Abstract
Bakgrunn
Chemo-resistens mot cisplatin-sentrert kreftbehandling er et stort hinder for effektiv behandling av menneskelig eggstokkreft. Tidligere rapporter tydet på at Arsenikk (ATO) induserer celle apoptose i både narkotika-sensitive og -resistente eggstokkreft celler.
hovedfunnene
I denne studien fant vi ut den molekylære mekanismen for ATO- indusert apoptose i eggstokkreft celler. Våre data viser at ATO-indusert celle apoptose ved å redusere nivået av fosforylert AKT (p-AKT) og aktivering av kaspase-3 og kaspase-9. Viktigere, spilte BIM en avgjørende rolle i ATO-indusert apoptose. Inhiberingen av BIM-ekspresjon forhindres AKT defosforylering og hemmet caspase-3-aktivering i løpet av celle apoptose. Men overraskende, genet Slå av AKT eller FOXO3A hadde liten effekt på BIM uttrykk og fosforylering. Videre aktiveringen av caspase-3 av ATO behandling forbedret AKT defosforylering, ikke bare ved å spalte den regulatoriske A-underenhet av proteinfosfatase 2A (PP2A), men også ved å øke dens aktivering. Videre våre data tydet på at c-Jun N-terminale kinaser (JNK) veien er involvert i reguleringen av BIM uttrykk.
Konklusjoner
Vi demonstrerte rollene til BIM i ATO-indusert apoptose og de molekylære mekanismer for BIM ekspresjonen regulert av ATO i løpet av ovarial cancer celle apoptose. Våre funn tyder på at BIM spiller en viktig rolle i regulering av p-AKT ved aktivering av kaspase-3 og at BIM medierer nivået av AKT-fosforylering for å bestemme terskelen for å overvinne motstand i cisplatin eggstokkreft celler
Citation:. Yuan Z, Wang F, Zhao Z, Zhao X, Qiu J, Nie C, et al. (2011) BIM-mediert AKT Fosforylering er en viktig modulator Arsenikk apoptose i Cisplatin-Sensitive og motstandsdyktig eggstokkreft celler. PLoS ONE 6 (5): e20586. doi: 10,1371 /journal.pone.0020586
Redaktør: Pierre Bobe, Institut Jacques Monod, Frankrike
mottatt: 20 oktober 2010; Godkjent: 06.05.2011; Publisert: 31 mai 2011
Copyright: © 2011 Yuan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet støttes av Science Foundation Natural of China (NSFC) -81071817 /H1609, (NSFC) -30800581 og (NSFC) -30900744. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er den vanligste årsaken til kreftdødsfall fra gynekologiske svulster [1]. Cisplatin og dets analoger er de viktigste forbindelsene med kjemoterapi for menneske eggstokkreft, men cellegift-motstand er et stort hinder hindrer vellykket behandling av eggstokkreft pasienter [2], [3]. Det ville således være et gjennombrudd i fortsatt prekliniske studier for å finne en ny og lave toksisitet, men effektivt medikament for å overvinne motstanden cisplatin.
ATO, som har vist seg å være et effektivt kjemoterapeutisk medikament for behandlingen av residiverende /refraktær akutt promyelocytic leukemi (APL) i 1990 [4], har blitt godkjent av FDA (Federal Drug Administration) for behandling av all-trans retinsyre (ATRA) motstandsdyktig APL [5]. Den bemerkelsesverdige effektivitet av ATO ved behandling av APL har ført til utforskning av sin anticancer aktivitet og den underliggende mekanisme i andre kreftformer. Det har vært lovende studier som indikerer at ATO ikke bare i besittelse av iboende mono tumorici-dal aktivitet mot ovarie-kreft-cellelinjer, men også kan utløse apoptose i cisplatin-resistente celler [6] – [10]. Imidlertid er de nøyaktige molekylære mekanismer som ATO overvinner cellegift-motstand og induserer apoptose i eggstokkreft celler dårlig forstått.
