Abstract
De fleste pasienter som behandles med EGFR-tyrosinkinasehemmere (EGFR-TKI) til slutt utvikle ervervet resistens. Tap av ekspresjon av insulinlignende vekstfaktor (IGF) -binding protein-3 (IGFBP-3) er blitt foreslått som en mulig mekanisme for resistens mot EGFR-TKI i A431 og HN11 cellelinjer. Her, undersøkte vi IGFBP-3 ekspresjon i to EGFR mutante lungecancer-cellelinjer med resistens mot EGFR-TKI og undersøkt verdien av serum IGFBP-3 nivå som en markør for resistens. Effekten av induksjon eller undertrykkelse av IGFBP-3 ekspresjon på motstand ble også evaluert. ble etablert HCC827 underlinjer med motstand mot gefitinib (HCC827 /GR) og erlotinib (HCC827 /ER). Tap av IGFBP-3 ekspresjon ble påvist ved Western blotting i begge cellelinjene uten forandringer i transkripsjonen aktivitet og ELISA viste signifikant lavere mengder av utskilt IGFBP-3 i kulturmediet av de mutante cellelinjer enn i det paren linje. Til tross for tapet av IGFBP-3 ekspresjon, forble IGFR signale aktivitet uendret. Tvunget uttrykk for IGFBP-3 av adenovirus-mediert transfeksjon eller rekombinant IGFBP-3 litt økt vekst-hemmende og apoptotiske virkninger av EGFR-TKI, mens undertrykkelse av IGFBP-3 ikke påvirker følsomheten til EGFR-TKI. Serum IGFBP-3 nivåer målt ved ELISA før og etter utvikling av EGFR-TKI resistens hos 20 pasienter viste ingen signifikante endringer (1815,3 ± 94,6 ng /mL før behandling sammenlignet med 1778,9 ± 87,8 ng /ml etter EGFR-TKI motstand). I sammendrag, selv om IGFBP-3 nedregulering er forbundet med anskaffelsen av resistens mot EGFR-TKI uavhengig av mekanismen, dens virkning på motstanden var ikke signifikant, noe som indikerer at IGFBP-3 ikke kan spille en viktig rolle i resistens mot EGFR-TKI og serum IGFBP-3 nivå er ikke en pålitelig indikator for motstand
Citation. Choi YJ, Park GM, Rho JK, Kim SY, så GS, Kim HR, et al. (2013) Rolle av IGF-Binding Protein 3 i Resistance av EGFR Mutant lungekreft celler til EGFR-tyrosinkinasehemmere. PLoS ONE 8 (12): e81393. doi: 10,1371 /journal.pone.0081393
Redaktør: Giuseppe Viglietto, Universitetet Magna Graecia, Italia
mottatt: May 13, 2013; Godkjent: 14 oktober 2013; Publisert: 05.12.2013
Copyright: © 2013 Choi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av en bevilgning (2011-467) fra Asan Institute for Life Science, Seoul, Korea. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
EGFR er et transmembran reseptor som hører til en familie på fire relaterte proteiner, EGFR (ErbB-1), HER2 /neu (ErbB-2), HER3 (ErbB-3) og HER4 (ErbB-4) [1]. Ved ligandbindende, EGFR danner homo- eller heterodimerer med andre ErbB-reseptorer fører til aktivering av intracellulære signalkaskader. De to hoved intracellulære reaksjonsveier som aktiveres av EGFR er RAS-RAF-MEK-MAPK-reaksjonsveien, som kontrollerer gentranskripsjon, cellesyklusprogresjon og celleproliferasjon, og PI3K-Akt veien, noe som aktiverer en kaskade av anti-apoptotiske og prosurvival signaler . [2]
ikke-småcellet lungekreft (NSCLCs) at havnen aktive mutasjoner og /eller forsterkning av EGFR locus er spesielt følsomme for EGFR-tyrosinkinasehemmere (TKI) som gefitinib (Iressa, Astrazeneca International) og erlotinib (Tarceva, OSI Pharmaceuticals) [3] – [9]. Omtrent 70-80% av NSCLCs skjuler en somatisk mutasjon i tyrosin kinase domene av EGFR-genet svarer til gefitinib /erlotinib [3], [4], [10]. Men ervervet resistens mot EGFR-TKI behandling nesten alltid utvikler seg etter en median på ca 10 måneder fra starten av behandlingen, selv hos pasienter som viser en innledende dramatisk respons på disse midlene. Ervervet resistens har vært forbundet med en sekundær mutasjon i EGFR-genet, T790M [11], [12], som har blitt oppdaget i omtrent 50% av kreft med ervervet resistens mot EGFR-TKI [13], [14]. I tillegg, ble amplifisering av MTT-onkogenet identifisert som en annen mekanisme av ervervet resistens mediert av fosforyleringen av ErbB-3 og den påfølgende aktivering av PI3K [15], [16]. Tilsvarende overekspresjon av AXL kinase har vært forbundet med resistens mot EGFR-TKI [17].
