Abstract
Innledning
iboende og ervervet cisplatin motstand reduserer effektiviteten av denne agenten i forvaltningen av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Å forstå de molekylære mekanismer som ligger under denne prosessen kan resultere i utvikling av nye midler for å forbedre følsomheten av cisplatin.
Methods
En isogene modell av cisplatin motstand ble generert på et panel av NSCLC cellelinjer (A549, SKMES-en, MOR, H460). Over en periode på tolv måneder, ble cisplatin resistente (CisR) cellelinjer avledet fra opprinnelige, alderstilpassede ordnede celler (PT) og deretter karakterisert. Spredning (MTT) og klonogene overlevelsesanalyser (krystallfiolett) ble utført mellom PT og CisR celler. Cellulær respons overfor cisplatin-indusert apoptose og cellesyklusfordeling ble undersøkt ved FACS-analyse. Et panel av kreft stamcelle og pluripotente markører ble undersøkt i tillegg til de EMT proteiner, c-Met og β-catenin. Cisplatin-DNA adduktdannelse, skade DNA (γH2AX) og cellulær platina opptak (ICP-MS) ble også vurdert.
Resultater
Karakterisering studiene viste en redusert proliferativ kapasitet på lunge kreftceller i respons til cisplatin, økt motstand mot cisplatin-indusert celledød, akkumulering av resistente celler i G0 /G1-fasen av cellesyklusen og forbedret klonogene overlevelsesevne. Videre resistente celler viste en antatt stilk lignende signatur med øket ekspresjon av CD133 + /CD44 + celler og øket ALDH-aktivitet i forhold til deres tilsvarende parentale celler. Stamcellemarkører, Nanog, okt-4 og SOX-2, ble betydelig oppregulert som var EMT markører, c-Met og β-catenin. Mens resistente underlinjer demonstrert redusert opptak av cisplatin i respons på behandling, redusert cisplatin-GPG DNA adduktdannelse og betydelig redusert γH2AX foci ble observert i forhold til foreldrecellelinjer.
Konklusjon
Våre resultater identifisert cisplatin resistente subpopulasjoner av NSCLC celler med en antatt stilk-lignende signatur, noe som gir en videre forståelse av de cellulære hendelser assosiert med cisplatin motstand fenotype i lungekreft
Citation:. Barr MP, Gray SG, Hoffmann AC, Hilger RA , Thomale J, O’Flaherty JD, et al. (2013) Generasjon og Karakterisering av Cisplatin-Resistant ikke-småcellet lungekreft cellelinjer Vise et Stem-Like signatur. PLoS ONE 8 (1): e54193. doi: 10,1371 /journal.pone.0054193
Redaktør: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University Hospital, Taiwan
mottatt: 07.02.2012; Godkjent: 10. desember 2012; Publisert: 17 januar 2013
Copyright: © 2013 Barr et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Mer enn en million tilfeller av lungekreft er diagnostisert. hvert år. Sykdommen er den ledende årsak til kreft dødsfall hos menn og kvinner [1]. Til tross for intensive arbeidet med å kontrollere sykelighet og dødelighet av lungekreft, forblir samlet fem års overlevelse dårlig.
Cisplatin,
cis
-Diamminedichloro-platina (II), er en av de mest vanligvis brukes kjemoterapeutiske midler ved behandling av kreft, spesielt ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) [2]. De cytotoksiske virkninger av cisplatin blir mediert av dets interaksjon med DNA, noe som resulterer i dannelsen av DNA-addukter som aktiverer flere signaltransduksjonsveier og munner ut i aktivering av apoptose [3]. Mens 20-40% av pasienter med metastatisk NSCLC oppleve en delvis respons til nyutviklede kombinasjonsterapier [4], de fleste reagerer tilbakefall innen seks måneder [5]. Innenfor befolkningen av pasienter som opplever tilbakefall, har valget av pre-eksisterende resistente celler og /eller oppkjøp av resistente celler under behandling med kjemoterapi blitt foreslått. Derfor er en bedre forståelse av den molekylære basis for cisplatin motstand garantert for å belyse de mekanismer og markører ligger til grunn for dette medikament-resistent fenotype, som for tiden radikalt begrenser den kliniske anvendelsen av dette stoffet i lungekreftpasienter.
