Abstract
E7 oncoprotein av humant papillomavirus (HPV) er et ideelt mål for utvikle immunterapeutiske strategier mot HPV-assosiert svulster. Imidlertid, fordi proteinbaserte immunogener alene er dårlige elicitors av den cytotoksiske T-lymfocytt (CTL) responser, har de vært vanskelig å utnytte for terapeutiske formål. I denne studien rapporterer vi at en rekombinant lipoprotein som består av inaktive E7 (E7m) biologisk knyttet til en bakteriell lipid enhet (rlipo-E7m) induserer modning av mus beinmarg-avledet dendrittiske celler gjennom toll-like receptor 2 (TLR2), forskyver immunresponser mot Th1 svar og induserer E7-spesifikke CTL-responser. Vi studerte videre evne rlipo-E7m å gi beskyttelse mot en TC-en svulst celle utfordring i en dyremodell. Mus profylaktisk immunisert med to 10 ug doser av rlipo-E7m ble funnet å være fri for TC-1 tumorvekst. Eksperimenter i en terapeutisk immunisering modell viste at tumorvolum hos mus som fikk en enkelt dose av rlipo-E7m var mindre enn 0,01 cm
3 på dag 40, mens tumorvolumet hos mus behandlet med rE7m var 2,28 ± 1,21 cm
3. Svulsten volumet av hele kontrollgruppen var over 3 cm
3. I tillegg demonstrerte vi at CD8 + T-celler spiller en viktig rolle i antitumorimmunitet ved administrering av rlipo-E7m. Disse resultatene viser at rlipo-E7m kan være en lovende kandidat for behandling av HPV-assosiert svulster
Citation. Huang C-Y, Chen JJW, Shen K-Y, Chang L-S, Yeh Y-C, Chen I-H, et al. (2012) rekombinant lipidert HPV E7 induserer en Th-1-Partisk immunrespons og beskyttende immunitet mot livmorhalskreft i en musemodell. PLoS ONE syv (7): e40970. doi: 10,1371 /journal.pone.0040970
Redaktør: Silke Appel, Universitetet i Bergen, Norge
mottatt: 23 november 2011; Godkjent: 18 juni 2012; Publisert: 18.07.2012
Copyright: © 2012 Huang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en Forsknings Investigator Award fra National Health Research Institutes (VC-098-PP-04 til S-JL) og (VC-098-PP-06 til C-HL). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
humant papillomavirus (HPV) infeksjon kan forklare utviklingen av flere kreftformer; spesielt kan HPV-infeksjon forårsake livmorhalskreft. Livmorhalskreft er den nest største årsaken til kreftdødsfall hos kvinner over hele verden [1]. Derfor er nye behandlingsformer sterkt behov for å kontrollere livmorhalskreftdødelighet. Hittil har HPV E6 og E7 teinene blitt identifisert som de viktigste målene for utvikling av terapeutiske vaksiner mot HPV-assosiert svulster. Videre, som intracellulære (atom) proteiner, E6 og E7-genprodukter kan være skjult fra den humorale immunrespons. Oppmerksomheten har således fokusert på dannelse av en vaksine som er i stand til å indusere eller stimulere en cellulær immunrespons mot HPV E6- og E7-oncoproteiner [2]. Flere forsøk er blitt gjort for å utvikle HPV terapeutiske vaksiner, inkludert levende vektor-, peptid /protein-, nucleic syre- og hele cellebaserte tilnærminger. Disse studiene har vist betydningen av T-celleresponser i å beskytte mot tumorer i mennesker og dyremodeller [3]. Av disse metodene, syntetiske peptid og proteinbaserte tilnærminger er de mest attraktive kandidater; imidlertid, generelt, peptid og protein alene er ikke-immunogene. Uten ytterligere hjelpestoff, er det vanskelig å indusere sterke og effektive immunresponser kjennetegnes ved produksjon av Th1 cytokiner og viral-oncoproteinet-spesifikke cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) [3].
TLR-agonister er naturlig immun-stimulerende indusere av medfødt immunitet. TLR2 uttrykkes på mange forskjellige celletyper, inkludert dendrittiske celler, makrofager og lymfocytter. Derfor er TLR2-agonister så som bakterielle lipoproteiner lovende kandidater til å bli brukt som en ny generasjon adjuvant for immunterapi.
