, livmorhalsen og neuroblastom kreft cellelinjer, avslører den karakteristiske trekk av 4-okso-4-HPR å ha en dobbeltvirkningsmekanisme.
(A) Citotoxic virkning av 4-okso-4-HPR på T47D (□), HeLa (▵) og SK-N- BE (○) cellevekst ble beregnet ved å bruke sulforhodamin B analysen. Den antiproliferative aktivitet av 4-okso-4-HPR i hver cellelinje ble testet i tre uavhengige eksperimenter med fire duplikate brønner for hver analyse; vertikale linjene er standardavvik. (B) Analyse av ROS produksjon i T47D, HeLa og SK-N-BE-celler behandlet i 4 timer med 5 mM 4-okso-4-HPR, med eller uten 100 pM vitamin C. Analysen ble utført ved flow cytometri etter tilsetning av redoks-sensitive fargestoff CM-H
2DCFDA. Grafene viser representative flowcytometri fluorescens profiler i ulike forhold av behandlingen (én representant eksperiment av tre). En omlegging til høyre fra kontroll indikerer økt ROS nivåer. (C) Western blot analyser for PLAB ekspresjon i T47D, HeLa og SK-N-BE-celler behandlet med 5 uM 4-okso-4-HPR i 24 timer, med eller uten 100 pM vitamin C. Som en kontroll for lasting, at blot ble inkubert med aktin antistoff.
Flowcytometrisk analyse av propidiumjodid–farget T47D (A), HeLa (B) og SK-N-BE (C) celler behandlet i 24 timer med 5 mikrometer 4-okso-4-HPR med eller uten 100 pM vitamin C. tallene i figuren angir prosentandelen av celler i den fase av cellesyklusen, i henhold til analyse utført med ModFit LT programvare. Ett eksperiment representant for tre vises. På bunnen av hver histogram, immunfluorescens analyse med α-tubulin antistoff (
grønn
) av celler behandlet på samme måte. Nuclear morfologi ble visualisert ved farging med Hoechst 33342 (
Blå
). Scale bar = 10 mikrometer.
Diskusjoner
4-oxo-4-HPR er en polar metabolitt av syntetisk retinoid 4-HPR som ble oppdaget i plasmaprøver av kvinner behandlet med 4-HPR delta i en fase III bryst kreft forebygging prøve [11]. Våre tidligere
in vitro
studier utført med 4-okso-4-HPR har vist at retinoidet er utstyrt med meget lovende anticancer-egenskaper, slik som høyere tumor veksthemmende effekter enn 4-HPR (som sin IC
50 verdiene to til fire ganger lavere enn modersubstansen i de fleste testede cellelinjer), mangel på kryssresistens og synergistisk interaksjon med esomeprazol [12], noe som tyder på at det kan bli foreslått som en ny agent for kreftbehandling. Forskjellig fra 4-HPR og andre retinoider, 4-okso-4-HPR rettet mot mikrotubuli og hemmer tubulin polymerisering forårsaker mitotisk stopp og dannelsen av multipolar spindler uten tap av integritet sentrosomen [13]. På den annen side, på samme måte som det opprinnelige legemidlet, 4-okso-4-HPR induserer økning av ROS generasjon [12].
Siden 4-HPR-indusert ROS generering har vist seg å aktivere en apoptotiske kaskade involverer eR stressrespons, JNK aktivering og oppregulering av proapoptotiske protein PLAB [9], bestemte vi oss for å undersøke om 4-oxo-4-HPR utløst apoptose også via ROS generasjon, og om sin antimitosemekanisme aktiviteten var knyttet til denne ROS-avhengige veien. 4-okso-4-HPR-indusert ROS produksjon bidratt til den apoptotiske aktivitet av retinoid, fordi behandlingen med antioksidanten vitamin C forårsaket en reduksjon av 4-okso-4-HPR-indusert apoptose. I vår forrige undersøkelse på 4-oxo-4-HPR karakterisering [12], var vi ikke i stand til å vise en klar årsakssammenheng mellom produksjon av ROS og cellevekst hemmende aktivitet av retinoid. En mulig forklaring kan være at antioksidant anvendt i tidligere analyser (det vil si
N
-acetyl-L-cystein) ikke fullstendig hindre at oksidativt stress indusert av 4-okso-4-HPR, men bare forårsaket en partiell reduksjon av ROS produksjon [12].
