Abstract
selvfornyelse potensialet til en kreftcelle kan estimeres ved hjelp av særskilte analyser, som omfatter xenotransplantasjon hos immunkompromitterte dyr eller dyrking i ikke-adherente serumfrie stamcellene media (SCM). Men om celler med selvfornyelse potensial faktisk bidrar til sykdommen er ukjent. Her undersøkte vi tumorigent potensiale og skjebnen til kreftceller i en in-vivo melanom modell. Vi undersøkte cellelinjer som var avledet fra den samme foreldrelinje: en ikke-metastatisk cellelinje (K1735 /16), en metastatisk cellelinje (K1735 /M4) og en cellelinje som ble valgt i ikke-adherente betingelser (K1735 /16S ). Alle cellelinjer utstilt lignende spredning kinetikk når dyrket på kulturplater. K1735 /16 celler dyrket i myk agar eller i suspensjons ikke-adherente betingelser mislyktes i å danne kolonier eller kuler, mens de andre cellelinjene viste fremtredende colonogenicity og sfæroide formasjon kapasitet. Ved å bruke sfære begrensende fortynning analyse (SLDA) i serum-fritt medium, K1735 /16S og K1735 /M4-celler dyrket i suspensjon var i stand til å danne kulene, selv i lave frekvenser av konsentrasjoner, i motsetning til K1735 /16-celler. Den tumorigent potensiale av cellelinjer ble bestemt i SCID-mus ved bruk av intra footpad injeksjoner. Håndgripelig svulster var tydelig i alle mus. Etter avtale med
in-vitro
studier var K1735 /M4 cellelinje utstilt de høyeste vekstkinetikk, etterfulgt av K1735 /16S cellelinje, mens K1735 /16 cellelinjen hadde lavest svulst vekstpotensial (
P
0,001). I kontrast, når vi gjentok eksperimentene i syngene C3H /høne mus, produserte K1735 /16 cellelinje makroskopiske tumorer 30-100 dager etter injeksjon, mens K1735 /M4 og K1735 /16S avledet svulster tilbakedannede spontant i 90-100% av mus . TUNEL Analysen avdekket betydelig høyere antall apoptotiske celler i K1735 /16S og K1735 /M4 cellelinje-avledet svulster i forhold til K1735 /16 svulster (P 0,001). Modellene vi har undersøkt her hevet muligheten for at celler med høy tumorigent aktivitet kan være mer immunogen og dermed er mer utsatt for immunregulering
Citation. Krelin Y, Berkovich L, Amit M, Gil Z (2013) Sammenhengen mellom tumorigent potensiale og Fate av kreftceller i en syngene melanoma modell. PLoS ONE 8 (4): e62124. doi: 10,1371 /journal.pone.0062124
Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA
mottatt: 16 april 2012; Godkjent: 19 mars 2013; Publisert: 23 april 2013
Copyright: © 2013 Krelin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av Israel Science Foundation (nummer 1680-1608 og 482/11), Israel Cancer Association (tilskudd donert av Ellen og Emanuel Kronitz til minne om Dr. Leon Kronitz nummer 20090068), den israelske helsedepartementet (nummer 3-7355 ), Weizmann Institute – Sourasky Medical Center Joint Grant, Tel Aviv Sourasky utført Grant, ICRF Barbara S. Goodman utrustet forskning karriereutvikling award (2011-601-BGPC) og et tilskudd fra USA-Israel binational Science Foundation (antall 2007312) til ZG Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft er en kompleks sykdom, som omfatter forskjeller mellom tumorer eller celler i en gitt tumor, samt variasjon mellom pasienter. Innenfor spekteret av cellene i en gitt tumor, kan subpopulasjoner av celler være fenotypisk forskjellig og viser tydelig proliferativ potensial. For eksempel foreslår kreftstamcelle (CSC) modell som bare en liten subpopulasjon av celler som har en selvfornyelse og tumordannelse potensial, mens hoveddelen av tumor består av ikke-tumorigene celler [1]. Bevis som støtter CSC-modellen er funnet i kjønnscelle kreft, leukemi, brystkreft, tykktarmskreft og i noen hjernen kreft. [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]. På den annen side, om melanomer er i overensstemmelse med en slik modell er en sak av kontinuerlig debatt [12], [13].