Vi har nylig etablert en plattform for høy-utbytte produksjon av rekombinante lipoproteiner [4]. Lipid-delen av lipo-immunogen er identisk med den i bakterielle lipoproteiner, som er anerkjent som faresignaler av immunsystemet. Således kan både medfødte og ervervede immunresponser induseres ved lipoproteiner [5], [6]. Lipid struktur av det rekombinante lipoprotein er forskjellig fra den for syntetiske tri-acylerte lipopeptid [7]. Dette skillet gjør rekombinant lipoprotein fremkalte forskjellige immunresponser fra syntetisk lipopeptid ved å fremkalle ulike nivåer av biologiske cytokiner og chemokiner [8]. Vi har tidligere vist at virus-nøytraliserende antistoffresponser utløst av lipid form av et immunogen var sterkere enn de som er utløst av en ikke-lipid form av et immunogen [4], [9]. I denne rapporten, viser vi at vanskelighetene med å bruke proteiner alene til å indusere CTL-responser kan bli overvunnet ved hjelp av lipo-immunogen strategi. En lipid form av E7 mutant (rlipo-E7m) og en ikke-lipid form av rE7m fra HPV type 16 (HPV16) ble produsert, og evnen til disse immunogener for å aktivere mus benmargavledede DC (BM-DC) var vurdert. Immunresponser av B og T-celler ble også undersøkt. Til slutt, vi undersøkt om immunresponser indusert av rlipo-E7m var i stand til å beskytte mus mot tumor utfordring. Disse studiene gir ikke bare informasjon om rlipo-E7m som en lovende metode for utvikling av en terapeutisk vaksine mot HPV-assosiert svulster, men også presentere en strategi for utvikling av vellykkede immunterapi ved bruk av proteinbaserte kandidater.
Resultater
Produksjon av rekombinant immunogener
det rekombinante E7m (rE7m), som ble konstruert for å inneholde en hexahistidine tag (HisTag) ved sin C-terminal, ble produsert for å sammenligne effekten av rE7m til lipidert mål. rE7m ble renset ved anvendelse av immobilisert metall affinitetskromatografi (IMAC) kolonne (figur 1b, kolonnene 1-4). rE7m ble påvist med anti-HisTag antistoffer (Figur 1b, baner 5-8). Vi har tidligere identifisert et fusjonssekvens (D1) som kan være kondensert med en ikke-lipidert immunogen for å oppnå høye ekspresjonsnivåer av det rekombinante lipo-immunogen [4]. Ved hjelp av denne strategien ble E7m genet smeltet til D1 på sin N-terminale og konstruert en HisTag på sitt C-terminal. Dette rekombinante lipidert E7m (rlipo-E7m) ble renset ved anvendelse av IMAC-kolonne (figur 1b, sporene 9-11). rlipo-E7m ble påvist med anti-HisTag antistoffer (Figur 1b, baner 12-14). Etter lipopolysakkarid (LPS) ble fjernet (mindre enn 0,003 EU /pg), rensede rlipo-E7m og rE7m ble forholdsvis analysert for deres immunogenisitet og virkning i dyremodeller.
(a) justering av aminosyre sekvensen av villtype-HPV16 E7 (Accession nummer: NP_041326) og den inaktive E7 (E7m). Hver mutant stedet E7m er uthevet. DNA-sekvensen av den E7m-genet ble utledet ved bruk av kodonbruken av
E. coli
og fullt syntetisert ved hjelp av PCR-metoden sammenstillingen. PCR-produktet ble klonet inn i pET22b vektoren for ekspresjon rE7m og inn i den modifiserte pET22b vektoren med en lipid signalpeptid for rlipo-E7m uttrykk. De rekombinante proteinene inneholdt en ytterligere hhhhhh sekvens (HisTag) i C-terminus og ble uttrykt under kontroll av T7-promoteren. (B) rlipo-E7m og rE7m proteinrenseprosessen ble overvåket ved bruk av 15% reduserende SDS-PAGE etterfulgt farget med Coomassie-blått-farging og immunblotting ved anvendelse av anti-HisTag antistoffer. Det rekombinante rlipo-E7m ble uttrykt i
E. coli
stammer C43 (DE3). Lane 1, rE7m uttrykk etter IPTG induksjon; kolonne 2, protein ekspresjon i fravær av IPTG-induksjon; spor 3, hentet brøkdel av rE7m; lane 4, renset rekombinant rE7m. Baner 5-8 viser immunoblottingforsøk å overvåke rE7m renseprosessen, og prøvene i disse baner, er de samme som de i baner 1-4, henholdsvis. Lane 9, rlipo-E7m uttrykk etter IPTG induksjon; kjørefelt 10, protein ekspresjon i fravær av IPTG-induksjon; lane 11, renset rlipo-E7m. Kolonnene 12-14 viser immunblotting for å overvåke rlipo-E7m renseprosessen, og prøvene i disse baner, er de samme som de i kolonnene 9-11, respektivt. Den ikke-lipidert form av rE7m ble uttrykt i
E. coli
BL21 (DE3) stjerners belastning. Pilene viser de elektro posisjonene til rE7m eller rlipo-E7m i geler eller blottene. (C) Intakt rlipo-E7m ble analysert ved LC /MS. LC /MS-analyse viste nærvær av fem hoved posttranslasjonelle modifiseringer av rlipo-E7m. Molekylmasser (i dalton) ble bestemt med en maksimal entropi algoritme. De fem store topper vises masser av 15384,5, 15400, 15412,5, 15426 og 15439. (d) N-terminale rlipo-E7m fragmenter ble innhentet og identifisert etter fordøyelse av rlipo-E7m med trypsin. Det fordøyde prøve ble analysert på en WatersR MALDI mikro MX ™ massespektrometer. Den MALDI-TOF MS spektra avslørte eksistensen av fem topper med m /z-verdier for 1452, 1466 og 1480, 1492 og 1506.
