Abstract
ortotopiske modeller av ulike typer svulster er mye brukt i anti-tumor terapeutiske eksperimenter i prekliniske studier. Men det finnes noen måter å riktig overvåke terapeutisk effekt i ortotopiske tumormodeller, spesielt for svulster usynlige fra utsiden. I denne studie forsøkte vi å etablere en ikke-invasiv semikvantitativ bioluminescent avbildning fremgangsmåte for overvåking av en ortotopisk spiserørskreft musemodell. Vi har bekreftet at TE8 spiserørskreft cellelinje implantert orthotopically inn i den abdominale spiserøret av
nu /nu
mus (n = 5) som er utviklet ikke bare en hoved svulst på den implanterte området, men også lokal lymfeknutemetastaser og peritoneal disseminations innen 6 uker etter vaksinasjon. Vi etablerte en TE8 cellelinje som stabilt uttrykte ildflue luciferase genet (TE8-Luc). Vi viste at TE8-Luc-celler implantert subkutant i
nu /nu
mus (n = 5) økte med tiden inntil 5 uker etter inokulering. Tumorvolumet var sterkt korrelert med selvlysende intensitet emittert fra svulsten, som ble kvantifisert ved hjelp av IVIS avbildningssystem. Vi viste da at TE8-Luc-celler implantert orthotopically i musen abdominal spiserøret (n = 8) også dannet en svulst, og at det luminiserende intensiteten av en slik tumor, som detektert ved IVIS, økte over tid til 7 uker etter inokulering, og var derfor sannsynlighet for å reflektere tumorprogresjon. Vi foreslår derfor at denne ortotopisk modell spiserørskreft, overvåket ved hjelp av ikke-invasiv semikvantitativ IVIS avbildningssystem, vil være nyttig for in vivo terapeutiske eksperimenter mot spiserørskreft. Denne eksperimentelle innstillingen forventes å bidra til utvikling av nye terapeutiske teknologier for spiserørskreft i prekliniske studier
Citation. Kuroda S, Kubota T, Aoyama K, Kikuchi S, Tazawa H, Nishizaki M, et al. (2014) Etablering av en ikke-invasiv semikvantitativ Bioluminescent Imaging metode for overvåking av en ortotopiske Esophageal Cancer Mouse Model. PLoS ONE 9 (12): e114562. doi: 10,1371 /journal.pone.0114562
Redaktør: Sunil Singhal, University of Pennsylvania, USA
mottatt: 14 august 2014; Godkjent: 11 november 2014; Publisert: 10.12.2014
Copyright: © 2014 Kuroda et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Grant-in-Aid fra departementet for utdanning, kultur, sport og teknologi, Japan (TF) og tilskudd fra Helsedepartementet, Arbeids- og velferdsdirektoratet, Japan (TF). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
esophageal kreft er en av de mest vanlige typer av kreft i verden. Histologisk plateepitelkarsinom står for mer enn 90% av kreft i Japan, mens adenokarsinom står for mer enn halvparten av krefttilfellene i USA Prognosen for spiserørskreft er ganske dårlig blant kreft i mage-tarmkanalen, som for eksempel magekreft og tykktarmskreft som esophageal kreft er utsatt for lymfeknutemetastaser og direkte invasjon til omkringliggende organer. Til tross for fremgang i tidlig diagnose og i utviklingen av kirurgiske teknikker og utstyr, samt i kjemoterapi, strålebehandling og deres kombinasjon, har kreftfaren ennå ikke vært tilfredsstillende løst, og dette er et felt der nye effektive behandlingsformer forventes å bli utviklet i nær fremtid [1] – [3].
i feltet av medisiner, ortotopiske tumormodeller er utvilsomt bedre modeller enn subkutane modeller for evaluering av den terapeutiske effekten av nye legemidler fordi de bedre gjenspeiler sykdomsprogresjon av de opprinnelige tumorer [4], [5]. En rekke ortotopiske tumormodeller har vært brukt i dyreforsøk inkludert modeller av tykktarm, bukspyttkjertel, lever, lunge, prostata, nyrecelle, blære, bryst, melanoma og hjernesvulst [6]. Men det er bare noen få rapporter om ortotopiske spiserørskreft modeller til tross for stort behov for en slik modell. Mangelen på en ortotopisk modell spiserørskreft synes å være på grunn av problemene med anatomisk lokalisering og størrelse av spiserøret i tillegg til den tekniske vanskelighet med å etablere en ortotopisk modell.