For tiden er den eneste metode som bestemmer karsinogent potensial av humane tumorer omfatter xenotransplantasjon av forskjellig subpopulasjoner av kreftceller i flankene av sterkt immunundertrykkende dyr (f.eks NOD /SCID mus). I tillegg stemness (dvs. evnen til å fornye seg selv og skille) blir ofte evaluert
in vitro
av surrogat analyser som undersøker sfæren dannende evne og clonogenicity i Anchorage uavhengige forhold, for eksempel halvfast myk agar [ ,,,0],14]. Tidligere eksperimenter viste at flercellede kreft kulene er morfologisk og karakteristisk ligner solide svulster
in vivo product: [15], [16]. Det er også blitt vist at kula-dannende potensial i suspensjons ikke-adherente betingelser gående korrelerer med den neoplastiske vekstpotensialet i immunsvekkede mus [17], [18], [19], [20].
Både
in vitro Hotell og
in vivo
stemness analyser adressere tumorigent potensialet distinkt undergruppe av celler, mens selve dannelsen av svulster hos pasienter kan avhenge av andre faktorer. Svulsten mikromiljøet som kan være stedsspesifikke og vertens immunsystem som er svekket i NOD /SCID mus kan potensielt forandre skjebnen til kreftceller og deres bidrag til sykdommen. Derfor er spørsmålet om celler med en høy tumorigent potensiale faktisk bidrar til tumorvekst hos pasienter med intakt immunsystem forblir uløst
I denne artikkelen vi søkt å sammenligne to fenomener knyttet til kreftutvikling. Tumorigent potensiale og skjebnen til kreftceller. For å overvinne to av de viktigste begrensningene som er iboende til subkutan xenografting av menneskelige kreftceller i immunforsvar mus, dvs. arter barriere og transplantasjon innstillingen, vi brukte en syngene melanom modell og ortotopiske intra footpad injeksjoner i immun-kompetente dyr.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
Mus melanomcellelinjer (K1735 /16 og K1735 /M4) var en gave fra laboratoriet til Dr. Lea Eisenbach (Weizmann Institute, Rehovot ). Den K1735 /16S-cellelinjen ble avledet fra K1735 /16 cellelinje, ved å dyrke cellene i ikke-adherente betingelser (se nedenfor) i 16 dager. Celler ble dyrket i DMEM supplert med MSCM, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C, 5% CO2 i en fuktig inkubator. Alle mellom ingredienser ble kjøpt fra Biologiske Industries, Israel. For selvfornyelse og spheroid vekst analysene brukte vi melanom serumfrie stamcelle media (MSCM) som besto av Dulbeccos modifiserte Eagles medium /F12, KnockOut ™ SR, 100 mM L-glutamin (Invitrogen), MEM ikke-essensielle aminosyrer Løsning 10 mM, 2 ug /ml FGF (Sigma), og antibiotika. For sfære vekst analyser vi brukte MSCM kondisjonerte med mus embryonale fibroblaster (MEF) CF-en i 24 timer. [21] Også ble brukt reagenser som: natriumazid, paraformaldehyde, xylen og natriumsitrat ble kjøpt fra Sigma Aldrich, Israel
Mus og
in vivo
Foot Pad Model
.
Kvinner C3H /høne mus og alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) mus ble kjøpt fra Harlan (Jerusalem, Israel). Alle musene ble holdt på Animal lokale i Tel Aviv Medical Center (Tel-Aviv, Israel), under aseptiske forhold.
Dyrestudier ble utført i samsvar med alle gjeldende retningslinjer, prosedyrer og regelverk i Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC), Forskningsrådet Animal Resource Center (RARC) fra Tel Aviv University og National Institutes of Health (NIH) «guide for omsorg og bruk av forsøksdyr». Alle dyr prosedyrer ble utført ved inhalasjon av 2% isofluran. Etter studiene, ble alle dyr avlivet ved CO
2 inhalering.