Identifisering og karakterisering av renset immunogener
rlipo-E7m og rE7m ble fordøyd med trypsin for å vurdere deres peptid mass fingerprinting (PMF). Resultatene bekreftet at de store toppene i massespektra ble avledet fra rlipo-E7m og rE7m (data ikke vist). Å identifisere lipid delen av rlipo-E7m ble direkte sample infusjon ESI-MS av intakt rlipo-E7m utført på en Q-TOF instrument. Etter bearbeiding av data, fem store topper med masser av 15384,5, 15400, 15412,5, 15426 og 15439 Da ble identifisert (Figur 1c). Basert på våre tidligere studier, vurderte vi eksistensen av disse store topper som underskrift av lipid modifikasjoner av lipoproteiner [4], [7].
Vi målte den nøyaktige massen av N-terminale fragmenter av rlipo -E7m. Fem topper med m /z-verdier for 1452, 1466, 1480, 1492, og 1506 ble identifisert (figur 1d). Rensing av de typtic lipo-fragmenter for masse-analyse viste to nye topper som ikke tidligere har blitt identifisert. For å verifisere at lipid modifikasjon av hver topp er i den N-terminale rest cysteinyl, ble N-terminale fragmenter av rlipo-E7m kastet MALDI-TOF-TOF-analyse for å bestemme sekvensen av hver topp. Sekvensene til disse fem topper var de samme, og den identifiserte sekvens fra y5 til y1 var «sqeak» (data ikke vist). Vi bekreftet at toppene rlipo-E7m ble forbundet med lipidert cysteinrest og bekreftet at rlipo-E7m inneholder en bakteriell lipid enhet på sin N-terminale.
rlipo-E7m Aktiverer Bone Marrow-avledet dendrittiske cellene gjennom TLR2
for å vurdere funksjonen til rlipo-E7m, vi først undersøkte responsen lymfocyttproliferasjon til de rekombinante immunogener og å kontrollere agonister. LPS (en TLR4 agonist) og syntetisk lipopeptid palmitoyl-3-Cys-Ser- (Lys) 4 (Pam3, en TLR2 agonist) indusert spredning av splenocytter i en doseavhengig måte. rlipo-E7m ble funnet å stimulere miltceller ved konsentrasjoner på 10 nM og 100 nM [rlipo-E7m aggregeres ved 1000 nM i fosfat-bufret saltvann (PBS)]. I motsetning til dette, rE7m ikke klarte å indusere splenocytt proliferasjon. Disse resultater viser at det lipid-delen av rlipo-E7m er i stand til å aktivere immunceller (Figur 2a).
