Abstract
microRNAs (mirnas) har blitt foreslått å spille en viktig rolle i å regulere svulst progresjon og invasjon. Imidlertid er det uttrykk for MIR-339-5p i kolorektal kreft og dens virkninger ikke kjent. Her rapporterer vi at MIR-339-5p er en tumor suppressor ved å regulere uttrykket av PRL-en. I denne studien viste vi at downregulated MIR-339-5p nivåer i kolorektal kreft vev og svært invasiv CRC cellelinjer. Videre forbedrer ekspresjonen av MIR-339-5p hemmet CRC cellevekst, migrering og invasjon in vitro og undertrykket tumorvekst in vivo. Vi så skjermet og identifisert en roman MIR-339-5p målet, fosfataser av regenerere leveren-1 1 (PRL-1), og det ble ytterligere bekreftet ved luciferase assay. Overekspresjon av MIR-339-5p vil også redusere uttrykket av PRL-1 mRNA og protein. Den reduserte PRL-1-ekspresjon ble forbundet med lav ekspresjon av fosforylert-ekstracellulære signal-regulatedkinase1 /2 (p-ERK1 /2). Motsatt, reduksjon av MIR-339-5p av hemmere i cellene stimuleres disse fenotyper. Som konklusjon, våre resultater viser at MIR-339-5p fungerer som en tumor suppressor og spiller en rolle ved inhibering av vekst og metastasering av CRC cellene gjennom målretting PRL-1 og regulering p-ERK1 /2 .Disse funn tyder på at MIR-339- 5p kan være nyttig som en ny potensiell terapeutisk mål for CRC
Citation. Zhou C, Liu G, Wang L, Lu Y, Yuan L, Zheng L, et al. (2013) MiR-339-5p Regulerer Vekst, Colony Dannelse og metastasering av tykktarmskreftceller ved Targeting PRL-en. PLoS ONE 8 (5): e63142. doi: 10,1371 /journal.pone.0063142
Redaktør: Antonio Moschetta, University of Bari Consorzio Mario Negri Sud, Italia
mottatt: 03.12.2012; Godkjent: 29 mars 2013; Publisert: May 16, 2013
Copyright: © 2013 Zhou et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien er støttet av National Natural Science Foundation of China (No 30871156, No 81272758), Vitenskap og teknologi Prosjekt i Guangdong-provinsen (2009B030803041) og Science Foundation Natural i Guangdong-provinsen (Ingen 8151051501000057). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. De authers har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er en av de mest utbredte karsinomer over hele verden. Hvert år blir mer enn 1 million individer utvikler tykktarmskreft, og sykdomsspesifikk dødelighet er nesten 33% i den industrialiserte verden [1]. I mange tiår har dybden av tumorprogresjon og migrasjon blitt anerkjent som viktige prognostiske faktorer i CRC pasienter [2]. Progresjon av sykdommen gjennomgår mange tiår og involverer flere trinn genetiske hendelser [3]. De molekylære mekanismene bak denne prosessen fortsatt ikke kan dokumenteres [4]. Med utviklingen av avansert genomisk teknologi, en nylig oppdaget klasse av ikke-kodende små RNA, betegnes mirnas, har tiltrukket seg enorm interesse for tykktarmskreft forskning [5].
microRNAs (mirnas) er 20-22 nucleotide kort enkelt-strandet kodende RNA som regulerer ulike celleprosesser på post-transcriptional nivåer [6]. Mirnas ha innvirkning på kritiske gen kontrollere cellulær utvikling, differensiering, proliferasjon, apoptose og metabolisme [7] – [9]. Raskt voksende bevis har vist potensielle roller mirnas i patogenesen og progresjon av kreft [10]. Differensiell ekspresjon av mirnas mellom tumorvev og normalt vev i forskjellige krefttyper har foreslått mirnas kan fungere som onkogener og tumor suppressorer [11] – [12]. For eksempel først kreft-relaterte mål genet av MIR-21 fremmer celle migrasjon og invasjon ved å målrette PTEN i menneskelig hepatocellulær kreft og TPM1 i brystkreft [13], [14]. På den annen side er tapet av MIR-143 ble observert i blærekreft, mens forsterket ekspresjon av MIR-143 indusert veksthemming i blærecancerceller ved nedregulering av ekspresjon Erk5 på translasjonelt nivå [15]. Nylig, med utviklingen av avanserte miRNA serie analyse av genuttrykk (Mirage), kritiske mirnas uttrykk landskapet i kolorektal kreft har blitt godt dokumentert [16]. Overexpressed mirnas som MIR-20, MIR-21, MIR-17-5p, MIR-181b og MIR-200c har vært innblandet i kolon adenomer og karsinomer [17], [18]. Lavere nivåer av mirnas inkludert MIR-34a, MIR-126, MIR-143, MIR-145, og MIR-133b er også bekreftet i kolorektal kreft [19] – [22]. Nylig, noen mikroRNA arrays for å sammenligne mikroRNA profilene på CRC vevsprøver av tilbakefall hos pasienter tidlig og ikke-tidlig rapportert at nedregulering av MIR-339-5p uttrykk var assosiert med en dårlig prognose for kliniske pasienter med tykktarmskreft i stadium II [23]. Men inntil nå, funksjonell bevis på MIR-339-5p i tykktarm kreft har ikke blitt godt dokumentert og deres roller i kolorektal kreft progresjon er fortsatt uklart.