A matte syngenisk melanom-modellen ble etablert som tidligere beskrevet av Harrell et al. [22]. Kort sagt ble tredve, 6 uker gamle musene bedøvet med isofluran inhalativ for alle prosedyrer. Den venstre baklabb matte ble sterilisert med alkohol og deretter langsomt injisert med 50 ul av cellesuspensjonen ved en konsentrasjon på 2 x 10
5 celler /50 ul i løpet av en 2-minutters periode. Musene ble deretter vekket og deres matte overvåkes for tumorstørrelse og tegn på smerte eller sårdannelse to ganger i uken.
Eksperimenter med syngene C3H /høne mus, ble gjentatt 3 ganger, og i hvert forsøk vi injisert 10- 15 mus per gruppe. I forsøkene med SCID-mus benyttet vi 6-7 mus pr gruppe. I cellen sortering forsøket ble hver gruppe (5-6 mus per gruppe) injisert med sorterte CD133 (+), kontroll K1735 /M4 eller kontroll K1735 /16 celler til syngene C3H /høne mus.
Immunohistochemistry
prøver fra injeksjonsstedet til melanomcellelinjer ble erholdt på dagene 16 og 40, fiksert i 4% paraformaldehyd, dehydrert i alkohol, klargjort i xylen og innstøpt i parafin. Fire mikron snitt ble farget med hematoxylin og eosin (H klon ab66155 Abcam Cambridge, UK), muse-anti-muse /humant Melana (01:20; klon ab731 Abcam Cambridge, UK). Vectastain Elite ABC-peroksidase kit (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) ble anvendt for sekundær antistoffpåvisning. Visualisering ble utført ved hjelp av DAB som et substrat (klon ab64238, Abcam Cambridge, UK). En patolog undersøkte lysbilder i en blind måte
Immunoblotting
For uttrykk for ABCB5 (1:1000, klone PAB9925, Abnova Taipei City, Taiwan)., Nestin (1:200; klone mab353 , Chemicon, Billerica, USA) og CD271 /NGFR (1:200; klon sc-8317, Santa Cruz, USA) celler ble dyrket i 6-brønners plater. Da cellene ble løslatt uten enzymatisk fordøyelse ved 4 ° C. Cellepelletene ble ultralydbehandlet i 10 sekunder og klaret ved sentrifugering. Totalt protein (50 ug) gjennomgikk elektroforese i 7,5% Tris-HCl geler (Bio-Rad, Hercules, CA) og ble overført til polyvinylidendifluorid-membraner, blokkerte og utsatt for primært antistoff, etterfulgt av et sekundært antistoff konjugert til pepperrotperoksidase. Bånd ble utviklet ved hjelp av en ECL Plus deteksjonssystem (Amersham, Piscataway, NJ). Tetthet ble kvantifisert ved hjelp av en datastyrt CCD-kamera (AlphaImager Imaging Systems, Alpha Innotech, San Legndra, CA).
flowcytometrisystemer og Cell Sorting
For å oppdage overflatemarkører på kreftceller, melanom cellelinjer ble trypsinert eller ikke-enzymatisk frittliggende med EDTA og sentrifugert ved 1500 o /min i 5 min. [23] Kort beskrevet, Cellene ble vasket med Ca
2 + -fri Mg
2 + -fri fosfatbufret saltløsning (PBS) oppløsning, og 4 ml 1 mM EDTA (Sigma Aldrich) ble tilsatt til hver kolbe . Kolbene ble inkubert ved 37 ° C i 5 minutter og rystes langsomt inntil cellene ble løsnet. Ti milliliter PBS-buffer ble deretter tilsatt til hver kolbe og celler plukket opp til rør, sentrifugert og vasket med Ca
2 + /Mg
2 + -fri PBS. Antallet av frigjorte celler ble tellet med et hemacytometer (Marienfeld, Tyskland). Cellene ble deretter høstet, vasket med iskald 0,5% FBS og 0,02% natriumazid i PBS og blokkert med en løsning av 0,5% FBS og 5 ug /ml renset anti-CD16 /CD32 (BioLegend, San Diego, USA) i PBS i 15 minutter ved værelsestemperatur. Deretter ble cellene farget for APC konjugert anti-mus-CD133 mAb (klon 13A4, eBioscience, San Diego, USA), APC-merket anti-mus CD117 (klone 2B8, eBioscience, San Diego, USA), FITC-merket anti- mus Sca-1α (klone D7, eBioscience, San Diego, USA), CD271 (klone ab8874, Abcam Cambridge, UK) og geitepolyklonalt sekundært antistoff i Rabbit IgG (klone ab6108, Abcam Cambridge, UK) i 30 min på is. Prøvene ble deretter vasket og analysert med BD FACSCanto ™ II (BD Bioscience, USA).