(a) Splenocytter ble isolert fra villtype-mus og sådd ut ved en tetthet på 2 x 10
5-celler /brønn i 96-brønners plater. Cellene ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av LPS (0-1000 ug /ml), Pam3 (0-1000 ug /ml), rlipo-E7m (0-100 pg /ml) eller rE7m (0-1000 ug /ml) for 48 timer. I løpet av de siste 24 timer, 1 uCi av [
3H] -thymidin tilsatt til hver brønn for å måle DNA-syntese. Dataene er vist som gjennomsnitt ± SD av triplikate prøver. (B) BM-DC fra villtype-mus ble dyrket i medium supplert med LPS (0,01 ug /ml), rE7m (10 ug /ml) eller rlipo-D1E3 (10 ug /ml) i nærvær eller fravær av polymyxin B (20 ug /ml). Etter en 24-timers inkubasjon ble ekspresjon av dendrittiske celleoverflatemarkører CD40 og CD86 analysert ved hjelp av strømningscytometri. Forsøk ble utført in triplo, og den midlere fluorescensintensitet (MFI) for celler dyrket i medium alene, ble definert som 100%. (C) For de cytokin sekresjon studiene, BM-DC ble dyrket i medium supplert med LPS (0,01 ug /ml), Pam3 (0,15 ug /ml), rE7m (0,1-10 ug /ml) eller rlipo-E7m (0.1- 10 ug /ml) i nærvær eller fravær av polymyksin B (20 pg /ml). Etter en 24-timers inkubering ble supernatantene høstet og analysert for TNF-α og IL-12 (p40) produksjon ved hjelp av ELISA. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. (D) BM-DC fra vill-type, TLR1-knockout (TLR1-KO), TLR2-KO eller TLR6-KO mus ble dyrket enten i medium alene eller i medium supplert med LPS (0,01 ug /ml), Pam3 (0,15 ug /ml), rE7m (10 ug /ml), eller rlipo-E7m (10 ug /ml). Etter en 24-timers inkubering ble supernatantene høstet og analysert for TNF-α produksjon ved hjelp av ELISA. Dataene er representert som gjennomsnitt ± SD av triplikate prøver.
Vi brukte BM-DC som en modell for å studere immun-stimulerende egenskaper rlipo-E7m. Polymyxin B ble tilsatt for å overvåke eventuelle forstyrrelser som skyldes rest LPS i funksjonell analyse. rlipo-E7m oppregulert ekspresjonen av de overflatemarkører slik som CD40 og CD86 på BM-DC, mens rE7m ikke hadde noen effekt (figur 2b). Lignende resultater ble oppnådd i cytokinsekresjon studier. Sekresjon av TNF-αand IL-12p40 ble indusert ved rlipo-E7m men ikke ved rE7m gruppe (figur 2c). Polymyxin B hemmet LPS-mediert stimulering av BM-DC, men det hadde ingen signifikant effekt på stimulerende egenskaper rlipo-E7m. Disse resultater indikerer at aktivering av BM-DC med rlipo-E7m var ikke på grunn av rester av LPS, og at den immuno-stimulerende aktivitet av rlipo-E7m ble knyttet til sin lipid-del.
På grunn av at lipid struktur av rlipo -E7m er en agonist for TLR1 /TLR2 og /eller TLR2 /TLR6, den neste undersøkt hvilke av disse TLR’ene er viktig for immuno-stimulerende aktivitet av rlipo-E7m. For å løse dette spørsmålet, BM-DC fra vill skrevet, ble TLR1-, TLR2- og TLR6-knockout (KO) mus brukes. rlipo-E7m og Pam3 indusert TNF-α sekresjon i BM-DC fra TLR1-KO og TLR6-KO mus, men mislyktes i å stimulere BM-DC fra TLR2-KO mus, noe som indikerer at TLR2 er nødvendig for immuno-stimulerende aktivitet av rlipo- E7m (figur 2d). Disse data viser at immunogen smeltet sammen med bakteriell lipid delen aktivert modningen av BM-DC gjennom TLR2.
Immunisering med rlipo-E7m Forbedrer Antigen-spesifikke antistoffer og Genererer en Th1-partisk Response
for å evaluere de iboende egenskaper av adjuvansforbindelsene rlipo-E7m
i
vivo
, analyserte vi størrelsen av den antigen-spesifikke antistoffrespons i mus immunisert med enten rE7m eller rlipo-E7m (figur 3a) . De antistofftiter fremkalt av rlipo-E7m var 100 ganger høyere enn de som er utløst av rE7m i uke 4, 6 og 8. Deretter å analysere antistoffisotypene fremkalt ved immunisering med rE7m eller rlipo-E7m, de induserte nivåer av IgG1 og IgG2b ble målt. De IgG1 nivåene var sammenlignbare i både rE7m- og rlipo-E7m-immuniserte mus; imidlertid IgG2b-nivåer i de rlipo-E7m-immunzed mus som var høyere enn de i rE7m-immuniserte mus (figur 3b). Dette fenomenet kan observeres tydelig ved å sammenligne IgG2b /IgG1-forhold i disse musene (figur 3b, innsats).