Nylig, kreft stamcelle (CSC) teori ble foreslått for å forklare tumor heterogenitet og karsinogenese [6]. Ifølge denne modellen, kan svulster bli sett på som et resultat av unormal organogenese drevet av CSC. Disse er selv-fornyende tumorceller som er i stand til å initiere og opprettholde tumorvekst gjennom subpopulasjoner av tumorceller med stilk eller progenitor-cellekarakteristikker. Ved hjelp av
in vitro
systemer og
in vivo
modeller av humane primære lungekreft xenograft i mus, har nyere forskning vist at lungetumorceller uttrykker spesifikke CSC markører var svært tumorigen, utrustet med stilk-lignende funksjoner og spart ved behandling med cisplatin [7].
i denne studien har vi generert og karakterisert et panel av cisplatin resistente NSCLC cellelinjer, og gir et verdifullt verktøy for å undersøke molekylære stier og antatte stamceller markører som kan være forbundet med denne motstanden fenotype i lungekreft.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
Den menneskelige store kreftcellelinje celle lunge, NCI-H460 (heretter referert til som H460) og motstandsdyktig variant ble velvillig donert av Dr. Dean Fennell, Centre for Cancer Research and Cell Biology, Queens University Belfast [8]. Den humane adenokarsinom-cellelinje, MOR [9], og dens tilsvarende cisplatin resistent variant ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC) (LGC Promochem, Teddington, UK). A549 (adenokarsinom) og SKMES-1 (plateepitel carcinom) cellelinjer ble også anskaffet fra ATCC [10], [11]. MOR og H460-celler ble dyrket i Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) medium. A549-celler ble dyrket i Hams F12 medium supplert med 4 mM L-glutamin, mens SKMES-1-celler ble dyrket i EMEM-media supplert med 2 mM L-glutamin og 1% ikke-essensielle aminosyrer (NEAA). For alle cellelinjer, ble mediet supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS), penicillin (100 U /ml) og streptomycin (100 ug /ml) (Lonza, Storbritannia). Alle celler ble dyrket som monolagskulturer og vedlikeholdes i en fuktig atmosfære med 5% CO
2 i luft ved 37 ° C.
Narkotika
Cisplatin [
cis
-diammineplatinum (II) diklorid] ble erholdt fra Sigma-Aldrich og oppløst i 0,15 M NaCl. Prøver ble lagret ved -20 ° C i opp til maksimalt tre måneder og tint umiddelbart før bruk.
Induksjon av Cisplatin-Resistance hos NSCLC Cells
Cisplatin bestandig (CisR) varianter av hver cellelinje ble avledet fra hver originalforeldre (PT) cellelinje ved kontinuerlig eksponering for cisplatin (Sigma-Aldrich, UK) ved å følge innledende dose-responsstudier av cisplatin (0,1 uM-100 uM) i løpet av 72 timer for IC
50-verdier ble oppnådd. Til å begynne med hver sublinje CisR ble behandlet med cisplatin (IC
50) i 72 timer. Mediet ble fjernet og cellene ble tillatt å komme seg i en ytterligere 72 h. Denne utviklingsperiode ble gjennomført i omtrent 6 måneder, hvoretter IC
50-konsentrasjoner ble gjen vurderes i hvert enkelt resistent cellelinje. Celler ble så holdt kontinuerlig i nærvær av cisplatin ved disse nye IC
50 konsentrasjoner i ytterligere 6 måneder. Mens A549-cellene ble først behandlet med IC
50 konsentrasjoner av cisplatin ble cellene følsomme overfor behandling ved denne konsentrasjonen som resulterer i celle-senescens og forsinket vekst. Av denne grunn ble den cisplatin-konsentrasjonen redusert (IC
25) inntil cellene viste følsomhet for cisplatin på riktig IC
50 konsentrasjon.