For å sortere brukte vi MACS® Separasjon system (# 130-090-312, Miltenyl Biotec Inc., USA) i henhold til produsenten protokollen. Kort fortalt: K1735 /M4 celler ble farget med APC konjugert anti-mus-CD133 mAb og celleseparasjon satte med anti-APC mikroperler (# 130-090-855, Miltenyl Biotec Inc., USA). Cellen partisjonen ble gjort to ganger med samme cellene for å berike CD133 positive cellepopulasjon. Etter celleseparasjon CD133 positiv cellepopulasjon ble vasket med PBS og klargjort for injeksjon (7,5 × 10
4 celler /200 mL /mus) eller verifikasjon av FACS.
Cell Proliferation Assay
celler ble sådd i 96-brønns plater ved en tetthet på 1000 celler per brønn med DMEM-MSCM. Etter 24, 48 og 72 timer ble cellevekst bestemt ved hjelp av kolorimetrisk XTT celleproliferasjonsanalyse (Beit HaEmek, Israel). Prøvene ble analysert med Spectra MR Dynex (Chantilly, USA).
soft agar-analysen
Alikvoter av 10
4 melanomceller ble resuspendert i 1 ml, 0,35% agar i MSCM. Alikvoter ble helt over i seks-brønns plater på toppen av en 1,5-ml lag av 0,5% agar i MSCM, fikk stivne og ble inkubert i 21 dager ved 37 ° C i nærvær av 5% CO2. Rettene ble fotografert med et stereoskopisk bildesystem (stereo Lumar.V12. Zeiss, Tyskland) og tall kolonier pr 1 /cm
2 ble beregnet etter kjøpet ved hjelp ImagJ (NIH, Bethesda, MD) bildeanalyse programvare.
Assessment of Tumor sfæroide Dannelse og selvfornyelse Analyse
A 2 ml agar nedre lag ble fremstilt ved å re-suspenderende 0,5% agar med MSCM, som deretter ble tillatt å størkne i 6-brønners plater. Alikvoter av 3 x 10
4-melanomceller i MSCM ble sådd ut i henge forhold på bløt agar lag og inkubert i 2-16 dager ved 37 ° C, i nærvær av 5% CO
2 før analyse.
Sphere begrensende fortynning Analysis (SLDA) ble utført som tidligere beskrevet. [24] Kort beskrevet, sfærer ble høstet etter 14 dager holdt i suspensjonsbetingelser i 6 brønner plater, adskilt med trypsin og sådd ut på nytt i ikke-adherente betingelser i MSCM ved hjelp av fortynning aliquoter av: 1000, 300, 100, 50, 10 celler /96 -brønner plate. Fjorten dager senere ble antall brønner uten sfære formasjon kvantifiseres og dataene ble log transformert og plottet mot plating tetthet. En lineær regresjon ble brukt for å beregne hyppigheten av celler i stand til prolifererende for å danne et melanom sfære.
kvantitativ revers transkripsjon-PCR
Total RNA ble ekstrahert fra musemelanomcellelinjer ved hjelp av en RNeasy Mini Kit (Qiagen, Nederland), i henhold til produsentens instruksjoner. Renset RNA ble kvantifisert ved hjelp av en NanoDrop® ND-1000 spektrofotometer (Nanodrop Technologies Inc., USA). cDNA ble syntetisert fra 200 ng av total RNA, ved hjelp av VersoTM cDNA Kit (Thermo Scientific, Epsom, UK) og tilfeldige heksamer. cDNA PCR amplifisering ble utført ved hjelp av Platinum® SYBR® Grønn qPCR SuperMix-UDG med ROX (Invitrogen Corporation, Grand Island, NY USA) på en Step One Plus Real Time PCR system (Applied Biosystems) med genet spesifikke oligonukleotid-par (Sigma Aldrich, Israel). Hvert gen ble sjekket av tre ulike par av primere, oppført i tabell S1. For å sikre spesifisiteten av reaksjonsbetingelsene, ved slutten av de enkelte forsøk ble smeltetemperaturen (Tm) av de amplifiserte produktene målt for å bekrefte dens homogenitet. Sykkelbetingelsene var som følger: 50 ° C i 2 minutter, 95 ° C i 2 minutter, 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 30 sekunder for totalt 40 sykluser. Hver prøve ble analysert i triplikat. For kvantifisering ble standardkurver oppnådd ved anvendelse av seriefortynnet cDNA amplifisert i den samme real-time PCR løp. Resultatene ble normalisert til ACTB og 18S mRNA nivåer. 2-ΔΔCT metoden ble anvendt for å analysere de relative endringer i genekspresjon. Etter kvantifisering prosedyren ble produktene løst med 2,5% agarosegel-elektroforese for å bekrefte at reaksjonen hadde forsterket DNA-fragmenter av forventet størrelse.