(a) C57BL /6 mus (n = 5) ble immunisert to ganger med subkutan injeksjon av 30 ug av rE7m i PBS eller med 30 ug rlipo-E7m i PBS ved to ukers mellomrom. Sera ble samlet opp, og IgG eller (b) IgG2b /IgG1 responser mot rE7m ble evaluert ved hjelp av ELISA. De IgG2b /IgG1 forhold i begge gruppene er vist i innsatsen. (C) Mus ble injisert subkutant med 30 ug rE7m eller rlipoE7m to ganger med to ukers intervaller. Syv dager etter den andre immunisering ble miltceller isolert og stimulert med rE7m (10 ug /ml) i 4-5 dager. Supernatantene ble samlet, og nivåene av IFN-γor IL-5 ble målt ved hjelp av ELISA. Data er uttrykt som middel + standardavvik for prøver (n = 5).
Videre undersøkte vi sekresjon av INF-γ og IL-5 i splenocytter fra mus immunisert med rE7m eller rlipo-E7m. Nivået av INF-γinduced på rlipo-E7m immunisering var fire ganger høyere enn det indusert ved rE7m immunisering (figur 3c); imidlertid rE7m immunisering induserte en syv ganger høyere sekresjon av IL-5 ved splenocytes enn gjorde den rlipo-E7m immunisering (figur 3c). Sammen resultatene av T-celle og B-celleanalyser antyder at den festes et immunogen til en bakteriell lipid moiety resulterer i en Th1-baserte immunrespons indusert av lipidert immunogen.
Immunisering med rlipo-E7m induserer E7- spesifikke T-celle responser
Vi deretter undersøkt om rlipo-E7m immunisering var i stand til å indusere E7-spesifikke CTL-responser. C57BL /6 mus ble immunisert subkutant på dag 0 og 7 med rlipo-E7m, rE7m eller en PBS kontroll. Splenocyttene fra de immuniserte mus ble stimulert med peptid RAHYNIVTF (RAH, E7
49-57) og antallet E7-spesifikke IFN-y-sekreterende celler ble bestemt ved hjelp av ELISPOT-analyse (se Materialer og Metoder). Immunisering med rlipo-E7m indusert et høyere antall INF-γsecreting celler enn det gjorde immunisering med rE7m (figur 4a). I tillegg farging med en RAH /H-2D
b R-Phycoerythrin (PE) -konjugert tetramer viste en dramatisk økning i E7-spesifikke CD8 + T-celler etter immunisering med rlipo-E7m. Antallet E7-spesifikke CD8 + T-celler indusert ved rlipo-E7m immunisering var mer enn 4 ganger den indusert av rE7m immunisering (figur 4b). For å teste T-celle drap aktivitet etter rlipo-E7m eller rE7m immunisering ble rah peptid-pulset T2 celler brukt som målceller i en standard 4-timers krom utgivelsen analysen. rlipo-E7m immunisering induserte et høyt nivå av E7-spesifikk CTL-aktivitet. I motsetning til dette, rE7m immunisering bare induseres et lavt nivå av E7-spesifikk CTL-aktivitet (figur 4c). Disse resultatene viser klart at HPV E7-spesifikke CTL-responser ble indusert ved rlipo-E7m vaksinering.