Tilgjengeligheten av en fremgangsmåte for evaluering av terapeutisk effektivitet er et annet problem når du bruker en orthotopic modell. Selv om overlevelsesrate eller kroppsvekt har vært vanlig anvendt for evaluering, disse parametrene ikke direkte reflekterer terapeutisk virkning på grunn av påvirkning av en rekke andre faktorer på en slik effekt. Noen få diagnostiske modaliteter har vært anvendt som ikke-invasive fremgangsmåter for overvåking av en ortotopisk modell, slik som magnetisk resonanstomografi (MRI) [7], [8] og positronemisjonstomografi (PET) /computertomografi (CT) [9 ], [10]. I tillegg er bruken av grønt fluorescerende protein (GFP) – [4], [11] og luciferase- [12], [13] som uttrykker cellelinjer er gitt en interessant måte til utviklingen av en ikke-invasiv avbildningsteknikk
Her rapporterer vi etablering av et originalt orthotopic spiserørskreft modell i mus, som utviklet lokale lymfeknutemetastaser og peritoneal disseminations i tillegg til hoved svulst. Ved hjelp av denne modellen vi bekreftet at IVIS Imaging System (Xenogen, Alameda, CA) var hensiktsmessig og nyttig som en ikke-invasiv metode for overvåking for tumorprogresjon i denne modellen.
Materialer og metoder
dyret eksperimentelle protokollen ble godkjent av etikk Review Committee for forsøk med dyr av Okayama University, og alle mus brukt i denne studien ble bedøvet med ketamin /xylazin eller isofluran /oksygen for eksperimenter og avlives med halshugging under narkose.
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og cellekulturer
Den humane esophageal squamous cell carcinoma linje, TE8 (RIKEN Cell Bank BRC, Japan) ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS), 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. TE8 transfektert med ildflue luciferase plasmid vektor (PGL-Control-RSVneo) (vennlig levert av Dr. Hiroyuki Mizuguchi, Osaka University, Osaka, Japan) og klonet ved begrensende fortynning (TE8-Luc) ble dyrket som beskrevet for TE8 ovenfor, men med tilsetning av 0,2 mg /ml Geneticin (G418) (Life Technologies, 10131-027) til mediet. Den gjennomsnittlige nivået på luciferase aktivitet per 5,0 × 10
4 TE8-Luc celler var 1462 relative lysenheter (RLU).
Subkutan tumormodell
TE8-Luc celler (2 × 10
6 celler /mus) ble injisert subkutant i flanken av fem 5-6 uker gamle BALB /c
nu /nu
mus. Den vinkelrette diameteren av hver tumor ble målt en gang i uken til 5 uker etter tumor-inokulering. Tumor volum ble beregnet ved hjelp av følgende formel: tumor volum (mm
3) =
en
×
b
2 × 0,5, der
en
er den lengste diameter,
b
er den korteste diameter og 0,5 er en konstant for å beregne volumet av en ellipsoide.
ortotopiske spiserørskreft modell
Kvinne BALB /c
nu /nu
mus (5-6 uker gamle) ble løst i en liggende stilling. En hud innsnitt 7 til 10 mm lang ble gjort i midten av den øvre del av magen fra xifoid prosessen. Leveren ble reist opp og magen ble revet med pinsett slik at abdominal spiserøret kan bli sett. En 1 ml sprøyte med en 31-gauge nål, der TE8 eller TE8-Luc-celler ble suspendert i Matrigel i en konsentrasjon på 2 x 10
6 celler /20 ul, ble innsatt i den fremre veggen i magesekken og deretter flyttet subserosally mot abdominal spiserøret over esophagastric krysset. Cellene ble deretter langsomt injisert. Til slutt, magen ble stengt med sting (Movie S1).