Statistical Analysis
Student
t
tester eller analyser mellom grupper (ANOVA) ble anvendt for statistisk analyse etter behov. Forskjeller ble betraktet som signifikant på
P
0,05. Alle data er vist som gjennomsnitt ± SD, med mindre annet er angitt. Alle forsøk ble gjentatt i triplikat. Data fra representative eksperimenter er vist.
In vivo
eksperimenter besto av 10-15 mus i hver forsøksgruppe.
Resultater
For å kunne vurdere sammenhengen mellom kreft celle selvfornyelse potensialet og celle skjebne, vi valgt murine melanomceller, som ble hentet fra den samme foreldrecellelinje, men som har forskjellige fenotyper
in vivo Hotell og
in vitro
. Den K1735 murine melanoma cellelinje har blitt brukt i stor utstrekning for å studere melanom [25]. Denne cellelinjen, som har en lav tilbøyelighet til å danne metastaser, ble indusert i C3H /HEN-mus etter kronisk eksponering for ultrafiolett stråling. For vårt studium, velger vi tre cellelinjer, som ble avledet fra den opphavelige cellelinje, men som skilte seg vesentlig i deres karsinogent potensial, kule-dannende evne og clonogenicity [26], [27], [28]. Den K1735 /16 er en ikke-metastatisk cellelinje og den K1735 /M4-cellelinjen ble avledet fra en lungemetastase og har et høyt metastatisk potensiale. En tredje cellelinje, K1735 /16S, ble avledet fra K1735 /16-cellelinjen ved å holde cellene i suspensjon ikke-adherente betingelser i 16 dager. Alle tre cellelinjer utstilt lignende spredning kinetikk når dyrket i kultur plater (Fig. 1a).
(A) spredningshastighet i kulturbehandlede plater ble bestemt etter 96 timer ved hjelp av XTT analysen. Dataene er gjennomsnitt ± SD av minst tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. (B) Gjennomsnittlig antall kolonier dyrket på myk agar etter 21 dager i kultur. Dataene er gjennomsnittlig ± SD av fem høy effekt felt (P 0,001). (C) Representative mikroskopiske bilder av kreft kuler 21 dager etter plating. (D) Representative mikroskopiske bilder av kreft kuler, 6 dager etter plating i ikke-heftende forhold.
Soft Agar Colony og spheroid Formation Potensielle
Kreftceller dyrket i tredimensjonale flercellet kuler anses av mange en pålitelig
in vitro
modell som reproduserer noen av de komplekse funksjonene i solide tumorer [29]. Vi først forsøkt å karakterisere clonogenicity og sfære dannende evne tre cellelinjer K1735 /16, K1735 /16S og K1735 /M4 i myk agar. Den K1735 /16-cellelinjen ble dyrket i bløt agar mislyktes i å danne kolonier etter 21 dager i kultur (fig. 1B og C). På den annen side, både metastatisk K1735 /M4 cellelinje og den K1735 /16S-cellelinjen hadde fremtredende en kolonidannelse kapasitet (fig. 1B og 1C). Vi neste undersøkt om det samme fenotypiske heterogenitet er vedvarende i henge ikke-heftende forhold, som er sett av mange å være den nærmeste tilnærming av
in vivo
tumorigenicity mellom in-vitro [30], [31 ], [32], [33], [34]. Sfæren dannelse kapasiteten ble evaluert 6 dager etter plating med MSCM. A er vist i figur 1D, den K1735 /M4 og K1735 /16S cellelinjer viste en fremtredende sfære-dannende evne, mens K1735 /16-cellelinjen klarte ikke å vokse i disse stressbetingelser. Men når K1735 /16 celler ble holdt på disse forholdene i 16-20 dager, noen kuler kunne påvises i noen av platene.