Nyere bevis tyder på at svikt i medikamentindusert apoptose kan være en underliggende årsak til resistens. Noen studier har identifisert en rekke sentrale formidlere av apoptose som er endret i chemo-resistent eggstokkreft celler [10] – [13]. Nivåene av uttrykk og aktivering av BCL-2 familien proteiner ofte spiller viktige roller i å kontrollere apoptotiske respons på medikamentell behandling, og dermed moduler chemo-følsomhet av tumorceller [14] – [16]. Overekspresjon av BCL-2 og BCL-XL-gener bidrar til apoptotisk inhibering og utviklingen av multilegemiddelresistens av human eggstokk-kreft. P53-proteinet er også en viktig regulator av chemo-følsomhet i eggstokkreft celler og er raskt oppreguleres som respons på DNA-skadende midler, så som cisplatin. Videre induserer apoptose p53 og regulerer frigivelsen av cytokrom
c
, ikke bare ved å modulere transkripsjonen av BH3-only-protein (for eksempel, Puma og NOXA), men også gjennom en transkripsjons-uavhengig mekanisme involverer den direkte translokasjon av p53 protein til mitokondriene fulgt av hemmende interaksjoner med BCL-2 og BCL-XL [13], [17], [18].
BIM er også medlem av BH3-only familie av pro-apoptotiske proteiner og uttrykkes i en lang rekke vev [19], [20]. Som bestemmes av western blot analyse, de fleste vev uttrykker en dominerende isoform av BIM, kalt BIM-EL [21]. Etter en apoptotisk-stress arrangement, BIM translocates til mitokondriene og initierer den mitokondrielle celledød reaksjonsvei, enten ved direkte aktivering av BAX-lignende proteiner, eller indirekte bindings pro-overlevelses BCL-2-familiemedlemmer, for derved å frigjøre BAX-lignende proteiner [22], [23]. Den BAX-proteinet er blitt vist å modulere apoptose i eggstokkreft celler [2], [13]. Men effekten av BIM på cisplatin-sensitive og -resistente eggstokkreft celler har ikke blitt grundig belyst.
Nye rapporter har indikert at AKT er en viktig faktor for cisplatin følsomhet i eggstokkreft celler. AKT fremmer celleoverlevelse, undertrykker apoptose, og regulerer cisplatin følsomhet i eggstokkreft celler [10] – [13]. Dessuten, AKT, også kjent som proteinkinase B eller Rac [11], er en inaktiv cytosolisk protein. AKT er rekruttert til plasmamembranen og aktivert ved fosforylering på treonin- 308 og serin 473 i respons til vekstfaktorer eller cytokiner [2], [10], [11], [24]. Molekylet er ansvarlig for rekruttering av AKT til den cellulære membran, så vel som dens aktivering, er den fosfatidylinositol 3-kinase (PI-3K) [2], [11]. Både PI-3K og AKT er ofte aktivert og /eller overuttrykt i eggstokk-kreft [2], [11], [13], [25]. Ved aktivering fosforylerer AKT flere molekyler som er involvert i reguleringen av apoptose, slik som den pro-apoptotiske proteiner BAD, BIM og caspase-9 og transkripsjonsfaktor FOXO3A. Deretter p-AKT blokkerer binding av dårlig eller BIM til BCL-XL, hemmer caspase-9 protease aktivitet, blokker FOXO3A funksjon og reduserer Fas ligand transkripsjon [19], [26] -. [28]
tidligere studier har også vist en modulerende rolle PI-3K /AKT signale på BIM uttrykk. PI-3K-inhibitor LY294002 øker BIM-ekspresjon i celler som samtidig- med en økning i celledød [19]. Det er imidlertid foreslått at en viktig nedstrøms effekt av LY294002 er å redusere mengden av AKT i sin aktive, fosforylert form [2], [19]. Koblingen mellom redusert AKT aktivitet og økt BIM uttrykk nivåer er FOXO3A, et medlem av gaffelhodefamilien transkripsjons regulatorer som kan direkte øke BIM uttrykk nivåer og induserer apoptose i kreftceller når overexpressed [19], [29], [30]. Således kan oppregulering av BIM uttrykk, som reguleres av LY294002, er forbundet med et tap av AKT-aktivitet og fosforylering og en økning i den aktive formen av FOXO3A.