Drug Sensitivity Assay (MTT)
Celler (2,5 x 10
3) ble sådd ut i 96-brønners plater og tillatt å holde seg over natten ved 37 ° C. I korthet, etter behandling av celler med cisplatin i 72 timer, MTT-reagens [3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid] ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 4 timer ved 37 ° C . Dimetylsulfoksyd (DMSO) ble tilsatt til hver brønn og blandet i 5 min på en orbital-rystemaskin. Absorbansen ble registrert ved 595 nm og følsomhet for cisplatin ble beregnet på grunnlag av celleproliferasjonsprosesser målinger ved 72 h
Cell Cycle Apoptose Analyse
Celler ble oppsamlet ved trypsinering, pelletert ved sentrifugering ved 1300 rpm i 3 min og suspendert i 1 ml fosfat-bufret saltvann (PBS). Celler ble deretter fiksert i 90% kald etanol og inkubert ved romtemperatur i 30 min. Celler ble pelletert og resuspendert i 1 ml PBS inneholdende propidiumjodid (25 ug /ml) og DNase-fri RNase A (100 pg /ml). Etter inkubasjon ved 37 ° C i 30 minutter, ble cellesyklusfordelingen av PT og CisR cellene analysert ved hjelp av FACS (Becton Dickinson, UK). Apoptotiske celler (SubG0) ble målt i respons til økende konsentrasjoner av cisplatin mellom PT og CisR celler etter behandling i 24 timer.
klonogene Survival analysen
følsomhet NSCLC celler til cisplatin ble målt ved hjelp av den klonogene analysen metoden for valg anvendes for å bestemme effektiviteten av cytotoksiske midler så som kjemoterapi [12]. Celler ble tillatt å holde seg over natten ved 37 ° C og behandlet med økende konsentrasjoner av cisplatin i 9-14 dager. Kolonier ble fiksert og farget med metanol (25% v /v) inneholdende krystallfiolett (0,05% vekt /volum) i 30 min, hvoretter resterende fargeløsning som ble fjernet og platene ble vasket med vann. Kolonier bestående av 100 celler eller mer ble telt med ColCount ™ koloniteller (Oxford Optronix Ltd, Oxford, UK). Plating effektivitet (PE) ble beregnet ved hjelp av formelen: PE = Antall kolonier /Antall celler sådd. Den gjenlevende fraksjon (SF) ble beregnet ved hjelp av formelen: SF = Antall kolonier /Antall celler seeded × PE). Overlevelseskurver ble konstruert for å bestemme overlevelse evne til cisplatin-resistente celler i forhold til foreldreceller i respons til forskjellige konsentrasjoner av cisplatin.
Flow Cytometry Analyse av antatte kreftmarkører Stem Cell
Parent og cisplatin -resistente celler ble samlet opp ved trypsination og vasket i FACS-buffer (2% FBS 0,1% natriumazid i PBS) og pelletert ved sentrifugering ved 1300 rpm i 3 min. Dual farging for CD133 og CD44 (epitelcelledifferensiering markør) ble utført. -Celler (1 x 10
6) ble inkubert med enten CD133 /1 (AC133) fykoerytrin (PE) -merket antistoff eller isotype kontrollantistoff (lgG1) (Miltenyi Biotec GmbH), eller anti-human CD44 FITC-konjugert antistoff og tilsvarende isotypekontroll (IgG2b) (ImmunoTools GmbH, Tyskland) i 30 minutter i mørke ved 4 ° C. Cellene ble vasket en kort stund og resuspendert i FACS-buffer for senere analyse. Prøvene ble kjøpt og analysert ved FACS. Side scatter og termin scatter profiler ble brukt til å fjerne rusk og celle dubletter. Prosent CD133 + og CD44 + celler ble bestemt i PT og CisR cellelinjer ved flowcytometri.
Aldefluor analysen
Aldefluor Kit (Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada) ble brukt til å identifisere cellepopulasjoner med aldehyd dehydrogenase (ALDH1) aktivitet. Analysen ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet ble celler (1 x 10
6 celler /ml) ble høstet fra PT og CisR cellelinjer og resuspendert i Aldefluor prøvebuffer og inkubert i 60 minutter ved 37 ° C. Mengden av fluorescerende ALDH reaksjonsprodukt som akkumuleres i cellene korrelerer direkte til ALDH-aktivitet i disse cellene. Aktiv utstrømning fra cellene inhiberes av den spesielle utformingen av Aldefluor målingsbuffer. For hver cellelinje (PT og CisR), ble kontrollcellene farget ved å bruke de samme betingelser, men med en spesifikk ALDH-inhibitor, diethylaminobenzaldehyde (DEAB), for å tjene som en negativ kontroll for hvert eksperiment. Slike celler blir gjenkjent ved å sammenligne fluorescensen i en testprøve til at i en kontrollprøve inneholdende DEAB. Som bare celler med intakt cellemembran kan beholde den Aldefluor reaksjonsproduktet, ble det bare levedyktige ALDH1-positive celler identifisert. De lyst fluourescent ALDH1-uttrykke celler (ALDH1-positive) ble påvist i det grønne fluorescerende kanalen (520-540 nm) av en cyan
ADP flowcytometer (Dako, Glostrup, Danmark) og beregnet som prosent ALDH1-positive celler i hver cellelinje.