Ved hjelp av denne metoden, TE8 celler ble orthotopically implantert i fem BALB /c
nu /nu
mus. Ved 4 uker etter tumor-inokulering ble alle fem mus drives på nytt for å kontrollere tumorutvikling, og deretter en av de fem mus ble avlivet, og dens hovedtumor og en lokal lymfeknute ble høstet for histologisk undersøkelse. 6 uker etter vaksinasjon, ble de fire andre musene alt ofret etter re-laparotomi og observasjon.
TE8-Luc celler ble implantert i abdominal spiserøret av åtte BALB /c
nu /nu
mus ved hjelp av den samme metode. 3 uker etter tumor-inokulering ble alle musene operert for å kontrollere tumorutvikling, og deretter fem av de åtte mus, hvor tumordannelse ved spiserøret ble observert, ble målt en gang i uken ved hjelp av IVIS bildedannende system som er beskrevet nedenfor til 7 uker etter tumor-inokulering.
IVIS avbildning
luciferin substratet av luciferase, ble injisert intraperitonealt i mus i en dose på 150 mg /kg kroppsvekt. Musene ble deretter bedøvet og anbragt på bilde stadium av IVIS anordningen i mage (subkutant modell) eller ryggleie (ortotopisk modell) stilling. Bilder ble samlet inn hvert få minutter fra 10 til 30 minutter etter luciferin injeksjon bruker IVIS Imaging System (Xenogen, Alameda, CA), og fotoner som sendes ut fra svulsten og dens omgivelser ble kvantifisert ved hjelp av levende bilde programvare (Xenogen).
Statistisk analyse
Enkel lineær regresjonsanalyse ble utført ved anvendelse av Microsoft Excel for å undersøke korrelasjonen mellom tumorvolumet og selvlysende intensitet, og koeffisienten, R «sup> 2, ble beregnet for å vurdere styrken av forening.
Resultater
TE8 celler injisert i subserosal plass av abdominal spiserøret av BALB /c
nu /nu
mus dannet en svulst (fig. 1A) i fire av de fem mus og utvikles lokale lymfeknutemetastaser (fig. 1C) i to av fem mus ved 4 uker etter tumor-inokulering. Ved 6 uker etter inokulering, en annen mus hadde resultatene av peritoneale disseminations (fig. 1E). Dannelsen av en hovedsvulst (fig. 1B) og metastaser i lokale lymfeknuter (Fig. 1D) ble også bekreftet ved histologiske funn. Den viktigste svulst vokst i submucosal plass til tross for å ha blitt injisert inn i subserosal plass, mens det ikke invadere slimhinnen.
A) TE8 celler implantert i den abdominale spiserøret dannes en svulst på det implanterte området (hvit pil ) 4 uker etter tumor-inokulering. B) H.E. farging av parafin-innleiret vev av hoved tumor (A) viste at tumoren hadde spredt seg inn i det submucosal plass av abdominal spiserøret. (T: Tumor, L: Lumen, E: Epitel lag, M: Muskel lag) C) TE8 celler implantert i abdominal spiserøret utviklet lokale lymfeknutemetastaser (hvit pilspiss) 4 uker etter tumorinokulasjon. D) H.E. farging av parafin-innleiret vev av den lokale lymfeknute (C) histologisk angitt lymfeknutemetastase. E) TE8 celler implantert orthotopically også utviklet peritoneal disseminations (svarte piler) på 6 uker etter tumorinokulasjon. Skala barer; 2 mm (A, C, E), 500 mikrometer (B, D)
neste generert TE8-Luc celler som stabilt uttrykker ildflue luciferase genet, og subkutant implantert disse cellene i BALB /c
nu /nu
mus. Den luminescens av disse cellene ble overvåket med IVIS avbildningssystemet for å bestemme om tumorvolum korrelert med selvlysende intensitet. TE8-Luc celler dannes en svulst i alle fem mus. Når tumorene vokste, øket luminescerende intensitet over tid, som målt både visuelt (fig. 2A) og kvantitativt (fig. 2B) (Fig. 2C). Tumorvolumet og luminiserende intensitet var sterkt korrelert med hverandre (R «> 2 = 0,9199) (fig. 2D), noe som indikerer at målingen av luminescerende intensitet er egnet for evaluering av tumorprogresjon.