Selv om AKT-BIM veien er viktig i chemo -sensitivity og apoptose av kreftceller, enten AKT regulerer BIM aktivitet i eggstokkreft celler under ATO behandling er fortsatt uklart. I vår rapport, viste vi at uttrykket nivået av BIM ble økt og at fosforylering av AKT ble redusert i løpet av apoptose av cisplatin-sensitive og -resistente celler etter ATO behandling. Videre nedregulering av AKT av siRNA kunne ikke hemme BIM uttrykk og fosforylering indusert av ATO, mens knockdown av BIM forhindret AKT defosforylering i eggstokkreft celler. Videre er resultatene viste at ATO-indusert AKT defosforylering er avhengig av caspase-3-mediert PP2A aktivering, som reguleres av BIM uttrykk. Disse resultatene tyder på at fosforylering av AKT er negativt modulert av BIM, og at BIM-mediert AKT-fosforylering er en stor molekylær hendelse i mediering ATO-indusert apoptose i chemo-sensitive og -resistente eggstokkreft celler.
Resultater
ATO induserer apoptose i cisplatin-sensitive og -resistente eggstokkreft celler
Vi først bestemmes den veksthemmende effekten av cisplatin i ulike cisplatin-sensitive (COC1 og A2780) og motstandsdyktig (COC1 /CP, A2780 /CP og OVCAR-3) humane ovarie cellelinjer, som tidligere beskrevet [31]. Cellelevedyktigheten ble detektert ved MTT-analyse etter 72 timers behandling. Som vist i figur 1A, forårsaket cisplatin en doseavhengig reduksjon av cellelevedyktighet i COC1 og A2780-celler, mens COC1 /CP, A2780 /CP og OVCAR-3-celler påviselig oppviste motstand mot cisplatin. For å undersøke cisplatin-indusert apoptose, ble cellene behandlet med 5 uM cisplatin. Deretter apoptose ble bekreftet ved DNA-fragmentering en ELISA-analyse ved forskjellige tidspunkter. Disse resultatene viste at cisplatin effektivt indusert apoptose i cisplatin-sensitive ovarie-celler, men ikke på cisplatin-resistente celler (figur 1B). For å undersøke effektene av ATO-systemet på apoptose i alle eggstokkreft celler, behandlet vi eggstokkreft celler med ATO og analysert celle apoptose prosessen ved en DNA-fragmentering ELISA-analyse. Våre data antydet at ATO indusert celle apoptose i alle eggstokkreft celler, uavhengig av deres forskjeller i chemo-følsomhet (figur 1C). Flow-cytometri-analyse med Annexin V-farging videre vist at det ikke var noen forskjell i ATO-indusert apoptose mellom cisplatin-sensitive og -resistente celler (figur 1D).
A. Doseavhengig effekt av cisplatin i eggstokkene cellelinjer. Celler ble utsatt for cisplatin ved de angitte konsentrasjoner i DMEM eller RPMI-1640 med 10% FBS i 96 brønners plate i 72 timer og cellelevedyktigheten ble bedømt ved MTT-analyse. Grafer som viser resultatene av MTT-analysen. Alle data er vist grafisk som gjennomsnitt ± standardfeil av anordningen i minst tre uavhengige eksperimenter. B. Analyse av celle-apoptose. Celler ble behandlet med cisplatin (5 uM) for forskjellige tidsperioder. Celle apoptose ble kvantitativt detektert ved en celledød ELISA kit. Grafer som viser resultatene av kvantitative analyser. Alle data er vist grafisk som gjennomsnitt ± standardfeil av anordningen i minst tre uavhengige eksperimenter. *,
P
0,05, **,
P
0,01. C. Effekt av ATO på apoptotisk død i cisplatin-sensitive og -resistente celler. Celler ble dyrket i nærvær eller fravær av ATO (2 uM) for forskjellige tidsperioder, og deretter celle apoptose ble målt som beskrevet i materialer og metoder. Alle data er vist grafisk som gjennomsnitt ± standardfeil av anordningen i minst tre uavhengige eksperimenter. *,
P
0,05, **,
P
0,01. D. Påvisning av celle apoptose med flowcytometri analyse. COC1 COC1 og /CP-celler ble behandlet med ATO (2 uM) i 48 timer, deretter farget med Annexin V og undersøkt ved strømningscytometri. E og F. Analyser av cyt
c
utgivelse. Etter behandling med ATO for forskjellige tidsperioder, ble cellene underkastet subcellulære fraksjonering. Cytosoliske eller mitokondrielle fraksjoner ble immunblottet (30 mikrogram av protein /kjørefelt) med antistoff spesifikt for cyt
c
. β-aktin og Cox IV ble anvendt som proteinlastekontroll. Densitometrisk analyse av Western blots ble utført og mengden av cyt
c
ble sammenlignet med proteinet lasting kontroll. For CYTO cyt
c
, relative mengden av cyt
c
fra behandlede celler (72 h) ble satt til 1, mens relative mengden av ubehandlede celler (0 h) ble satt til 1 for mito cyt
c
. Dataene er representative for minst tre uavhengige eksperimenter.