I en fersk studie, tap av uttrykk for insulin-like growth factor (IGF) -binding protein 3 (IGFBP- 3) ble foreslått som en mulig mekanisme for motstand i A431 og HN11 cellelinjer [18]. I den studien, ervervet resistens mot EGFR-TKI ble modellert ved å bruke A431 squamous cancercellelinje, som havner villtype-EGFR genamplifikasjon. Den gefitinib-resistent cellelinje A431 A431 GR opprettholdt PI3K signalisering i nærvær av gefitinib ved å aktivere IGF1 reseptor (IGF1R) pathway. Hemming av IGF1R signale restaurert evne gefitinib å nedregulere PI3K /Akt signalisering og hemme A431 GR cellevekst. Genekspresjon analyser viste betydelig nedregulering av IGFBP-3 ekspresjon i A431-celler GR, og tilsetning av rekombinant IGFBP-3 gjengitte evne gefitinib til å nedregulere PI3K /Akt signalering og for å inhibere cellevekst. I en annen modell av ervervet gefitinib motstand etablert i gefitinib-sensitive villtype EGFR uttrykke HN11 hode- og halskreft cellelinje, ble Akt fosforylering opprettholdt i nærvær av gefitinib, og motstanden ble overvunnet av kombinert EGFR og IGF1R hemming. Til sammen antyder disse resultatene at tap av ekspresjon av IGFBP i tumorceller behandlet med EGFR-TKI resulterer i aktiveringen av IGF1R signalering, som i sin tur formidler resistens mot EGFR-antagonister. Derfor, kombinert terapeutisk inhibering av EGFR og IGF1R kan oppheve denne ervervet mekanisme for legemiddelresistens. Imidlertid har en modell av ervervet resistens mot gefitinib ikke blitt utviklet i EGFR mutant lungekreftceller, noe som er av klinisk betydning.
De fleste av de sirkulerende IGF-1 bindes til hoved IGF-bindende protein, IGFBP- 3 [19]. Serum IGF-1 og IGFBP-3-konsentrasjoner kan måles lett og kan være av verdi som indikatorer på kreftrisiko. Epidemiologiske studier har vist at høye IGF-1 og IGFBP-3 lavt nivå er uavhengig forbundet med en høy risiko for vanlige krefttyper, inkludert lungekreft [20]. IGFBP-3 er blitt foreslått som et potensielt mål for lungekreft behandling, som adenovirus-mediert overekspresjon av IGFBP-3 hemmet veksten av NSCLC-celler in vitro og in vivo ved å indusere apoptose gjennom hemming av PI3K /Akt /PKB og MAPK signalveier [21].
i denne studien ble IGFBP-tre uttrykk undersøkt i EGFR muterte lungekreftceller med ervervet resistens mot EGFR-TKI, og verdien av serum IGFBP-3 nivå ble vurdert som en markør for resistens. Effekten av indusert IGFBP-3 på å overvinne motstanden ble også evaluert.