(a) Splenocytter (2 x 10
5-celler /brønn) fra immuniserte mus ble inkubert med eller uten 10 ug /ml RAHYNIVTF (RAH) peptidet i 48 timer i en anti-IFN-γ-belagte 96-brønns plate ELISPOT. De IFN-γ-utskillende flekker ble målt ved anvendelse av en ELISPOT-leser. Data er uttrykt som middel + SD av seks dyr pr gruppe. (B) RAH-spesifikke CD8 + T-celler ble påvist ved farging tetramer og analysert ved strømningscytometri. Prosentandelen av tetramer-positive celler blant CD8 + T-cellene er angitt i hvert panel. Tallene for TetraRAH-tetramer + /CD8 + celler i total CD8-celler (1 x 10
5) fra tre eksperimenter ble viste. Søylediagram som viser gjennomsnittlig prosent av RAH tetramer + /CD8 + celler blant CD8 + celler. Data er uttrykt som gjennomsnitt + SD. * P 0,05. (C) For å vurdere den cytotoksiske effekt av rlipo-E7m immunisering på tumorceller, ble en standard-kromfrigjøringsanalyse utført. Isolerte splenocytter (effektorceller) ble stimulert med RAH (10 ug /ml) i 7 dager i nærvær av rIL-2 (10 enheter /ml). Målcellene (5 x 10
3 /brønn) ble inkubert med forskjellig forhold av effektorceller (01:25, 01:50, 1:100). Spesifikk lysis (%) ble beregnet som følger:. 100 x (Sample releasecpm – Spontan releasecpm) /(Maximum releasecpm – Spontan releasecpm)
Evaluering av Behandling og forebyggende effekt av rlipo-E7m
i den profylaktiske modellen ble mus immunisert to ganger med PBS, rE7m eller rlipo-E7m ved to ukers intervaller, og TC-1-celler ble subkutant injisert ved 7 dager etter siste immunisering. På dag 58 etter utfordring, svulstene forble knapt målbar i rlipo-E7m-immunisert mus. I motsetning til dette var den gjennomsnittlige tumorvolumet i mus injisert med PBS var større enn 2,5 cm
3, og det gjennomsnittlige tumorvolum var 0,59 ± 0,62 cm
3 i mus vaksinert med rE7m (figur 5a). For å vurdere den terapeutiske modellen, ble C57BL /6 mus subkutant injisert med TC-1 celler på ryggen. Syv dager senere, disse musene fikk 30 mikrogram av enten rlipo-E7m eller rE7m eller mottatt bare PBS via subkutan injeksjon av magen. På dag 58 etter smitte, svulstene var knapt påvisbare hos mus som fikk rlipo-E7m. I motsetning til dette var den gjennomsnittlige tumorvolumet i mus injisert med PBS var over 3 cm
3, og den gjennomsnittlige tumorvolum hos mus immunisert med rE7m var større enn 2,0 cm
3 (figur 5b). Disse resultater viser at både profylaktiske og terapeutiske efficacies av rekombinante immunogener er dramatisk økt når de leveres i en lipidert form.
(a) Mus ble immunisert to ganger med subkutan injeksjon av rE7m /rlipo-E7m (10 ug ) eller PBS ved en ukers mellomrom. Syv dager etter den endelige immunisering ble musene injisert subkutant med 2 x 10
5 TC-1-celler i et totalvolum på 200 ul subkutant. (B) Mus ble subkutant inokulert med TC-1 celler (2 × 10
5 /mus). Etter 7 dager ble tumorbærende mus (5-10 mus per gruppe) injisert en gang med rE7m /rlipo /rE7m (30 ug /mus) eller PBS. Svulsten volumet ble vist som lengde x bredde x bredde /2 (mm
3). Data er uttrykt som gjennomsnitt + SEM. (C) Tre grupper (rlipo-E7m /CD4, rlipo-E7m /CD8 og rlipo-E7m /rotte-IgG) av mus ble injisert med anti-CD4, anti-CD8 og kontrollantistoffer, henholdsvis, en dag før injeksjonen av TC -1 celler. Disse grupper og to ytterligere grupper (rlipo-E7m og PBS) ble injisert en gang med rlipo-E7m (10 ug /mus) eller PBS syv dager etter inokulert med TC-1-celler (2 x 10
5 /mus). Svulsten volumet ble vist som lengde x bredde x bredde /2 (mm
3). Data er uttrykt som middel + SEM.
Fem grupper av C57BL /6 mus ble benyttet for ytterligere å identifisere hvilken undergruppe av T-celler bidrar til anti-tumorimmunitet. Tre grupper ble injisert med anti-CD4 (rlipo-E7m /CD4), anti-CD8 (rlipo-E7m /CD8) og kontrollantistoffer (rlipo-E7m /rotte IgG) en dag før injeksjonen av TC-1-celler. Syv dager senere, disse musene fikk 10 mikrogram av rlipo-E7m. Behandlinger av PBS og 10 ug rlipo-E7m ble tjente som negative og positive kontroller, henholdsvis. På dag 30 etter tumorinokulasjon, gjennomsnittlig tumorvolumet av PBS og rlipo-E7m gruppene var 1,1 cm
3 og 0,14 cm
3, henholdsvis. Ingen signifikante forskjeller mellom grupper av rlipo-E7m, rlipo-E7m /CD4 og rlipo-E7m /Rat IgG. Tvert imot ble det beskyttende virkning oppheves når CD8 + celler ble tømt i rlipo-E7m /CD8 (p 0,005, figur 5c). Dette resultatet tydeligvis viste at administrasjon av rlipo-E7m kan generere CD8 + celler mediert anti-tumor effekt.