For å avgjøre om mitokondriene spiller en viktig rolle i ATO-indusert celle apoptose, frigjøring av cytokrom
c
ble oppdaget av cellefraksjone analyse. Resultatene viste at ATO indusert frigjøring av cytokrom
c
i en tidsavhengig måte i chemo-sensitive og -resistente celler (figur 1E, F), noe som tyder på at ATO initierer apoptotisk celledød gjennom mitokondriell dysfunksjon.
BIM er viktig for ATO-indusert apoptose i chemo-sensitive og -resistente eggstokkreft kreftceller
Mitokondriell dysfunksjon spiller en viktig rolle i apoptose i eggstokkene celler. Tidligere studier har rapportert at endringer i genekspresjon av BCL-2-familieproteiner var involvert i ATO-indusert apoptose [32], og at BH3-eneste proteiner som var nødvendige for ATO-indusert apoptose i myelomaceller. Det er imidlertid uklart om BH3 proteiner kan fungere i eggstokkreft celler følgende ATO behandling. Derfor, undersøkte vi ekspresjonen av BCL-2-familieproteiner på cisplatin-sensitive og -resistente celler etter behandling ATO. Som vist i figur 2A, pro-apoptotiske proteiner, slik som BAX, Puma og NOXA, ikke ble vesentlig endret i COC1 celler ved forskjellige tidspunkter etter ATO behandling. Anti-apoptotiske BCL-2 og BCL-XL proteiner også utstilt ingen store endringer. Men i motsetning til andre proteiner, ekspresjonsnivået av BIM ble markert øket etter ATO behandling, gir bevis for at BIM var involvert i celledød ved apoptose i eggstokkreft celler. I mellomtiden, ATO indusert BIM uttrykk likt i COC1 /CP celler (figur 2B). Lignende resultater ble også observert i andre cellelinjer (data ikke vist). Disse resultatene tyder på at BIM spiller en viktig rolle i ATO-indusert apoptose i eggstokkreft celler.
A og B. Western blot analyse av ekspresjonen nivået av BCL-2 familie protein. Tidsavhengig analyse av BCL-2 medlemmets uttrykk nivåer i COC1 /CP og COC1 celler. Celler ble behandlet med ATO (2 uM) til angitt tid, deretter lysert i NP40-buffer for deteksjon. p-aktin ble benyttet som et protein lastekontroll. Individuelle proteinnivåer ble målt ved densitometrisk analyse av Western blot og i forhold til actin nivåer. Relative mengde av individuelle proteiner fra behandlede celler (72 timer) ble satt til 1. C. Effekt av BIM shRNA på celle apoptose. I de samme betingelser med A, ble cellene transfektert med BIM eller Ctrl shRNA i 48 timer, og deretter behandlet med eller uten ATO i 48 timer. Cellelysater ble fremstilt og analysert for BIM, caspase-9 og spaltet caspase-3 ved western blot. CF er henvist til spaltet caspase-9. Relativ fold betyr mengden av BIM i forhold til aktin og Ctrl tilstand ble ansett som 1. D. Detection effekten av BIM shRNA på celledød med kjernefysiske farging. Celler ble transfektert med BIM eller Ctrl shRNA i 48 timer, og deretter transfekterte celler ble behandlet med ATO i 48 timer. Celledød ble vurdert ved å måle celler med kondensert og fragmentert atom ved mikroskopi. Pilene viser kondensert, fragmenterte, farge farget atomkjerner, som er kjennemerket på apoptose. Alle data er representative for tre uavhengige eksperimenter.