Stemness Potential
For å evaluere selvfornyelse potensialet for de tre cellelinjer, gjennomførte vi en serie fortynning analyser ved hjelp av SLDA i serumfritt media, rettet for å undersøke evnen til en begrensende fortynning analyse av melanomceller til å danne kuler i ikke-adherente betingelser og etablert en frekvens analyse av melanom sfære formasjon. [24], [35], [36] Alle tre cellelinjer hadde en lignende spredning potensial når utsådd på en 96-brønners kulturplater i normale forhold (fig. 2A). I kontrast til selvfornyelse potensial i serum-fritt media av den ikke-metastatisk cellelinje, K1735 /16, skilte seg vesentlig fra de andre to cellelinjene. SLDA utført etter den andre reseeding viste at hyppigheten av celler i stand til å fornye seg selv var 1/216 for K1735 /M4 cellelinje, 1/296 for K1735 /16S-cellelinjen og 1/36733 for K1735-16 cellelinje med MSCM (fig. 2). I tillegg K1735-16 celler var ikke i stand til å danne kuler i adeherent forhold, mens K1735 /M4 cellene spontant dannet sphares i serumfritt medium.
SLDA utført etter den andre reseeding med MSCM viste at hyppigheten av celler i stand til å fornye seg selv var A. 1/216 for K1735 /M4 cellelinje, B. 1/296 for K1735 /16S-cellelinje og C. 1/74720 for K1735-16 cellelinje. Skjæringspunktet på log (37% negative brønner) ble brukt til å beregne sfæren dannende frekvens (se materialer og metoder).
Samlet utgjør disse data tyder på en fenotypiske heterogenitet av enkelt murine melanomceller, som ble avledet fra den samme opphavelige cellelinje. Den selvfornyelse potensial i suspensjonen ikke-klebende analysen er sammenlignbar med den kuledannende evne og clonogenicity i bløt agar-analysen.
Svulst Potensielle i SCID-mus
Neste vi forsøkt å evaluere den tumorigent potensiale av de tre cellelinjene hos immunkompromitterte mus ved bruk ortotopiske intra footpad injeksjoner. Dette ble vurdert ved å injisere 2 × 10
5 ferskt dissosierte K1735 /16, K1735 /M4 og K1735 /16S kreftceller i fotbladet av SCID-mus. Håndgripelig svulster var tydelig i alle mus innen 20 dager. Som vist i figur 3A, er metastatisk cellelinje, K1735 /M4, oppviste de høyeste vekstkinetikk, etterfulgt av K1735 /16S-cellelinjen, mens de ikke-metastaserende /ikke-colonogenic 1735-1716 cellelinjen hadde den laveste tumorvekstpotensial (n = 6-7 mus per gruppe,
P
0,001). Disse data tyder på at selvfornyelse potensialet
in vitro
kan forutsi
in vivo
karsinogent potensial i SCID-mus.
(A) melanomcellelinjer (2 x 10
5) injisert i fotputen av SCID-mus. Den K1735 /M4-cellelinjen viste de høyeste tumor vekstkinetikk, etterfulgt av K1735 /16S-cellelinje. Den K1735 /16 cellelinjen hadde den tregeste tumorvekst (n = 5-6 per gruppe, P 0,001). (B) Den samme konsentrasjon av celler injisert i fotputen av syngene C3H /HEN-mus. Denne gangen, K1735 /M4 og K1735 /16S viste minimal karsinogent potensial, mens K1735 /16S cellelinjen hadde høyest tumorvekst kinetc (eksperimenter utført 3 ganger på rad med n = 10-15 dyr per gruppe; P 0,001 mellom K1735 /16 og K1735 /M4 eller K1735 /16S cellelinjer). (C) Representative histologiske trekk ved svulster dyrket i immunkompetente dyr, 16 dager etter implantasjon. (D) Immunhistokjemisk analyse med anti-Ki-67 Ab (en spredning markør) som viser lignende uttrykk i de tre cellelinjer. (E) Immunhistokjemisk farging med anti-Melan A Ab (en melanom markør) viste positive uttrykk i alle svulster, men ikke i tilstøtende normalt vev.