Western blot analyse
Total protein ble utvunnet fra moder og cisplatin-resistente celler ved bruk av is-kald RIPA-buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% (v /v) Triton-X-100, 0,1% (w /v) SDS) supplert med fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) og protease-inhibitor cocktail (2 mM AEBSF, 1 mM EDTA, 130 uM bestatin, 14 uM E-64, 1fiM Leupepin, 0,3 mikrometer Aprotinin). Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved hjelp av bicinchoninic syre analysen som i henhold til produsentens instruksjoner (BCA). Protein (40 ug) fra helcellelysater ble fraksjonert på 12% SDS-PAGE-geler og overført til en PVDF-membran (Pall Corporation, FL, USA). Overføringseffektivitet og lasting ble bekreftet ved reversibel farging av membranen med Ponseau S oppløsning (Sigma-Aldrich, UK) ved å følge proteinet overføring. Membranene ble blokkert ved romtemperatur med 5% ikke-fett tørrmelk i Tris-bufret saltvann (TBS) inneholdende 0,1% Tween-20 (TBS-T) og screenet ved anvendelse av en human embryonal stamcelle markør panel (Abcam plc, Storbritannia) . Disse inkluderte primær kanin polyklonale mus antistoffer mot Nanog, Oct-4 og SOX-2 (1:1000). Protein uttrykk for c-Met (Millipore) og β-catenin (BD Transduction Laboratories) ble også undersøkt ved hjelp av musen monoklonale antistoffer ved 1:100 og 1:2000 hhv. Membranene ble vasket i TBST og inkubert med en sekundær pepperrot peroksidase (HRP) -merket antistoff i 1 time ved romtemperatur (1:2000). Membranene ble vasket i TBST etter inkubasjon med sekundære antistoffer. Bundet antistoffkomplekser ble funnet og visualisert ved hjelp SuperSignal
® West Pico forbedret chemiluminescence substrat (Pierce, IL, USA). Blotter ble strippet og re-undersøkt med α /β Tubulin antistoff (Cell Signal) for å kontrollere for lasting. Densitometrisk analyse ble utført med TINA ™ programvare og prosentvis uttrykk representert i forhold til kontroller (100%).
immunfluorescens mikroskopi og måling av Cisplatin-DNA addukter
Cells (PT og CisR) ble behandlet med cisplatin (IC
50) for 0, 4, 12 og 24 timer etter hvilken tid de ble oppsamlet ved trypsinering og vasket to ganger i PBS. -Celler (1 x 10
6 celler /ml) ble resuspendert i PBS og flekket (10 ul), in triplo, på Superfrost gull lysbilder (ThermoFisher). Lysbilder fikk lov til å lufttørke kort ved romtemperatur. Immunfluorescens farging og måling av spesifikk DNA platination produktene ble utført som tidligere beskrevet [13], med mindre modifikasjoner. I korthet ble cellene fiksert over natten i is-kald metanol og utsatt for proteolytisk spalting med 60 ug /ml pepsin og 40 ug /ml proteinase K (100 ul pr sted i 10 minutter ved 37 ° C i et fuktet kammer). Etter blokkering av ikke-spesifikke bindingsseter med 5% (vekt /volum) fettfri tørrmelk i PBS, ble objektglassene inkubert med en rotte primært antistoff som spesifikt gjenkjenner CDDP-GPG-DNA-addukter (RC-18) ved 37 ° C i 2 timer eller 4 ° C over natten. Primært antistoff-binding ble påvist ved anvendelse av et anti-rotte Cy3®-merket antistoff (Dianova, Hamburg). Objektglass ble deretter inkubert i 1 ug /ml (vekt /volum) DAPI i PBS i 30 minutter ved romtemperatur for atomkontra. Bilder ble ervervet på en Axioplan fluorescens mikroskop (Carl Zeiss GmbH, Göttingen, Tyskland) koblet til en C4880 CCD-kamera (Hamamatsu Photonics, Ching, Tyskland). For kvantifisering av CDDP-GPG DNA-addukter ved immunofluorescens-mikroskopi, ble fluorescenssignaler målt ved hjelp av kvantitativ digital bildeanalyse ved hjelp av ACAS 6,0 CytometryAnalysis System (ACAS II, Ahrens Electronics, Bargterheide, Tyskland). Nivåer av addukter i hver prøve ble beregnet som vilkårlige fluorescensenheter (AFU-tallet), etter normalisering av integrerte antistoff-avledet fluorescens fra 200 individuelle kjerner /prøve til det tilsvarende DNA-innhold. Data er presentert som gjennomsnitts AFU ± 95% konfidensintervall (KI) fra tre uavhengige eksperimenter.