Diskusjoner
Vi har produsert en lipidert immunogen, rlipo-E7m, som består av inaktivert E7 protein av HPV16 biologisk kondensert til en bakteriell lipid-del. Våre resultater viser at rlipo-E7m alene induserer Th1 immunresponser, E7-spesifikke CTL-responser, og tumor-beskyttende immunitet i en mus tumor modell.
Den utfordringen med å utvikle proteinbasert immunterapi mot svulster er at proteinbaserte immunogener seg selv har lav immunogenitet og ikke lett fremkaller CTL-responser. Formulere immunogenet med adjuvans er den vanligste tilnærmingen til å utvikle effektive vaksiner og overvinne begrensning av protein-baserte immunterapi. Vi har utvidet denne ideen ved kovalent knytte en immunogen til en immunopotentiator, skaper en lipoprotein-basert vaksine med egenverdi adjuvant aktivitet.
Tidlige studier viste kraftig adjuvant aktivitet av bakteriell lipoprotein, syntetiske lipider til peptid antigener og lipid -endepåfestet glyko-peptider [10], [11], [12]. For eksempel kan den rekombinante lipidert ospA indusere beskyttende immunitet korrelert med utviklingen av antistoffer. Dette Lyme sykdom vaksine (LYMErixTM) ble lisensiert av US FDA i 1998 [13], [14]. En annen rekombinant lipoprotein tilnærming er basert på den ytre membran lipoprotein I (OprI) fra Pseudomonas aeruginosa. OprI-baserte vaksineformulering ved bruk av klassisk svinefeber (CSF) E2 og fremmet NS3 DC-aktivering i piggen, noe som resulterer i forbedrede T-celleresponser sammen med humorale immunforsvar [15]. Den OprI har også blitt koblet med en tuberkulose vaksine kandidat, mycolyl-transferase antigen 85A (Ag85A). Subkutan øker med dette fusjonsprotein i fravær av adjuvant økt betydelig de Ag85A-spesifikke humorale immunresponser [16]. Malp-2 (makrofag-aktiverende lipopeptid-2) har vist seg å stimulere anti-tumoral aktivitet i noen modeller [17], [18]. Oldford og medarbeidere viste at Pam3CSK4 hemmet tumorvekst i en mastcelle og mastcelle-avledet IL-6-avhengig måte [19]. Senere en tre-komponent-GLP vaksine ved Ingale og medarbeidere (en tre palmitinsyre Pam3CSK4 del, en CD4 + og et B-celle-epitop) viste induksjon av kraftige tumor-spesifikke IgG-responser [20]. Nylig, Renaudet og medarbeidere viste et fire-komponent HER-GLP-vaksine-konstruksjon (en CD4 + T-celle epitop, en OVA CD8 + T-celle epitop, en karbohydrat B-celle-epitop og et innebygd palmitinsyre adjuvans) inhiberte tumorveksten i sin-GLP immuniserte mus [21].
Adjuvant bruk av lipopeptides utløser både Th1 og Th2-cytokiner, avhengig av modell antigen som brukes i vaksinasjoner. For eksempel, var helt syntetiske lipopeptides inkludert palmitoyl-lipidert peptid og kolesterol-lipidert peptid funnet som kan utløse en Th1 avhengig beskyttende immunitet [22]. I motsetning til dette diacylert lipopeptid FSL-1 induserer TLR2-mediert Th2-responser [23]. Imidlertid kan immunresponser bli fordreid av lipoproteiner og lipopeptides mot Th1 responser ble likevel observert mange ganger. En syntetisk pam3 lipopeptid av OspA induserer Th1 fenotype utvikling i αβ T-celle-reseptor-transgene mus [5]. Bettahi og medarbeidere fant at lipopeptid fremkalte en polarisert Th1 immunrespons [24]. Imanishi og medarbeidere viste at Pam3-CysSK4 og Malp-2 som en spesifikk aktivator av Th1 cellefunksjon og innebære involvering i Th1-medierte reaksjoner [25].