Materialer og metoder
Cell Kultur og reagenser
HCC827 cellelinje ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC: Rockville, MD, USA). Celler ble dyrket i RPMI 1640 medium inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin og 100 enheter /ml penicillin og streptomycin, og holdt ved 37 ° C i et fuktet kammer inneholdende 5% CO
2. Gefitinib og erlotinib var kjøp fra Selleck Chemicals (Houston, Texas, USA). Rekombinant humant IGFBP-3 (rh IGFBP-3) ble kjøpt fra Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA). Den adenovirusvektor uttrykker humant IGFBP-3 (Ad /IGFBP3) ble vennlig levert av Dr. Ho-Young Lee (The University of Texas MD Anderson Cancer Center) [21].
Etablering av Gefitinib- og Erlotinib -resistente cellelinjer
gefitinib og erlotinib-resistente varianter av HCC827 ble isolert ved trinnvis eksponering for økende doser av gefitinib og erlotinib. HCC827-celler ble behandlet med 10 nM gefitinib og erlotinib i 72 timer. Celler ble kontinuerlig utsatt for økende medikamentkonsentrasjoner på opp til 1 pM over 8 måneder. EGFR-TKI-resistente kolonier ble valgt ved eksponeringskonsentrasjoner på 5 mikrometer og de to isolerte kloner ble utpekt som HCC827 /GR og HCC827 /ER, henholdsvis. Generering av HCC827 /ER-cellelinjen er blitt tidligere beskrevet [17]. Resistente celler ble opprettholdt i stoff-fri medium for minst 2 uker før eksperimenter for å eliminere effekten av narkotika.
celleviabilitet analysen
levedyktighet av cellene ble målt ved hjelp av MTT analyse og trypanblått celle telling. Celler ble sådd ut i 96-brønners sterile plastplater og utsatt for varierende konsentrasjoner av narkotika i medium inneholdende 1% FBS. Etter 72 timer, 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) løsning ble tilsatt, og krystallinske formazan ble oppløst med natriumdodecylsulfat (SDS) -løsning.
Kombinasjons effekter ble evaluert med trypanblått celletelling. HCC827 /GR og HCC827 /ER celler ble sådd ut i 60 mm skåler og behandlet med EGFR-TKI og Ad /IGFBP-3 infeksjon eller rh IGFBP-3 i 72 timer i medium som inneholder 1% FBS. Celletall ble bestemt med en ADAM-MC automatisk celleteller (NanoEnTek, Seoul, Korea), i henhold til produsentens instruksjoner. Resultatene er representative for minst tre uavhengige eksperimenter og feilstolpene betegne standardavvik (SDS).
Western Blot
Proteinene ble separert på SDS-polyakrylamidgeler, og elektrooverført til Immobilon-P membraner (Millipore, Bedford, MA, USA). Antistoffer spesifikke for p-EGFR, EGFR, MET, Her2, HER3, IGF1R, p-Akt, Akt, p-ERK, ERK, Axl, IGFBP-3 og aktin ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, California), og de for p-HER2, p-ErbB3, p-MET og p-IGF1R (Tyr1131 og Tyr1135 /1136) fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Proteiner ble oppdaget med en forbedret chemiluminescence Western blotting kit (Amersham Biosciences, NJ, USA), i henhold til produsentens instruksjoner.
Semi-kvantitativ revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR)
Total RNA isolering og cDNA syntese ble utført ved hjelp av RNA mini-kit-protokollen (Qiagen Inc., Valencia, CA) og Accupower RT mix reagens, i henhold til produsentens instruksjoner (Bioneer Corp., Seoul, Korea). Oligonukleotid-sekvensene for amplifisering var som følger: forover primer, 5′-ATATGGTCCCTGCCGTAGA-3 «, og revers primer, 5′-AAATCGAGGCTGTAGCCAG-3′, for IGFBP-3; forover-primer, 5»-GCGAGAAGATGACCCAGATC-3 «, og revers primer, 5′-CCAGTGGTACGGCCAGAGG-3», for β-aktin.