Svulst Potensielle i immunkompetente mus
Deretter ønsket vi å vurdere om tumorigent potensialet i de tre cellelinjer, som avslørt av de to
in vivo Hotell og
in vitro
analysene beskrevet ovenfor, kan forutsi den faktiske skjebne av kreftceller i immun-kompetente dyr. Dette spørsmålet kan bare løses i syngene musemodeller som kan gjenspeile den anti-tumor immunreaksjon og mikromiljøet respons. Derfor vi gjentok intra footpad injeksjoner tidligere utført i SCID-mus, men denne gangen ved hjelp syngene C3H /høne mus.
Til vår overraskelse, skjebnen til kreftceller i syngene modellen var helt motsatt enn det tidligere beskrevet i SCID-mus. Som vist i figur 3B, K1735 /16 celler injisert intra fotputen av C3H /HEN-mus viste de høyeste kreft vekstkinetikk, mens det bare et lite antall dyr utviklet tumorer etter injeksjon av den K1735 /M4 eller K1735 /16S-cellelinjen (eksperimenter utført 3 ganger med n = 10-15 mus per gruppe,
P
0,001). Histologisk analyse av tumorer med H E, og immunhistokjemisk farging med anti-Ki67-Ab (en spredning markør) eller anti-Melan-A Ab (en melanom markør) viste lignende ekspresjon av disse proteinene ved de tre kreftcellelinje-avledet tumorer ( fig. 3d-E). Ytterligere analyser av enkelt tumorer viste at alle mus injisert til fotputen av syngeniske C3H /HeN med K1735 /16-cellelinjen viste makroskopiske tumorer 30-100 dager etter injeksjon (fig. 4A). I motsetning til enkelte mus injisert med K1735 /M4 eller K1735 /16S cellelinjer som faktisk utviklet små tumorer 40 dager etter injeksjon, men disse tumorene tilbakegang spontant i 90-100% av musene i løpet av 80 dager etter at forsøket ble igangsatt (Fig. 4B og C).
(A-C) viser grafer tumorvekstkurver i alle tre cellelinjer i syngeniske mus, 1-100 dager etter injeksjon av 2 x 10
5 celler. Hver Grafen viser svulst utvikling i enkelte dyr (n = 5 per gruppe).
Spontan tumorregresjon i K1735 /M4 og K1735 /16S cellelinjer kan være på grunn av celler som gjennomgår apoptose dager etter implantasjon eller cellene gjenværende sovende i en lang tidsperiode. Vi undersøkte derfor antall apoptotiske celler i disse svulstene 40 dager etter injeksjon inn footpads av C3H /høne mus. TUNEL-analyse av apoptose viste signifikant høyere antall apoptotiske celler i K1735 /16S og K1735 /M4 cellelinje-avledet tumorer, sammenlignet med den i K1735 /16-avledede tumorer (fig. 5). Dette funnet indikerer at tumorigent potensiale for melanom er analysen konkret og at
in vivo
fenotypiske heterogenitet forskjellige subpopulasjoner av celler i normale dyr kan ikke forutsies utelukkende av sin stemness potensial.
apoptose ble vurdert ved Tunel analysen. (A-C) Representative mikroskopiske bilder (forstørrelse X20) av FITC-positive apoptotiske tumorceller (grønt) og telleren farging med propidiumjodid (rød). (D) Prosent av apoptotiske celler ble kvantifisert ved det midlere antall av FITC-positive celler i 6 mikroskopiske høy strømfelt. Data er uttrykt som gjennomsnitt + SD (n = 6 tumorer, P 0,001). TUNEL analyse viste at antall apoptotiske celler i K1735 /16 cellelinje-avledet svulster var betydelig lavere enn i K1735 /16S og K1735 /M4 cellelinjer-deriverte svulster.