I denne studien, vurderte vi rollen som MIR-339 -5p i humane colon carcinom-celler. Vi undersøkte ekspresjonsnivået av MIR-339-5p i human kolon kreftceller og cancervev, og testet for dens virkninger på cellevekst, cellesyklusfordeling, og kolonidannelse og invasjon kapasitet in vitro. Vi administrert MIR-339-5p forløper til en mus colon cancer tumor xenograft modell, og det ytterligere vist at det kan undertrykke kolon tumorvekst in vivo. Videre gir vi underliggende mekanisme som MIR-339-5p kan hemme menneskelige CRC spredning og invasivitet ved å målrette den PRL-en onkogen. PRL-1 ble identifisert som et medlem av familien består av tre nær beslektede molekyler (PRL-1, PRL-2, og PRL-3), som utgjør en ny klasse av protein tyro-sinus fosfatase (PTP). De PRLs er blant de minste av PTP, med molekylmasser på 20 til 22 kDa og består hovedsakelig av et katalytisk domene. Betydelig bevis fra cellelinje og murine studier tyder på at disse genene fremme tumordannelse, invasjon og metastasering [24], [25]. Disse resultatene indikerer at Mir-339-5p kan fungere som en tumor suppressor, som regulerer vedlikehold og progresjon av kreft.
Materialer og metoder
kliniske prøver
Prøver av kolorektal kreftvev og matchet normal tarmslimhinne fra 30 pasienter med kolorektal kreft ble samlet opp fra friske kirurgiske prøver, frosset i flytende nitrogen, og lagret ved -80 ° C inntil videre analyse. Alle vevene var blitt histologisk bekreftet å være en adenokarsinom i tykktarmen. Patologisk verifikasjon og klassifisering ble utført basert på systemet av International Union Against Cancer. Forskningsprotokollen ble godkjent av etikkomiteen ved Nanfang Hospital, og skriftlig samtykke ble innhentet fra alle pasienter for bruk av sine vev.
Cell kultur
Menneske embryonale nyre 293ft celler og seks menneske colonic carcinom cellelinjer HCT116, HT29, LS174T, SW480, SW620 og LoVo med forskjellige metastatiske egenskaper ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC). Alle cellelinjene ble dyrket i RPMI 1640 (Hyclone, Logan, Utah, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibco-BRL, Invitrogen, Paisley, UK). Cellelinjer ble dyrket ved 37 ° C i en fuktet inkubator på 5% CO2.
Bygging av pre-MIR-339 over-uttrykke konstruksjoner og etablering av stabile klone
pLVTHM vektor som inneholder en destabilisert grønt fluorescerende protein (GFP) variant (holdt i vårt laboratorium) ble anvendt som en MIR-339-5p overekspresjon system. DNA-koding forhånds MIR-339 var PCR-amplifisert fra humant genomisk DNA med skrå primere (5 «CGACGCGTCGCGCCATTGCCACGGCACCAT) og revers primere (5» CCATCGATGGGGCAGAAGACCCACGCATACGAGT), fordøyd med
Mlul Hotell og
Clal
og ligert til pLVTHM. De konstruksjoner ble bekreftet ved direkte DNA-sekvensering. Lentivirus ble generert av co transfeksjon av de ovennevnte konstruksjon med emballasje
plasmider psPAX
2 og pMD2.G ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, California) inn HEK293FT celler. Etter 48 timers dyrkning ble supernatanten oppsamlet og frosset ved -80 ° C inntil bruk. SW620 celler ble transduced med vektor supernatanten og deretter FACS-sortert for grønt fluorescerende protein (GFP). Bekreftelse på stabil transfeksjon av plasmidene ble oppnådd ved bruk av mikroRNA QRT-PCR-analyse.
mikroRNA ligner, siRNA transient transfeksjon
mikroRNA ligne, MIR-339-5p hemmer og den negative kontrollen ble kjøpt fra GenePharma (Shanghai, Kina). Celler ble platet ut på 50% konfluens, og ble transfektert med 200 nM mikroRNA etterligne eller MIR-339-5p inhibitor (5′- CGUGAGCUCCUGGAGGACAGGGA-3 «) eller inhibitor-negativ kontroll (5′- CAGUACUUUGUGUAGUACAA-3′ ved Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i Opti-MEM (Invitrogen, Carlsbad, California), i henhold til produsentens protokoll. 24 eller 48 timer etter transfeksjon ble cellene høstet for videre forsøk. mikroRNA ligne var HSA-MIR-339-5p ligner sans 5»-UCCCUGUCCUCCAGGAGCUCACG- 3 «og anti-sense 5′- UGAGCUCCUGGAGGACAGGGAUU-3′ og negativ kontroll, sense 5»- UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 «og anti-sense-5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3».