γH2AX Foci Formation analysen
Cells (5 × 10
3) var seeded, i triplo i 96-brønners plater og tillatt å holde seg over natten. Foreldre og resistente celler ble behandlet med cisplatin for 0, 4, 8, 12 og 24 timer. Ved hvert tids punkt, ble cellekulturmedium fjernet fra hver brønn og fiksert i 10 minutter i 100 ul formaldehyd (4% volum /volum i PBS). Cellene ble deretter vasket to ganger i PBS. Blokkeringsbuffer (5% geiteserum, 3% Triton X-100 i PBS) ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 1 time ved romtemperatur. Cellene ble så inkubert over natten ved 4 ° C med et primært kanin anti-humant anti-fosfo-histon 2AX (Ser139) antistoff (1:100) (Cell Signal Technology) i antistoff fortynningsbuffer (1% Triton X-BSA.0.3% 100 i PBS). Etter fjernelse av det primære antistoff, ble cellene vasket tre ganger i PBS og inkubert med Alexafluor 488-merket geit anti-kanin sekundært antistoff (Invitrogen) (1:2000) i 1 time ved romtemperatur i mørket. Sekundært antistoff ble fjernet og cellene ble vasket tre ganger i PBS. Cellene ble deretter inkubert med Hoechst 33342 nukleær flekk (3 ug /ml) i 30 minutter ved 37 ° C, etterfulgt av tre vaskinger i PBS. Celler farging for fosforylert histon 2AX (detektert som grønn fluorescerende foci) ble fotografert ved immunofluroescence hjelp av høy innholdsanalyse (GE Healthcare). Ti synsfelt per brønn ble anskaffet ved hjelp av en 20X objektiv. Nukleær farging ble påvist ved anvendelse av en eksitasjon filter på 360 nm og emisjonsfilter på 460 nm, mens Alexafluor 488 ble påvist ved 480 nm og 535 nm, respektivt. Mener kjernekraft fluorescens intensitet ble brukt som et mål på γH2AX hjelp Incell analysator 1000 bildeanalyse programvare.
Kvantifisering av Cellular Cisplatin opptak av ICP-MS
For cisplatin opptak studier, celler (1 x 10
7 celler /ml) ble sådd i kulturflasker og lov til å følge over natten. Cellene ble deretter behandlet med cisplatin i 24 timer. Etter behandling ble cellene vasket i PBS, høstet og tellet. For medikamentopptak analyse,-celler (1 x 10
6) ble suspendert i 1% HNO
3 i 24 timer ved 70 ° C. Lyserte celler ble analysert ved hjelp av induktivt koblet plasma-massespektrometri (ICP-MS). ICP-MS gir en kvantitativ analyse av konsentrasjonen av et element i vandig oppløsning og har en sensitivitet på 5 PPT eller bedre for Platinum produkter. Den analytt-konsentrasjonen er proporsjonal med antallet av ioner av et spesifikt element som kommer til massespektrometeret fra den fordampede oppløsning ved 6000 ° C. En enkelt ICP-MS måling representerer gjennomsnittet av 20 skanninger per replikere i løpet av fem replikater av den samme væskeprøve, med en meget liten feil (mindre enn 5%). Cisplatin konsentrasjoner ble i gjennomsnitt over fire serier av kulturer, slik at verdiene er riktig skalert til å gjøre rede for celle befolknings forskjeller og fortynninger.
Standardkurver ble generert ved hjelp av vann serielle fortynninger av lagerløsninger sporbar tilbake til standard referansemateriale (SRM) fra NIST (National Institute of Standards and Technology). Koeffisientene til variasjon varierte fra 1 til 4% (intra-assay) og fra 5 til 10% (inter-assay).