Vi har vist at en lipo-immunogen kunne lykkes forbedre genereringen av nøytraliserende antistoffer mot denguevirus [4], [7]. Her har vi brukt rlipo-E7m å vise at lipoprotein immunogener kan indusere tumor-spesifikke CTL-responser. Viktigere, denne avanserte tilnærmingen gir en rasjonell design for kreftimmunterapi for fremtiden. Vi tror at dette lipo-immunogen-tilnærming kan utvikles til en ny lav pris og effektiv behandling for HPV-assosiert kreft. Videre lipid strukturen i seg selv er en TLR2 agonist [26] og kan gå gjennom den etterfølgende og refolding prosess under fremstillingen uten å påvirke dens funksjon. Denne fordelen kan rekombinante lipo-immunogener å beholde mer fleksibilitet og gjør det mulig for den robuste produksjon av lipidert immunogener. Selv om godkjenning av lipidert OspA ble avhørt om artrittogene reaksjoner forårsaket av molekylære mimikk av OspA ble ingen sikkerhetsspørsmål reist angå lipid delen av rekombinante lipo-immunogener [27]. I vår plattform-teknologi, har vi optimalisert oppstrøms og nedstrøms prosesser for produksjon av rekombinant lipoprotein, rAg473 av
Neisseria meningitidis
gruppe B, og har preget rAg473 hjelp av optimaliserte prosesser [28]. De prekliniske toksikologiske studier og dyrestudier av rAg473 er gjennomført og vi har allerede gitt sikkerhetsdata til Taiwan Food and Drug Administration for Investigational New Drug (IND) søknad.
For å indusere CTL-responser, protein- baserte immunogener normalt må formuleres med adjuvans (review [3] [29]). For eksempel har den saponin-baserte adjuvant ISCOMATRIX [30] og liposom-polykationiske-DNA (LPD) adjuvant [31] vist seg å forbedre CTL responser av HPV protein-baserte vaksiner. HPV-16-E7 har blitt sammensmeltet til et fragment av
Haemophilus influenzae
protein D formuleres i en adjuvant system som inneholder monofosforyllipid A og QS-21 saponin adjuvant [32]. Nylig Nventa Biopreparater (kjøpt av Akela Pharma) rapporterte at effekten av HSPE7 ble ytterligere forsterket av adjuvant Po1y-ICLC, og dette funnet tjente som grunnlag for fase 1 clinica1 forsøk [3]. Selv om de siste fremskritt i adjuvant feltet har gitt flere potente og nyttige adjuvant kandidater, utvikle effektive og trygge hjelpemidler for mennesker er fortsatt en utfordring [33]. Vår tilnærming unngår hinder for å bruke adjuvans, noe som tyder på at det kan gi en ny metode for å arbeide for utvikling av terapeutiske vaksiner.
I konklusjonen, vi har vist at biologisk fusing en svulst antigen med en bakteriell lipid enhet gjengitt dette antigen i stand til å stimulere BM-DC via TLR2, å indusere en immunrespons Th1, indusering av antigen-spesifikke CTL-responser, og generering av tumor-beskyttende immunitet i en musetumormodell. rlipo-E7m kan således være et lovende terapeutisk vaksine kandidat mot HPV-assosiert svulster. Videre
E. coli
har vært brukt som et stabilt produksjonssystem for biologiske, og dette lipidering teknologien kan lett anvendes på andre tumorantigener assosierer med få begrensninger. Denne strategien kan gi en metode for utvikling av vellykkede immunterapi ved bruk av proteinbaserte kandidater og vil forhåpentligvis gi sikkerhet og effektive vaksiner til mennesker.
Materialer og Metoder
Kjemi
Alle kjemikalier ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, MO) og Merck (Darmstadt, Tyskland). Restriksjonsenzymer og ligase ble anskaffet fra New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA). Primere som brukes for kloning ble kjøpt fra Mission Biotech, Inc. (Taipei, Taiwan). Trypsin og matrisen som brukes for massespektrometri-analyse ble innkjøpt fra Promega Co. (Madison, WI).
Cellelinjer og mellom
TC-1, en mus epitel cellelinje transformert med onkogenene Ras, HPV16 E6 og E7, var en slags gave fra Dr. TC Wu (Johns Hopkins University). TC-1-celler ble dyrket i DMEM (GIBCO-BRL, Grand Island, NY) supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (HyClone, Logan, Utah), penicillin (100 enheter /ml) og streptomycin (100 ug /ml ). Komplett RPMI-10 medium inneholdt RPMI-1640 supplert med 10% (volum /volum) varme-inaktivert føtalt kalveserum, 25 mM HEPES, 4 mM L-glutamin, 100 enheter /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycinsulfat og 50 pM . β-mercaptoethanol
Begrunnelse for design av Inaktiv HPV E7 (E7m)
HPV E7 inneholder oncoprotein tre konserverte regioner: domener CR1, CR2, og CR3 [34].