A) Ivis bilder det ble oppnådd en gang i uken til 5 uker etter subkutan inokulering av TE8-Luc-celler. B) Luminescent intensiteten av fotoner som sendes ut fra hver tumor i bildene i (A) ble kvantifisert. Mus nummerering tilsvarer nummereringen i (A). C) Tumorvolumet ble også beregnet en gang i uken. D) Sammenheng mellom selvlysende intensitet sendes ut fra hver tumor og tumor volum ble statistisk evaluert ved hjelp av data fra (B) og (C).
Til slutt, vi bestemt om TE8-Luc celler kan danne en orthotopic svulst som vokste over tid. Fem av åtte BALB /c
nu /nu-mus
hvori TE8-Luc-celler ble implantert orthotopically inn i den abdominale spiserøret utviklet en svulst på den implanterte området på 3 uker etter tumor-inokulering, noe som ble bekreftet ved å re-laparotomi . Disse fem mus ble overvåket ved IVIS en gang i uken, og fotoner som sendes ut fra tumor og dens omgivelser økt over tid som bestemt både visuelt (Fig. 3A) og kvantitativt (Fig. 3B).
A) Ivis bilder det ble oppnådd en gang i uken fra 3 til 7 uker etter TE8-Luc ortotopisk svulst inokulering inn i den abdominale spiserøret. B) Selvlysende intensiteten av fotoner som sendes ut fra hver svulst og dens omgivelser i bildene i (A) ble kvantifisert. Mus nummerering tilsvarer nummereringen i (A).
Diskusjoner
Furihata et al. [14] var den første til å rapportere etablering av en ortotopisk modell esophageal inokulering i mus på 2001, hvor de åpnes den fremre veggen i magesekken og injiserte tumorceller inn i det submucosal plass av abdominal spiserøret direkte etter laparotomi. I kontrast, celler injisert vi inn i subserosal plass av abdominal spiserøret uten å åpne magen. Selv om deres metode er teoretisk en mer ideell metode enn vår, er vår metode enklere og er fortsatt en akseptabel metode fordi svulster som dannes ved hjelp av vår metode vokste og spredt i submucosal plass til tross for at injisert i subserosal plass som de histologiske funn i fig. 1C showet. To av fem av våre modell musene lokale lymfeknutemetastaser og en mus utstilt peritoneal disseminations. Åpenmetastaser til lever, lunge eller mediastinale lymfeknuter ble ikke funnet. For å frembringe en mer invasive ortotopisk spiserørskreft-modellen, kan det være nødvendig å anvende mer invasive celler [15], eller for å bruke kliniske tumorprøver som har høyt potensial invasiv [4].
Ohara et al. [16] etablert en interessant ortotopisk musemodell for cervical og torakal spiserørskreft ved injisering av tumorceller inn i esophageal lumen gjennom munnen. Selv om denne metoden virker enkelt i at ingen kirurgisk teknikk er påkrevet, kan det være vanskelig å bedømme om tumorceller er nøyaktig injiseres inn i spiserøret, fordi framgangsmåten er uunngåelig utført blindt. Imidlertid kan denne metoden har en fordel i vår metode i at det fører til dårlig oral inntak, som bedre gjenspeiler utviklingen av den opprinnelige svulsten. I vår studie fant kroppsvekt reduseres ikke i det hele tatt før like før døden, til tross for omfattende tumorvekst og spredning (data ikke vist).