Transfeksjon av Lie interfererende RNA
Små interfererende RNA (siRNA ) oligonukleotider som er spesifikke for IGFBP-3 ble oppnådd fra Thermo (Thermo Electron Corp., Waltham, MA, IGFBP-3 siRNA-1) og Qiagen (IGFBP-3 siRNA-2). Transfeksjon av siRNA ble utført ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, California) i henhold til produsentens instruksjoner. Target genekspresjon ble målt 24 timer senere ved hjelp av western blot analyse. For MTT-analysen ble cellene sådd ut på 96-brønners plater etter siRNA transfeksjon ble så behandlet med de angitte midler i 72 timer.
ELISA for Serum IGFBP-3 ELISA
Residual serum etter rutine kjemi test ble samlet inn fra 20 pasienter før EGFR-TKI behandling og etter oppkjøpet av EGFR-TKI motstand med skriftlig informert samtykke. Det ble lagret ved -80 ° C inntil analyse. IGFBP-3-konsentrasjonene i cellekulturmediet, og serum ble målt ved anvendelse av et humant IGFBP-3 ELISA-sett (R nedstrøms Akt signal ble vedvarende aktivert i de resistente underlinjer HCC827 /VM og HCC827 /ER.
HCC827, HCC827 /GR og HCC827 /ER2 celler ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av gefitinib og erlotinib i 72 timer i medium som inneholder 1% FBS. Celleviabilitet og IC
50 verdier ble bestemt ved hjelp av MTT-analysen.
(A) Basal uttrykk av EGFR og EGFR-relaterte signalmolekyler i HCC827, HCC827 /GR og HCC827 /ER cellene evaluert av Western blotting. Virkningene av gefitinib (B) og erlotinib (C) på EGFR-relatert signale ble også undersøkt. HCC827, HCC827 /GR og HCC827 /ER celler ble behandlet med 0,1 og 1 mikrometer gefitinib og erlotinib i 72 timer i medium som inneholder 1% FBS. Protein (30 ug) fra cellelysatene ble underkastet Western blot-analyse for de angitte proteiner.
Tap av IGFBP-3 i HCC827 /GR og HCC827 /ER Celler
Vurdering av IGFBP-3 uttrykk og IGF1R signalering i foreldre og resistente cellelinjer viste at IGFBP-tre uttrykk var signifikant nedregulert i HCC827 /GR og HCC827 /eR celler; ble imidlertid ingen signifikante forskjeller i total og aktivert IGF1R oppdaget mellom resistente og foreldre celler (figur 2). IGFBP-3-sekresjon ble signifikant redusert i HCC827 /GR og HCC827 /ER-celler i parallell med sin redusert ekspresjon nivå (figur 3B). Imidlertid ble ingen sammenheng mellom IGFBP-3-protein og mRNA-nivåer påvist (figur 3A), noe som tyder på at nedregulering av IGFBP-3 finner sted ved post-transkripsjonelle nivå.
IGFBP-3 mRNA (A) og utskilt IGFBP-3 (B) ble bestemt ved RT-PCR og ELISA i HCC827, HCC827 /GR og HCC827 /ER. ELISA ble gjentatt tre ganger, og de Feilstolpene representerer standardavvik (SD). *
P
. 0.001 sammenlignet med HCC827 celler
Følsomhet for EGFR-TKI i resistente celler ble ikke gjenopprettet ved induksjon av IGFBP-3
For å undersøke involvering av IGFBP-3 i motstanden mot EGFR-TKI, HCC827 /GR-celler ble mock-infiserte eller infisert med Ad /IGFBP-3, og induksjon av IGFBP-3-ekspresjon ble undersøkt ved Western blotting. Som vist i figur 4A, IGFBP-3-nivåene var signifikant høyere i HCC827 /GR celler infisert med forskjellige titere av ad /IGFBP-3 enn i mock-infiserte celler, som ble bekreftet ved Western blotting med et anti-flag-antistoff. Videre ble IGFBP-3 sekresjon til kulturmediet av infiserte HCC827 /GR og HCC827 /ER øket som målt ved hjelp av ELISA (Figur 4B). For å undersøke effekten av EGFR-TKI på IGFBP-3 overekspresjon celler ble cellene infisert med Ad /IGFBP-3 på 100 MOI og behandlet med EGFR-TKI. Men samtidig behandling