For å bekrefte effekten av BIM på apoptose i eggstokkreft celler, vi utførte gen-Silencing eksperimenter med en shRNA spesifikt for BIM at målrettede alle kjente isoformer av sin transkripsjon. I likhet med det resultat er vist i figur 2A, ekspresjonsnivået av BIM var høy i kontrollvektor-transfektert COC1 og COC1 /CP-celler etter ATO behandling, mens BIM uttrykk nivåer i celler transfektert med en BIM shRNA var relativt lav (figur 2C) . Videre er nedregulering av BIM inhiberte caspase-9 og caspase-3 spalting indusert av ATO. Tilsvarende ATO indusert kjerne fragmentering og kondensasjon i kontroll-vektor transfektert A2780 og OVCAR-3-celler, men ikke i BIM shRNA-transfekterte celler (figur 2D). Disse resultatene gir ytterligere bevis på at BIM uttrykk er nødvendig for ATO-indusert apoptose i eggstokkreft celler.
AKT signalering er involvert i celledød
Nyere studier har indikert at AKT modulerer BIM aktivering enten direkte eller indirekte, [19], [33]. Videre induserer apoptose i ATO myelomaceller ved å redusere AKT-aktivitet og ekspresjon i celler [34]. Basert på ovennevnte observasjoner, spekulerer vi at AKT er trolig involvert i ATO-indusert apoptose ved å regulere BIM uttrykk. Følgelig må vi først målt om AKT er involvert i ATO-indusert apoptose i eggstokkreft celler. Som vist i figur 3A, ATO indusert den nedregulering av p-AKT ved Ser473 i cisplatin-sensitive COC1 celler i en tidsavhengig måte, selv om ekspresjonsnivået av total AKT-protein oppviste ingen endring. Nedregulering av p-AKT indusert aktivering av caspase-9 i følsomme COC1 celler. Tilsvarende ATO-induserte reduksjon av p-AKT og spaltingen av caspase-9 med andre eggstokkreft celler, på tross av deres forskjeller i kjemoterapi-følsomhet.
A. Påvisning av AKT fosforylering, uttrykk og caspase-9 aktivering. Western blot-analyse av total AKT, p-AKT (Tjen
473) nivåer og caspase-9 spalting i COC1 celler. Cellene ble behandlet med ATO (2 mm) på ulike tidspunkt og lysert i NP40 buffer for gjenkjenning. CF er henvist til spaltet caspase-9. Det samme oppdagelse ble ansatt i COC1 /CP, A2780 og OVCAR-3. Disse cellene ble behandlet i 72 timer, deretter lysert og analysert for individuelle proteinnivåer ved hjelp av Western blot. p-aktin ble benyttet som et protein lastekontroll. p-AKT og AKT-nivåer ble målt ved densitometrisk analyse av Western blot og i forhold til actin nivåer. Relative mengde av p-AKT eller AKT fra ubehandlede celler ble betraktet som 1. B. Protein nivåer av PI-3K signalveien i ATO-behandlede celler. Celler ble utsatt for medikament for forskjellige tidsperioder. Cellelysater ble utarbeidet og analysert for individuelle protein nivåer av Western blot. Individuelle proteinnivåer ble målt ved densitometrisk analyse av Western blot og i forhold til actin nivåer. Relativ mengde av enkelte proteiner fra ubehandlede celler (0 h) ble satt til 1. C. Effekter av ATO på proteinnivå mTOR2, inkludert p-mTOR (Ser
2448and
2481), mTOR, RICTOR, SIN1, i A2780 celler. Celler ble utsatt for medikament, som beskrevet i B, og deretter cellelysater ble analysert ved Western blot. Relative mengde av proteinnivåer ble satt som beskrevet i B. Cellelysater ble analysert ved western blot. Relative mengde av proteinnivåer ble satt som beskrevet i B. D. Beskyttende effekt av konstitutiv AKT på ATO-indusert apoptose i eggstokkceller. OVCAR-3 og A2780-celler ble transfektert med konstitutiv akt1 og ble valgt ut for 8 uker ved G-418 og behandlet med ATO i 72 timer. Celler ble lysert og analysert med hensyn på de enkelte proteinnivåer ved hjelp av Western blot.
Venstre,
protein nivåer av p-AKT (Ser
473) og AKT (akt1) i både Ctrl eller AKT vektor transfektert OVCAR-3 og A2780 celler ble oppdaget. Relativ mengde protein nivåer ble satt som beskrevet i B. p-AKT og AKT nivåer av akt1 transfektert A2780 celler ble ansett som 1.