Statistical Analysis
Statistisk sammenligning mellom grupper ble utført ved anvendelse av analyse av varians (ANOVA). Der hjelp av to datasettene ble sammenlignet, ble betydningen bestemt av en to-tailed Studenter
t-
test. Forskjeller ble ansett for å være statistisk signifikant der p≤0.05. Data er grafisk representert som gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM). Alle data ble analysert ved hjelp GraphPad INSTAT ™ (versjon 3) statistisk programvare.
Resultater
Generering av IC
50 Konsentrasjoner og utvikling av NSCLC Celler med en Cisplatin bestandig Phenotype
for å bestemme IC
50-verdier som kan brukes til å behandle foreldrecellelinjer i genereringen av cisplatin-resistente cellelinjer, ble cellene behandlet med økende konsentrasjoner av cisplatin som strekker seg fra 0,1 uM til 100 uM. Den H460 CisR cellelinje ble tidligere generert og vedlikeholdes med 5 mikrometer cisplatin. Følsomheten for hver original (PT) cellelinje for økende doser av cisplatin ble demonstrert, hvor cisplatin signifikant (p 0,001). Inhiberte proliferasjonen av A549, SKMES-1 og MOR-celler ved 10 uM-100 uM i løpet av 72 h (fig 1A ). Dose-responskurver ble generert og IC
50 konsentrasjonene ble beregnet for alle cellelinjer (Fig. 1B). Cisplatin konsentrasjoner (IC
50) varierte mellom alle fire cellelinjer (
A549
5,95 mikrometer,
SKMES-en
2,65 mikrometer,
MOR
3,3 mikrometer,
H460
5,0 uM), og ble deretter brukt til å behandle hver av foreldrene cellelinje for å generere tilsvarende alder og passasje-matchet cisplatin-resistente cellelinjer. I tilfellet med H460-celler ble vedlikehold av resistente sublinje fortsatt ved 5 uM. Behandling av A549 celler med cisplatin (IC
50) resulterte i betydelig vekst forsinkelse, med langsomme utvinning perioder. Celler ble derfor behandlet med IC
25 konsentrasjoner i flere uker før valg av et cisplatin resistente sublinje på IC
50 konsentrasjon.
(A) NSCLC-celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av cisplatin ( 0,1 uM-100 uM) i 72 timer. Celleoverlevelse ble målt ved anvendelse av MTT-analysen. Cisplatin betydelig redusert spredning av A549, SKMES-en og MOR NSCLC celler. (B) Dose-respons-kurver ble generert fra hvilken IC
50 verdiene ble utledet. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM fra tre uavhengige eksperimenter (n = 3) (* p 0,001 vs ubehandlet)
Cisplatin-resistente underlinjer ble behandlet med cisplatin i 72 timer etter hvilken tid mediet ble fjernet. og cellene ble tillatt å gjenopprette og re-befolke. I løpet av denne tiden ble celle overlevelse /proliferering vurderes mellom PT og CisR celler hver 4. uke for å bestemme forandringer i følsomheten til cisplatin. Ved 6 måneder, IC
50 verdier ble undersøkt på nytt og utledet fra dose-responskurver mellom PT og CisR celler. En betydelig gangers økning ble observert i konsentrasjonen av cisplatin nødvendig for å inhibere celler med 50% i cisplatin-resistente celler i forhold til deres tilsvarende moderceller (Fig. 2). Celler ble deretter opprettholdt i cisplatin på følgende konsentrasjoner i ytterligere 6 måneder. I A549-celler, ble IC
50 konsentrasjon av cisplatin-resistente celler bestemmes så 23.60 uM sammenlignet med 1,58 uM i den opprinnelige modercellelinje, til en 15-gangers økning i konsentrasjonen av cisplatin som kreves oppnå en 50% inhibering i cellen vekst. En betydelig økning i IC
50 konsentrasjoner ble også observert i SKMES-1 celler (16,0 mikrometer vs 4,09 mikrometer), MOR celler (31.98 um vs 6,39 mikrometer) og H460 celler (30.40 um vs 5,72 mikrometer), viser en 4- fold (SKMES-1) og fem ganger (MOR, H460) vekst mellom CisR og PT-cellelinjer. Samlet utgjør disse innledende data viste en cisplatin-resistent fenotype i fire NSCLC cellelinjer etter kontinuerlig
in vitro
eksponering for cisplatin.