med Ad /IGFBP-3 og EGFR-TKI ikke effektivt hemmer celledeling (Figur 4C). For å undersøke rollen til IGFBP-3 i motstand lenger, ble HCC827 /GR og HCC827 /ER-celler behandlet med 1 pg /ml rekombinant human (rh) IGFBP-3 og 1 pM EGFR-TKI i 72 timer. Kombinert behandling resulterte i en moderat vekst-inhibering i HCC827 /GR og HCC827 /ER (37,0% og 32,8%, respektivt) til tross for den høye konsentrasjonen av rh IGFBP-3 (figur 4D). Selv om restaurering av IGFBP-3 hemmet IGF1R aktivitet, kan det ikke redusere Akt aktivitet (figur 4E og F). Tilsvarende, undertrykkelse av IGFBP-3 forbedret svakt den IGF1R aktivitet (data ikke vist), men følsomheten til EGFR-TKI ble ikke påvirket (figur 4G og H). Disse resultatene viser at selv om induksjon av IGFBP-3 litt økt effekt av EGFR-TKI, var utilstrekkelig til å overvinne EGFR-TKI-ervervet resistens, noe som indikerer at tapet av IGFP-3 kan ikke være den viktigste resistensmekanismen i HCC827 celler.
Resistente celler ble infisert med Ad /IGFBP-3 måneder ved 0 til 100 PFU /celle i 48 timer og IGFBP-3 ble bestemt ved Western-blotting (A) og ELISA (B). (C) HCC827 /GR og HCC827 /ER celler ble behandlet med den angitte konsentrasjon av EGFR-TKI i 72 timer etter infeksjon med 100 MOI av Ad /IGFBP-3. (D) HCC827 /GR og HCC827 /ER-celler ble behandlet med 1 pM EGFR-TKI og 1 mikrogram /ml rh IGFBP-3 i 72 timer. Resultatene er representative for minst tre uavhengige eksperimenter, og de Feilstolpene representerer standardavvik (SD). (E og F) Celler ble behandlet med medikamenter, rh IGFBP-3 eller Ad /IGFBP-3 som i panel C og D. Etter 24 timer ble cellene høstet og modulering av EGFR og IGF1R signalering i de angitte cellelinjer ble detektert ved Western blotting. (G) Kontroll og IGFBP-3 sirnas (100 nM) ble innført i HCC827 celler, og IGFBP-3 suppresjon ble bekreftet ved Western blotting. (H) Celleviabilitet ble målt ved hjelp av MTT-analysen 72 timer senere.
Serum IGFBP3 Levels ikke er korrelert med Motstand mot EGFR-TKI
Serum IGFBP-3 nivå ble målt ved ELISA i 20 NSCLC pasienter som viste partielle responser til EGFR-TKI behandling. Av disse 20 pasientene, 16 hadde EGFR mutasjoner og fire ble ikke vurdert. Serum IGFBP-3 nivåer ble ikke endret som reaksjon på utviklingen av resistens mot EGFR-TKI (1815,3 ± 94,6 ng /mL før behandling vs. 1778,9 ± 87,8 ng /ml etter EGFR-TKI motstand, p = 0,678, figur 5).
IGFBP-3-nivåer ble bestemt ved hjelp av ELISA i serum hos pasienter med NSCLC. Ervervet resistens utvikles hos alle pasienter som i utgangspunktet responderte på EGFR-TKI.
Diskusjoner
IGF pathway spiller en rolle i reguleringen av fosterets utvikling, vekst vev og metabolisme. To forskjellige ligander (IGF-1 og IGF-2) pluss insulin, og to reseptorer (IGF-1R og insulin reseptor) kan sørge for både homo- og heteropolymerisation mediere virkningene av denne reaksjonsvei [22]. IGF-1R har en 15- til 20-ganger høyere affinitet for IGF-1 enn for IGF-2, og alle IGFBP har en større affinitet for IGF-liganden enn de tilsvarende IGF-reseptorer. Derfor blir aktivitetene til IGF strengt regulert av en familie av IGFBP, og minst seks IGFBP (IGFBP-1 til IGFBP-6) har blitt identifisert. Blant dem, IGFBP-3 er den dominerende sirkulerende bindende partner av IGF, sto for 70-80% av IGF-1 bindende [23]. IGFBP-3 har lenge vært etablert som en potent negativ regulator av IGF-1 R-aktivering, og antas å blokkere ligandbinding, men det kan også ha IGF-uavhengig antiproliferative aktiviteter [24].