Høyre, etter analyse av apoptose i Ctrl eller akt1 vektor transfektert OVCAR-3 og A2780 celler. Celle apoptose ble kvantitativt detektert ved en celledød ELISA-sett som beskrevet i Materialer og Metoder. Alle data er vist grafisk som gjennomsnitt ± standardfeil av anordningen i minst tre uavhengige eksperimenter. **
P
0,01. E. Påvisning av rollen LY294002 på apoptose av celler. Celler ble behandlet med ATO-systemet og /eller 25 uM LY294002 i 72 timer, og deretter ble cellene lysert og analysert med hensyn på de enkelte proteinnivåer ved hjelp av Western blot.
Venstre,
protein nivåer av p-AKT (Ser
473) og total AKT i COC1 celler ble oppdaget. Celle apoptose ble kvantitativt detektert ved en celledød ELISA kit. Relativ mengde protein nivåer ble satt som beskrevet i B. p-AKT og AKT nivåer fra ubehandlede celler ble satt som 1.
Høyre, etter analyse av apoptotiske celler som beskriver i Materialer og metoder. Alle data er vist grafisk som gjennomsnitt ± standardfeil av anordningen i minst tre uavhengige eksperimenter. **
P
. 0,01
Vi deretter analysert uttrykket nivåer av oppstrøms PI-3K signalproteiner som kan påvirke p-AKT nivåer i eggstokkreft celler. Som vist i figur 3B, nivåer av PI-3K pathway proteiner, inkludert P85 (regulatorisk subenhet av PI-3K), PTEN og PDK1 ble ikke endret seg vesentlig etter ATO behandling for ulike tidsperioder i COC1 /CP celler. Nyere studier antydet at mammalian target of rapamycin 2 (mTORC2) eller Rictor protein var ansvarlig for aktivering av p-AKT på Ser473 [35], [36], og uttømming av subenheter av intakt mTORC2 som SIN1, avskaffet AKT fosforylering på Ser473. Videre Ser2448 på mTOR var en AKT fosforylering området, og fosfor-Ser2481 var en markør for mTORC2 komplekser [35], [37]. Våre data viste at protein nivåer av mTOR komplekse to, inkludert fosfor-mTOR (på Ser 2481 og 2448), ble mTOR, RICTOR og SIN1 ikke endres vesentlig i A2780 celler etter eksponering for ATO på ulike tidsperioder (figur 3C). Disse resultatene tyder på at disse proteinene har ingen effekt på p-AKT nivå.
For å validere om AKT signalering er en viktig molekylære mål ansvarlig for ATO-indusert apoptose, transfektert vi en konstitutivt aktiv akt1 gen inn OVCAR-3 og A2780 celler og undersøkt deres reaksjon på ATO behandling. Som presentert i figur 3D, OVCAR-3 og A2780-celler transfektert med akt1 oppviste tydelig motstand mot ATO-indusert apoptose.
Videre har vi brukt LY294002, en PI-3K-inhibitor, for å hemme fosforyleringen av AKT ved oppstrøms signalmolekyler og undersøkte pro-apoptotisk effekt av ATO i eggstokkreft celler. Vi fant ut at ATO alene eliminert p-AKT og indusert apoptose mens LY294002 alene ikke var tilstrekkelig til å indusere apoptose, selv om det delvis redusert p-AKT. Ytterligere eksperimenter viste at kombinasjonen av LY294002 og ATO fullstendig eliminert p-AKT og forbedret induksjon av apoptose i COC1 celler (figur 3E). Våre data viser at virkningen av kombinasjonen av LY294002 og ATO på p-AKT og apoptose er mer betydningsfull enn den for LY294002 alene, og at AKT-signalveien er involvert i ATO-indusert apoptose i eggstokkreft celler.
BIM-regulert AKT-fosforylering i celle apoptose
AKT medierer BIM-aktivering via to hovedveier: (1) AKT fosforylerer BIM direkte og inhiberer BIM-aktivering [19], [33], eller (2) AKT fosforylerer FOXO3A , som fører til cytoplasma oppbevaring av 14-3-3 proteiner. Derved AKT kunne ikke translocate inn i kjernen for å indusere transkripsjon BIM, noe som betyr at AKT regulerer BIM aktivering indirekte. På bakgrunn av disse observasjonene, bestemte vi oss for å undersøke om AKT påvirker BIM aktivering i eggstokkreft celler. Vi først downregulated ekspresjon av akt1 ved siRNA i ATO-behandlede A2780 og OVCAR-3-celler og funnet at nedregulering av AKT øket caspase-3 og PARP-spaltning under ATO behandling. Imidlertid AKT nedregulering hadde liten effekt på BIM-ekspresjon, men AKT nedregulering økes til en viss grad, ATO-indusert kjerne fragmentering og fulgt celle apoptose (figur 4A). Lignende resultater ble også funnet i ATO-behandlet eggstokkreft kreftceller når FOXO3A uttrykk ble nedregulert ved hjelp sirnas målretting FOXO3A (figur 4B). Disse resultatene tyder på at AKT-reaksjonsveien ikke kan være involvert i regulering av BIM-ekspresjon i løpet av ATO-indusert apoptose.