Nedstrøms av ROS generasjon, 4-okso-4-HPR aktivert andre signaleringsmellomprodukter med 4-HPR apoptotiske kaskade, slik som ER stress respons (påvist ved XBP-1 spleising, GRP78 /Bip og HSP70 oppregulering, og eIF2α phosporylation) og JNK phosporylation, både forebygges ved vitamin C tillegg. Ekspresjon av proteinet proapoptotiske PLAB ble dramatisk økt med 4-okso-4-HPR og dens oppregulering ble redusert med vitamin C-tilsetning, noe som tyder på at proteinet uttrykket modulasjonen var et nedstrøms tilfelle av oksidativt stress indusert av retinoid. Videre demonstrerte vi at PLAB spilte en funksjonell rolle i 4-okso-4-HPR apoptotisk aktivitet, fordi dens stanse redusert apoptose indusert av retinoid. Derfor indikerte resultatene at 4-oxo-4-HPR, foruten å fungere som en antimikrotubulær agent, indusert apoptose via signalkaskade som vi allerede har vist seg å bli aktivert av 4-HPR (ROS → ER stress → JNK → PLAB) [ ,,,0],9]
PLAB apoptotisk induserende aktivitet er blitt observert og rapportert av andre forfattere i flere cellulære sammenhenger og etter behandling med ulike legemidler mot kreft [9], [18] -. [21]. Men de spesifikke nedstrøms hendelser ved hvilken PLAB formidler mellom slik virkning gjenstår å bli bestemt. Fra våre resultater, kan en involvering av proteinene Bcl-2 og MCL-1, en Bcl-2-familiemedlem, i PLAB apoptotisk aktivitet kan eventuelt utelukkes. Faktisk, selv om 4-okso-4-HPR behandling forårsaket en nedregulering av ekspresjonen nivå av de to antiapoptotic proteiner, for eksempel en reduksjon ble ikke forhindret ved hemming av ROS-mediert apoptotiske kaskade involverer PLAB.
det er interessant å merke seg at 4-okso-4-HPR er en oksydert form av 4-HPR og at endringen i posisjon 4 av det cykloheksen ringen er sannsynligvis ansvarlig for 4-okso-4-HPR antimikrotubulær aktivitet, men som ikke påvirke evnen av retinoidet til å indusere ROS generasjon, og å aktivere den ROS-relaterte signalkaskade. En slik kjemisk modifikasjon kan også være ansvarlig for de forskjellige sfingolipid stoffskiftet observert mellom de to retinoider. Både 4-HPR og 4-okso-4-HPR er blitt vist å indusere en dramatisk økning av dihydroceramide produksjon; imidlertid ble bidraget av distinkte molekyltyper til den totale økningen rapportert å være merkbart forskjellig, når det gjelder sfingosin /sphinganine og fettsyreinnhold. I tillegg, 4-okso-4-HPR, i motsetning fra modermedikamentet, har vist seg å øke svakt også ceramid produksjon [22].