Dereguleringen av IGF-signalisering har blitt beskrevet i flere krefttyper, inkludert lungekreft. Nylig, hemming av IGFR ble vist å øke vekst-hemmende og apoptotiske virkninger av geftinib i H1650 celler, som viser primære motstand mot EGFR-TKI tross for at en sletting mutasjon på ekson 19 av EGFR-genet. Dette resultatet antydet at kombinert hemming av IGFR kan være nyttig for å overvinne motstanden mot EGFR-TKI i lungekreft [25]. En rekke av IGF-reseptor-inhibitorer, inklusive monoklonale antistoffer og lavmolekylære inhibitorer er for tiden i kliniske forsøk.
IGFBP-3 ekspresjon markert nedregulert i A431 gefitinib-resistente celler, som er utviklet under betingelser med kronisk EGFR inhibering [ ,,,0],18], og behandling av disse cellene med AG1478, en EGFR-TKI, nedregulerer IGFBP-3 [26]. Disse resultatene kan forklare tilpasning av celler dyrket under forhold med EGFR-hemming, som aktiverer den IGFIR vei som fører til PI3K /AKT signalering. Re-eksponering av A431-celler GR til IGFBP-3 resensitised både PI3K reaksjonsveien og celleoverlevelse til effektene av gefitinib [18]. Imidlertid har en modell av ervervet resistens mot gefitinib i EGFR muterte lungekreftceller ikke blitt utviklet til dags dato, til tross for at kjøpet av EGFR-TKI motstand hos NSCLC pasienter med EGFR mutasjoner understreker dens klinisk relevans. Derfor, i denne studien, etablerte vi to EGFR-TKI-resistente underlinjer (HCC827 /GR og HCC827 /ER) fra foreldre HCC827 celler, som er følsomme for EGFR-TKI grunn av sletting mutasjon i ekson 19, ved kontinuerlig eksponering for gefitinib og erlotinib.
Begge cellelinjer viste nedregulering av IGFBP-tre uttrykk ved Western blotting uten endringer i transkripsjonen aktivitet og uavhengig av motstand mekanisme. Videre er nivået av utskilt IGFBP-3 i kulturmediet av resistente celler ble signifikant redusert som vist ved ELISA. Det ble imidlertid ikke endringer i IGFR signale oppdaget til tross for tapet av IGFBP-3. Dette resultatet motsier det av en tidligere studie som viser at tap av uttrykk for IGFBP i tumorceller behandlet med EGFR-TKI aktiverer IGFIR signaliserer [18]. Dette avviket kan ha vært forårsaket av samtidige endringer i ligander som IGF-1 eller IGF-2, nivå av IGFBP-3 selv om dette begrepet bør utforskes videre.
Lee et al. undersøkte effekten av IGFBP-3 for NSCLC-celler etter infeksjon med adenovirus konstitutivt uttrykker IGFBP-3 under kontroll av cytomegalovirus-promoteren (Ad5CMV-BP3). IGFBP-3 overekspresjon inhiberte fosforylering av Akt og glykogensyntasekinase-3β og aktiviteten av MAPK. Videre IGF-1 reddet NSCLC celler fra serum uttømming-indusert apoptose, og dette redning ble blokkert i Ad5CMVBP-3-infiserte H1299 NSCLC celler [21]. Imidlertid, i den foreliggende undersøkelse, tvunget ekspresjon av IGFBP-3 med infeksjon med en adenoviral vektor eller tilsetning av rekombinant IGFBP-3 bare svakt økt vekst-inhiberende og apoptotiske virkninger av EGFR-TKI. En studie av Chang et al. viste at redusert IGFBP-3 ekspresjon var signifikant assosiert med kortere sykdomsspesifikk overlevelse i stadium I NSCLC og indikerte at hypermethylation av IGFBP-3-promoteren kan være assosiert med nedregulering av IGFBP-3 [27], [28]. Betydningen av IGFBP-3 i regulering av NSCLC celleproliferasjon, clonogenicity, og tumorvekst ble vist i en in vitro-studie av den samme gruppen. I en nyere undersøkelse, IGFBP-3-ekspresjon ble ikke korrelert med kliniske variabler og er ikke signifikant assosiert med respons på kjemoterapi og overlevelse [29], [30].