Quatromoni et al. [17] har nylig rapportert effektiv adenoviral-basert immunterapi mot spiserørskreft, hvor en ortotopisk spiserørskreft musemodellen etablert ved gastroøsofageal krysset ved hjelp av samme teknikk som vi viste i filmen ble anvendt. I denne modellen, tumorer vokste over tid begrenset til tumor-injeksjonsstedet uten direkte invasjon av esophageal mucosa. Imidlertid tumorer ikke forårsake tilstopping av esophageal lumen, og ingen mus hadde tegn på dysfagi og betydelig vekttap. Disse egenskapene er alle like med dem vi viste i vår studie.
I motsetning til Gros et al. [18], [19] etablert en ortotopisk spiserørskreft musemodell ved å bruke et meget aggressivt, spiserørskreft cellelinje på samme måte som vår, hvor de detekteres metastatisk spredning til lever og lunger så vel som til lymfenodene ved hjelp av høyoppløselig bildebehandling med GFP og ved MR mens vi var ikke i stand til å påvise metastaser til lever eller andre organer ved luciferase bildebehandling i vår studie. Disse rapportene fra Quatromoni et al. og Gros et al., inkludert våre studier, antyder at ortotopisk spiserørskreft modell etablert på gastroøsofageal krysset og etableringen metode er universell og reproduktiv, og at denne modellen kan føre til tumorprogresjon, som ligger i nærheten av selve klinisk praksis, for eksempel metastaser i lymfeknutene, bukhule og i leveren eller andre organer i tillegg til lokal tumorvekst.
i motsetning til subkutane modellene, er det vanskelig å nøyaktig analysere tumorprogresjon i ortotopiske tumormodeller. Selv om overlevelse og kroppsvekt blir ofte brukt som evalueringsmetoder i ortotopiske studier, disse parametrene ikke direkte reflekterer terapeutisk effekt fordi mange andre faktorer også påvirke resultatene. Bruken av tumorceller som er merket med luciferase-rapportørgenet og selvlysende avbildning, som nå er en godt brukt metode i forskning felt, gjør det mulig å overvåke tumorvekst ikke-invasiv in vivo, spesielt i dype vev [13]. Derfor vi opprinnelig etablert TE8-Luc celler som ble stabilt-transfektert med ildflue luciferase genet og som brukes til ikke-invasiv monitorering.
I vår studie, ved hjelp av IVIS Imaging System, den selvlysende intensitet av fotoner som sendes ut fra TE8-Luc subkutane svulster sterkt korrelert med tumorvekst. På bakgrunn av dette faktum, er det derfor sannsynlig at en økning i selvlysende intensitet i en ortotopisk modell over tid reflekterer nøyaktig tumorprogresjon. Faktisk, i en tidligere studie hvor vi overvåket kvantitativt terapeutisk effekt i denne orthotopic modellen ved hjelp av IVIS Imaging System, gjorde endringen i selvlysende intensitet ser ut til å gjenspeile terapeutisk effekt [20]. Derfor er metoden som vi beskriver i denne studien for etablering av en ortotopisk spiserørskreft modell hos mus, og for ikke-invasiv overvåking med IVIS avbildningssystem er en meget nyttig og praktisk fremgangsmåte, og forventes å bidra til utvikling av nye terapeutiske teknologier for spiserørskreft.
Hjelpemiddel Informasjon
Movie S1. .
Hvordan lage en orthotopic spiserørskreft musemodell
doi: 10,1371 /journal.pone.0114562.s001 plakater (MPG)
bekreftelser
Forfatterne takker Tomoko Sueishi og Tae Yamanishi for deres utmerkede teknisk støtte.