Expression Profilen til stamcelle markører
tyder på at tumorigene celler kan skilles fra ikke-tumorigene celler basert på uttrykket av spesifikke markører. Derfor undersøkte vi muligheten av rapporterte stamcellemarkører for å forutsi klinisk fenotypen av de tre melanomcellelinjer. Det ble tidligere vist at c-Kit, kan CD133 og CD271 uttrykk analyser skille tumorigent fra ikke-tumorigene melanomceller [13], [37], [38], [39]. Vi undersøkte også ekspresjonen av Sca-1α, som ble vist å være forbundet med karsinogent potensial i bryst, prostata og lunge-kreft [13], [37], [38], [39]. Vi undersøkte derfor ekspresjonen av disse markørene ved flowcytometri i alle tre cellelinjer. Celler ble løsrevet bruker trypsin spalting eller enzymatiske frie forhold ved hjelp av EDTA. Figur 6-trypsin behandlede celler og figur S1-EDTA behandlede celler viser at c-Kit, CD133 og CD271-positive celler ble oppdaget bare i mindretall av celler. I motsetning til dette ble Sca-1α uttrykk som finnes i 50% av K1735 /16 celler, men ikke i de andre cellelinjer. Disse resultatene ble bekreftet av kvantitativ RT-PCR-analyser.
Uttrykk for stamcellemarkører ble bestemt ved bruk av anti- Sca-1α, c-Kit, CD133 og CD271 Abs. I motsetning til de andre markører, ble SCA-1α uttrykt i 50% av cellene i K1735 /16-cellelinje, men ikke i de andre cellelinjer. Resultatene er fra et av tre representative eksperimenter. Prosentandelen av positive celler og markører vises i øverste høyre hjørne. B16 mus melanom celler, benmarg (BM) eller hjerneceller (BC) ble brukt som positive kontroller.
Vi videre søkt å identifisere andre CSC markører uttrykt av melanomceller som kan spå deres tumorigent fenotype. Således, vist vi ytterligere 16 markører tidligere vist å bli uttrykt i cscs [12], [13], [21], [40], [41], [42], [43], [44], [45], [46], [47]. Ved hjelp av kvantitativ RT-PCR-analyse vi ikke var i stand til å oppdage høyere uttrykk av ABCG2, ABCB5, CD20, CD24, CD34, CD44, CD166, Oct4, Cripto-en, CD-90, Gli1 eller Sox2 i noen av K1735 /M4, K1735 /16S og K1735 /16 cellelinjer (fig. 7). Vi har bekreftet disse resultater i noen av markørene ved hjelp av Western blot (Fig. 8). Interessant, tre markører Nanog, ALDH3A1 og nestin, ble uttrykt i det K1735 /16-cellelinje, men ikke i dens dattercellelinje K1735 /16S, eller ved metastatisk K1735 /M4 cellelinje. I alt vi vist 19 forskjellige markører som tidligere er foreslått å være assosiert med karsinogent potensial av kreftceller, og i alle av dem, høyt-tumorigene cellelinjer K1735 /M4 og K1735 /16S hadde lik eller lavere ekspresjon i forhold til lav-tumorigen cellelinje.
Relativ ekspresjon av 15 markører tidligere er foreslått for anvendelse for å forutsi den selvfornyelse potensialet av kreftceller. ALDH3A1, Nanog og nestin uttrykkes for det meste i K1735 /16-cellelinje, men ikke i den K1735 /16S og K1735 /M4 cellelinjer. Andre stamcellemarkører inkludert SOX2 viste ingen differensial uttrykk mellom de tre cellelinjer. Dataene er gjennomsnittlig ± SD fra tre forskjellige eksperimenter. Fersk dissosiert benmarg og hjerneceller ble brukt som positive kontroller (høyre kolonne).
Disse markørene ble tidligere foreslått for bruk til å forutsi melanom selvfornyelse potensial. HTB-72 human melanoma-cellelinje og murine astrocytter (AST) ble anvendt som positive kontroller. Legg merke til at den eneste markør som ble uttrykt av murine melanomcellelinjer var Nestine, som ble uttrykt i det ikke-metastatisk cellelinje (K1735 /16).
Til slutt, søkte vi å bekrefte resultatene ved klonal celle sortering på celle-nivå. Denne analysen ble rettet for å bestemme hvorvidt underpopulasjoner K1735 /M4 kan gi opphav til økt clonogenicity og selvfornyelse.