Total, en tilknytning mellom EGFR -TKI behandling og endringer i IGFBP-3 nivåer har ikke blitt støttet av aktuelle data. I denne studien, serum IGFBP-3 nivåer målt før EGFR-TKI behandling og etter utbyggingen av EGFR-TKI motstand på 20 NSCLC pasienter viste ingen signifikante endringer (1815,3 ± 94,6 ng /ml før behandling vs 1778,9 ± 87,8 ng /ml etter EGFR-TKI motstand). IGFBP-3 er hovedsakelig produsert og utgitt av lever Kupffer og endotelceller i den systemiske sirkulasjonen å påvirke auxological vekst via endokrin regulering [31]. Derfor kan den andel av sirkulerende IGFBP-3 utskilt fra lungekreftceller være for liten for påvisning av betydelige endringer i forbindelse med utvikling av resistens, til tross for tapet av IGFBP-3 i lungecancerceller.
Endelig vi gjentok samme eksperimentene på PC-9 celler med en sletting mutasjon på ekson 19 av EGFR å validere vår observasjon. Tidligere etablerte vi gefitinib-resistente celler (PC-9 /GR) fra PC-9 celler [32]. Selv om PC-9 /GR celler ervervet T790M-mediert motstand, redusert uttrykk av IGFBP-3 ble også funnet i dem (Supplementary figur S1). Følgelig gjeninnføring av IGFBP-3 i PC-9 /GR celler eller stanse av IGFBP-3 i PC-9 celler ikke påvirker følsomheten til EGFR-TKI.
I sammendraget, selv om IGFBP-3 downregulation er assosiert med oppkjøpet av EGFR-TKI motstand uavhengig av den underliggende mekanismen, dens beskjeden effekt på motstand påvist i denne studien tyder på at IGFBP-3 ikke spiller en viktig rolle i motstanden av NSCLC celler til EGFR-TKI behandling. Videre våre resultater tyder på at serum IGFBP-3 er ikke en nyttig markør for motstand i avansert NSCLC.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
IGFBP-tre uttrykk ikke påvirker følsomheten til EGFR-TKI i PC-9 celler. Basal ekspresjon og mRNA av IGFBP-3 i PC-9, PC-9 /GR og PC-9 /ER-celler ble evaluert ved hjelp av Western blotting (A) og RT-PCR (B). (C) PC-9 /GR-celler ble infisert med Ad /IGFBP-3 måneder ved fra 0 til 100 PFU /cellene i 24 timer og IGFBP-3-ekspresjon ble bestemt ved Western blotting. (D) PC-9 /GR-celler ble behandlet med den angitte konsentrasjon av gefitinib og 1 mikrogram /ml rh IGFBP-3 i 72 timer etter infeksjon med 100 MOI av Ad /IGFBP-3. Cellelevedyktigheten ble målt ved anvendelse av en ADAM-MC automatisk celleteller. Resultatene er representative for minst tre uavhengige eksperimenter, og de Feilstolpene representerer standardavvik (SD). (E) Kontroll og IGFBP-3 siRNA (100 nM) ble innført i PC-9-celler, og IGFBP-3 suppresjon ble bekreftet ved Western blotting. (F) Celleviabilitet ble målt ved hjelp av MTT-analysen 72 timer senere
doi:. 10,1371 /journal.pone.0081393.s001 plakater (TIF)