A. Effekt av AKT siRNA på BIM uttrykk. -Celler ble transfektert med enten kontroll siRNA eller akt1 siRNA i 48 timer og deretter ble utsatt for ATO i 72 timer. Celler ble lysert og analysert med hensyn på de enkelte proteinnivåer ved hjelp av Western blot. CF kalles spaltet PARP. p-aktin ble benyttet som et protein lastekontroll.
Up,
protein nivåer av AKT, BIM, kløyvde caspase-3, og PARP ble oppdaget av Western blot. Relative mengde av enkeltproteinnivået ble satt som beskrevet i figur 3B. p-AKT og AKT nivåer av Ctrl siRNA transfekterte og behandlet A2780 celler ble ansett som 1.
Down, etter analyse av apoptotiske celler. som beskrevet i Materiale og metode. Alle data er vist grafisk som gjennomsnitt ± standardfeil av anordningen i minst tre uavhengige eksperimenter.
P
0,05 (ikke signifikant). B. Effekt av FOXO3A siRNA på BIM uttrykk og celle apoptose. -Celler ble transfektert med enten kontroll siRNA eller FOXO3A siRNA i 48 timer og deretter ble utsatt for ATO i 72 timer.
Up, etter Etter transfeksjon i 48 timer, ble Immunoblot for BIM og FOXO3A protein uttrykk utført på helcellelysater. Relative mengde av enkeltproteinnivået ble satt som beskrevet i figur 3B. FOXO3A og BIM nivåer av Ctrl siRNA transfekterte COC1 celler ble ansett som 1.
Down,
protein nivåer av BIM, cytosol cyt
c Hotell og PARP ble analysert ved Western blot i FOXO3A siRNA OVCAR-3 celler. For cyt
c
deteksjon ble cellene behandlet følgende figur 1E. Som beskrevet i figur 3B, relative mengde av BIM og cyt
c
i ATO-behandlede celler (72 h) ble betraktet som 1. C. Effekt av AKT-fosforylering på BIM. Celler ble metabolsk merket med [
32P] ortofosforsyre og behandlet med ATO (2 uM) i 48 timer, og BIM ble immunopresipitert ved hjelp av en agarose-konjugert BIM-antistoff, deretter detektering av fosforylering av BIM. Fosforylering av BIM ble bestemt ved autoradiografi (øvre panel). Western blot-analyse ble utført for å bekrefte og kvantifisere BIM protein (lavere panel).
Venstre,
effekten av LY294002 på BIM fosforylering. Celler ble behandlet med ATO-systemet og /eller LY294002 (25 pM), og deretter påvisning av BIM uttrykk og fosforylering. Som beskrevet i figur 3B, ble relative mengde av
32p-BIM og BIM i ATO-behandlede celler anses som 1.
Høyre, etter virkningen av AKT siRNA på BIM fosforylering. -Celler ble transfektert med enten kontroll siRNA eller akt1 siRNA i 48 timer og deretter ble utsatt for ATO i 48 timer. Påvisning av BIM uttrykk og fosforylering som beskrevet. Relativ mengde
32p-BIM og BIM i AKT transfektert og ATO behandlede celler ble satt som 1. D. Effekt av BIM shRNA på AKT fosforylering. -Celler ble transfektert med enten kontroll eller shRNA BIM shRNA i 48 timer og deretter ble utsatt for ATO i 48 timer. Western blot undersøkt BIM uttrykk, caspase-3 cleavage, protein nivåer av p-AKT (Tjen
473) og AKT i cellene. Relativ mengde av p-AKT, AKT og BIM i Ctrl shRNA transfektert og ATO behandlede celler ble satt som 1. Alle data er representative for tre uavhengige eksperimenter.