Vi har tidligere rapportert at 4-okso-4-HPR opptrer atypisk sammenlignet med 4-HPR og andre retinoider, på grunn av sin evne til å hemme tubulin polymerisering, noe som fører til dannelse av multipolar spindel og mitotisk stopp [13]. I denne studien er det funnet at den mitotisk stopp og det koblede dannelsen av multipolar spindler som induseres av 4-okso-4-HPR var uavhengig av ROS-relaterte signalkaskade. Faktisk har vi vist at 4-okso-4-HPR-indusert ROS generasjon oppstått tidligere enn mitotisk stopp, og således indikerer at den antimitotiske aktivitet av retinoidet var ikke en hendelse oppstrøms for oksidativt stress. På den annen side, har inhibering av ROS-relaterte veien ved vitamin C eller ved PLAB stanse ikke forhindre muligheten av 4-okso-4-HPR å utøve sin antimikrotubulær aktivitet, således som tyder på at den mitotisk stopp var ikke en ROS- avhengig mekanisme. Forekomsten av en dobbel virkningsmekanisme kan plausibly være et karakteristisk trekk ved virknings av 4-oxo-4-HPR, siden disse to urelaterte trasé ble funnet i kreftcellelinjer av ulik histotypes (eggstokkene, brystkreft, livmorhalskreft og neuroblastom).
Selv om den eksakte mekanisme ved hvilken 4-okso-4-HPR antimikrotubulær aktivitet utløser celledød har ennå ikke bestemt, på basis av de ovennevnte data, vi kan spekulere at både ROS- tilhørende signaleringskaskade og antimikrotubulær aktiviteter uavhengig bidrar til 4-okso-4-HPR antiproliferativ effekt, og vi foreslår at retinoid-handlingene som er presentert skjematisk i figur 8. Imidlertid analyse av 4-okso-4-HPR virkningsmekanismer vil trenge videre studier for å undersøke hvordan to veier molekylært fører til celledød. Det er fristende å spekulere at ROS-uavhengig nedregulering av Bcl-2 og Mcl-1, som ble observert etter 4-okso-4-HPR behandling, kunne spille en rolle i apoptose indusert av antimikrotubulær aktiviteten av retinoid, selv om det ved foreliggende ingen bevis støtter denne hypotesen. Ifølge våre observasjoner, har det blitt rapportert at behandling med andre mikrotubul-interfererende midler kan føre til en reduksjon i Bcl-2 og Mcl-1 intracellulære mengder som bidrar til apoptose [23] – [25].
4 okso-4-HPR induserer celledød gjennom to uavhengige virkningsmekanismer: 1) en ROS-relaterte signalkaskade som involverer ER stressrespons, JNK aktivering og oppregulering av proapoptotiske protein PLAB; og 2) antimikrotubulær virksomhet som består i hemming av tubulinpolymerisering, mitotisk arrest og dannelsen av multipolar spindler.
Det er bemerkelsesverdig at andre mikrotubulidynamikk målrettede midler har vist seg å fremme ROS generasjon i kreftceller, men forholdet mellom tubulin dynamikk og oksidativt stress forblir uklar [26] – [33]. Nylig har anticancer-aktivitet av paclitaxel vært knyttet til genereringen av intracellulære og ekstracellulære ROS, og det har blitt foreslått at forstyrrelse av mikrotubuli-polymerisering tilstand indusert av dette middel, så vel som ved taxotær eller vinkristin, kan forbedre ROS produksjon gjennom stabilisering av aktiv NADPH oksidase [31], [32]. ROS generasjon bidro også til antiproliferative effekt av patupilone, har et medlem av mikrotubulidynamikk stabiliserende midler epotiloner, og en årsakssammenheng mellom oksidativt stress og modifikasjoner av mikrotubulidynamikk blitt foreslått [30]. I motsetning til ROS generering fremkalt av stilbene 5c, en mikrotubuli-inhibitor på colchicin området, er blitt vist å være urelatert til legemiddel-indusert cellesyklus perturbasjon [29], i likhet med hva vi har funnet for 4-okso-4- HPR.
evnen av 4-okso-4-HPR å virke gjennom minst to ikke-relaterte mekanismer kan sannsynligvis tillater å motvirke utvikling av medikamentresistens. Faktisk har vi vist at hvis en reaksjonsvei ikke er mulig (dvs. ROS-relatert signalveien), er retinoidet i stand til å virke gjennom den andre mekanismen (dvs. mitotisk stopp) for å drepe kreftceller.