Etter vedlikehold av cisplatin behandlet underlinjer i kultur i 6 måneder med cisplatin , IC
50-konsentrasjoner ble gjen vurdert for hver cellelinje ved hjelp av dose-responskurver generert av GraphPad Prism software. En betydelig økning i IC
50 konsentrasjonen ble bestemt for hver cisplatin resistent cellelinje i forhold til den for den tilsvarende alderstilpassede opphavelige cellelinje.
Ved karakterisering av cellene ved 52 uker etter eksponering av celler overfor cisplatin, ble det observert en signifikant forskjell i egenskap spredning mellom PT-cellelinjer og deres tilsvarende cisplatin-resistente underlinjer (fig. 3) som indikerer fremveksten av en resistent fenotype i de resistente underlinjer i forhold til opphavscellelinjer. Mens A549 og H460 celler viste signifikante forskjeller i deres proliferative evne mellom foreldre og tilsvarende CisR celler i konsentrasjoner fra så lavt som 0,1 mikrometer (
A549
, 65,56 ± 0,73 vs 102,50 ± 0,87;
H460
, 87,66 ± 0,67 vs 114,06 ± 1,57, p 0,001) til 100 mikrometer (
A549
, 16,56 ± 0,29 vs 41,44 ± 0,94, p 0,001;
H460
, 20,89 ± 1,22 vs 34,32 ± 1,17, p 0,01), en signifikant forskjell ble også observert mellom foreldre og CisR SKMES-1 og MOR-celler ved konsentrasjoner på cisplatin som strekker seg fra 10 um (
SKMES-1
, 54,38 ± 1,56 vs 79,00 ± 2,25;
MOR
, 64,33 ± 2,33 vs 76.87 ± 2.77, p 0,01) til 100 mikrometer i SKMES-en og MOR celler, henholdsvis (
SKMES-en
, 32,79 ± 1,55 vs 59,33 ± 5,20, p 0,01;
MOR
, 34,33 ± 2,50 vs 45,33 ± 2,33, p. 0,05)
Parent (PT) og cisplatin resistente (CisR) cellelinjer ble behandlet med økende konsentrasjoner av cisplatin i 72 timer. Proliferasjon ble målt ved anvendelse av MTT-analysen. Mens cisplatin hemmet veksten av både PT og CisR cellelinjer, ble den inhiberende effekt av cisplatin sterkt redusert i CisR celler i forhold til foreldreceller. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM fra tre uavhengige forsøk (n = 3) (* p 0,001 vs PT ubehandlet,
$$ p 0,001 vs CisR ubehandlet,
# p 0,001 PT vs CisR,
$ p 0,01 vs CisR ubehandlet [A549],
$ p 0,01 PT vs CisR,
# $ p. 0,05 PT vs CisR [MOR])
Cisplatin- apoptose er betydelig opphevet i resistente celler i forhold til sine overordnede kolleger
Nivåer av cisplatin-indusert apoptose, som bestemmes ved hjelp av SubG0 (apoptotiske) brøkdel av celler, ble vurdert i PT og tilsvarende CisR cellelinjer etter behandling av celler med økende doser av cisplatin. Mens det var en signifikant økning i tumorcellelunge apoptose av PT-cellene i respons til cisplatin ved konsentrasjoner mellom 10 og 100 um, cisplatin-indusert apoptose av CisR celler ble signifikant redusert på tvers av alle cellelinjer (fig. 4), særlig A549 , SKMES-1 og H460-celler. I A549 og SKMES-1 celler ble observert betydelig celledød bare ved høyere konsentrasjoner mellom 40 mikrometer (
A549
, p 0,01;
SKMES-en
, p 0,01) og 100 mikrometer (p 0,001). Mer vesentlig er imidlertid H460 CisR celler viste større motstand mot cisplatin-indusert død ved høyere konsentrasjoner av cisplatin i forhold til andre cellelinjer, hvor signifikant induksjon av apoptose ble sett i respons til cisplatin i konsentrasjoner så høye som 80 uM (P 0,01) og 100 mikrometer (p 0,001). I alle lungetumorcellelinjer, ble det observert en signifikant forskjell i den cellulære respons på cisplatin-indusert apoptotisk celledød mellom CisR og PT-celler. Signifikante forskjeller i nivåene av apoptose mellom H460 PT og CisR celler ble sett i respons til cisplatin ved alle konsentrasjoner som varierte fra 10 uM til 100 uM, for derved å synliggjøre en større cisplatin resistent fenotype i denne CisR cellelinje.