For å oppdage BIM fosforylering under apoptose, A2780 og COC1 /CP-cellene ble metabolsk merket med [
32P] ortofosforsyre og behandlet med ATO i 48 timer, og fosforyleringen av BIM ble analysert ved hjelp av autoradiografi. En tidligere rapport viste at BIM induksjon og fosforylering økte i apoptose [38]. Våre studier har også undersøkt BIM fosforylering og økt BIM uttrykk etter ATO behandling. Våre data videre avdekket at AKT downregulation av siRNA eller en AKT inhibitor (LY294002) ikke kan redusere BIM fosforylering i chemo-sensitive og -resistente celler etter ATO behandling (Figur 4C). Disse resultatene indikerte at AKT inaktivering hadde liten eller ingen effekt på BIM fosforylering og foreslo at AKT ikke kunne regulere BIM-aktivering, og at andre tenkelige mekanismer når det gjelder regulering av BIM-aktivering kan eksistere.
Men våre ytterligere data indikerte at knockdown av BIM hemmet AKT defosforylering og caspase-3 cleavage i chemo-sensitive og-resistent eggstokkreft celler (Figur 4D). Disse resultater antyder at ATO-indusert BIM-ekspresjon hindrer fosforyleringen av AKT, noe som viser at BIM regulerer AKT-aktivering i løpet av ATO-stimulering i eggstokkreft celler.
BIM regulerer AKT defosforylering av caspase-3 aktivitet
tidligere rapporter tydet på at AKT ble defosforylert ved både Thr308 og Ser473 og inaktiveres in vitro av proteinfosfatase 2A (PP2A), som dannet et kompleks med AKT. AKT ble aktivert i celler etter behandling med PP2A-inhibitorer, så som okadainsyre (OA) [39], [40]. Nylig ble det rapportert at caspase-3 regulerte fosforyleringen av AKT gjennom spaltning av den regulatoriske subenhet A av PP2A (PP2A /A), som økte PP2A aktivitet [39]. Våre resultater viser at BIM er involvert i reguleringen av caspase-3 og AKT-aktivering (figur 4D). Derfor foreslår vi at BIM kan regulere AKT fosforylering av caspase-3-mediert PP2A aktivering i eggstokkene celler.
For å validere vår hypotese, må vi først avgjort om PP2A mediert AKT fosforylering i vår studie. Forbehandling av cellene med OA, en inhibitor for PP2A, resulterte i en gradvis reversering av ATO-indusert AKT defosforylering på en doseavhengig måte i COC1 /CP-celler (figur 5A). På samme tid, OA også reddet AKT-fosforylering i A2780 og OVCAR-3-celler i løpet av ATO-behandling.
A. Forskjellige cellene ble pre-inkubert med angitte konsentrasjoner av OA i 1 time og eksponert for ATO i 48 timer, deretter lysert i NP40-buffer for deteksjon. Western blot-analyse av total AKT og p-AKT (Ser
473) nivåer ble vist. p-aktin ble benyttet som et protein lastekontroll. Relative mengde av p-AKT og AKT i ubehandlede celler ble definert som 1. B. Analyse av effekten av caspase-3 på PP2A aktivering.
Inntil
, Celler ble pre-inkubert med angitte konsentrasjoner av DEVD-CHO i 1 time og eksponert for ATO i 48 timer, deretter lysert i NP40-buffer for deteksjon. Western blot-analyse av total AKT og p-AKT (Ser
473) nivåer ble vist. Relative mengde av p-AKT og AKT i ubehandlede celler ble definert som 1.
USA
ble de behandlede cellene lysert med prøvebuffer og utsatt for immunoblot-analyse med en a-underenhet-spesifikt anti-PP2A /A-antistoff. CF er referert til spaltet PP2A /A. Membranen ble deretter strippet og reprobed med en C-underenhet-spesifikt anti-PP2A /C-antistoff. Relative mengde av PP2A /C i ubehandlede celler (0 h) ble satt som 1.
Down
, Western blot-analyse av effekten av DEVD-CHO (100 pM) i PP2A spalting. C. Påvisning av PP2A aktivitet. Celler ble pre-inkubert med eller uten 0,2 mM av OA eller 100 pM av DEVD-CHO i 1 time og eksponert for medikament i 48 timer.