Parent og resistente cellelinjer ble behandlet med cisplatin i 72 timer. Apoptotiske celler, som målt ved den prosentvise celler i SubG0 fasen av cellesyklusen, ble målt. Nivåene av apoptose indusert ved cisplatin ble signifikant økt i foreldreceller, mens cisplatin-indusert apoptose var signifikant redusert i den tilsvarende resistente cellelinje. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM fra tre uavhengige forsøk (n = 3) (* p 0,01 vs PT ubehandlet, ** p 0,001 vs PT ubehandlet,
$$ p 0,001 vs CisR ubehandlet,
$ p 0,01 vs CisR ubehandlet [A549, H460],
$ p 0,05 vs CisR ubehandlet [MOR],
$ p 0,05 PT vs CisR,
# p 0,001 PT vs CisR, *
$ p 0,05 vs PT ubehandlet)
cisplatin Resistant NSCLC Cells Accumulate i G0 /G1 av Cell Cycle
på basale nivåer, og som svar på økende konsentrasjoner av cisplatin. en økt akkumulering av celler i G0 /G1 fasen ble observert i alle CisR cellelinjer i forhold til sine respektive foreldrecellelinjer (fig. 5A). Representative histogrammer vises for SKMES-1 PT og CisR celler som svar på økende konsentrasjoner av cisplatin (Fig. 5B). I cisplatin-resistente cellelinjer, kan behandling med cisplatin induserte en signifikant akkumulering av celler i G0 /G1 fase, i forhold til PT-celler behandlet ved de samme konsentrasjoner. Slike observasjoner ble samtidig med en reduksjon i S-fasen av cellesyklusen. Basal fraksjoner av celler mellom G0 /G1, S og G2 /M-fasene av cellesyklusen ble også studert mellom PT og CisR cellelinjer. En betydelig økning i G0 /G1 fraksjonen ble funnet i SKMES-en CisR (61,60 ± 2,734, p 0,05) og MOR CisR (60,20 ± 0,872, p 0,05) celler i forhold til sine foreldre kolleger (47.01 ± 1.549, 42,44 ± 1,351, p 0,05). I A549 og H460 cisplatin-resistente celler, ble større betydning sett i G0 /G1 brøkdel i forhold til sine foreldre kolleger (
A549
, 85,19 ± 1,763 vs 52,83 ± 2,234,
H460
, 69.12 ± 1,987 vs 39,61 ± 2,00, p 0,001). Ved basale nivåer, er fraksjonen av celler i S og G2 /M-fasene endret seg ikke signifikant mellom PT og CisR cellelinjer. Disse endringer i cellecyklus-fordeling kan spille en viktig rolle i den cisplatin motstandsdyktig fenotypen av NSCLC-cellelinjer ble generert.
Foreldre og Cisplatin motstandsdyktig NSCLC-celler ble behandlet med cisplatin i 24 timer. Cellecyklus fordeling av PT og CisR-celler ble undersøkt ved hjelp av propidiumjodidfarging og målt ved hjelp av FACS (A). En vesentlig akkumulering av CisR celler ble observert i den G0 /G1-fasen av cellesyklusen over platen av cellelinjer. Representative histogrammer som viser cellesyklus distribusjon av SKMES-1 CisR celler og PT kolleger som svar på økende konsentrasjoner av cisplatin er vist (B). Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM fra tre uavhengige forsøk (n = 3) (
# p 0,001,
* p 0,05).
kjemoresistent NSCLC Cells Demonstrer Forbedret klonogene Survival evne
overlevelse evne PT og CisR NSCLC celler etter behandling med cisplatin ble vurdert ved hjelp av klonogene overlevelse analysen. Alle cellelinjer viste variabel motstand mellom PT og CisR celler. I de fleste av cellelinjene som ble undersøkt, var det en signifikant høyere fraksjon av overlevende kolonier av A549, SKMES-1 og H460 CisR celler i forhold til foreldreceller ved 1 pM og 10 pM av cisplatin (fig. 6).