RNA-ekstraksjon og SYBR grønn kvantitativ PCR analyse
Total RNA ble ekstrahert fra celler ved hjelp Trizol reagens (Takara, Dalian, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner. for påvisning av MIR-339-5p uttrykk, stem-loop revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT -PCR) ble utført ved hjelp av en alt-i-OneTM miRNA kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) Detection Kit (GeneCopoeia, Rockville, MD) i henhold til produsentens instruksjoner. I korte trekk, ble 1 mg total RNA som inneholder små RNA hentet fra vevsprøver første polyadenylert av poly (A) polymerase og deretter revers transkribert til cDNA ved hjelp av en blanding av oligo-dT adapteren som følger med i pakken. Moden MIR-339-5p uttrykk i celler og vev ble oppdaget ved hjelp av hårnål-it TM mirnas qPCR kit (GeneCopoeia, Rockville, MD). Ekspresjon av U6 ble anvendt som en endogen kontroll. PCR-reaksjonen for amplifisering av MIR-339-5p ble utført ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 20 sek, 60 ° C i 20 sekunder og 72 ° C 10 sek. For PRL-1 mRNA deteksjon, revers transkripsjon ble utført ved hjelp av revers transkriptase System (Takara, Dalian, Kina). PRL-1 uttrykk ble målt ved SYBR grønn qPCR analyse (Takara, Dalian, Kina). Prime PRL-1 sekvenser var: (fremover) 5’GACCTGGATGGGGTAAACCT3 «og (revers) 5» TGTGACTTCCACAGGAGCTG3 «, de primer GAPDH sekvensene var: (fremover) 5’ACCCACTCCTCCACCTTTG3» og (revers) 5 «CACCACCCTGTTGCTGTAG3». SYBR PCR ble utført i en ABI PRISM 7500 Fast Real-time PCR system (Applied Biosystems). Hver prøve ble analysert i triplikat. Data ble behandlet ved hjelp av to
-ΔΔCT metode.
CCK-8 celleproliferasjonsanalyse
celleproliferasjon priser ble målt ved hjelp av Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Laboratories, Japan). Tjuefire timer etter at de er transfektert med en MIR-339-5p-inhibitor eller en kontroll miRNA, HCT116-celler ble sådd ut ved 1 x 10
3 per brønn i 96-brønns plate. Analysen celleformering ble utført på dagene 1, 2, 3 og 4. 10 ul CCK-8-reagens ble tilsatt til hver brønn og deretter platen ble inkubert i 2 timer ved 37 ° C. Før endepunktet av inkubasjon ble absorbansen målt ved 450 nm ved bruk av en mikroplate-spektrofotometer Vmax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Hver prøve ble analysert i triplikat. Mens SW620 ble sådd ut i 96-brønners plater ved 3 x 10
3cells per brønn, og den samme eksperiment ble utført på dagene 1, 2, 3, 4, 5, 6 og 7. Alle forsøk ble utført in triplo og gjentatt 3 ganger uavhengig av hverandre. Dataene ble plottet som middelverdier ± SD fra tre separate eksperimenter.
Cell-syklusanalyse
1 x 10
6-celler ble høstet og fiksert over natten med ved 4 ° C i 70% etanol. Etter at cellene ble vasket to ganger med PBS, ble deres DNA farget med cellesyklusen Detection Kit (KeyGen, Nanjin, Kina). Prøvene ble kvantifisert ved flowcytometri (Becton Dickinson, NJ, USA) og resultatene ble analysert med Modfit LT programvare (Verity Software House, Topsham, ME, USA) i henhold til produsentens instruksjoner ..
Plate klone formasjons analysen
hver brønn i en 6-brønns kulturplate ble inokulert med 2 x 10
2-celler, og hver gruppe inneholdt tre brønner. Etter inkubering ved 37 ° C i 14 dager, ble cellene vasket to ganger med PBS og farget med Giemsa-løsning. Antallet kolonier som inneholder ≥ 50 celler ble talt under et mikroskop med formelen:. Plate klone formasjon effektivitet = (antall kolonier /antall celler inokulert) × 100%
Cell invasjon og migrasjon analysen
celle invasjon og migrasjon evne ble evaluert ved bruk av transwell innsatser med 8 mikrometer porer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). For invasjon assay, 2 x 10
5-celler i serumfritt medium ble tilsatt til hver øvre rom av kammeret på forhånd belagt med matrigel matrise (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). 600 ul 10% FBS-medium ble tilsatt til det samsvarende nedre kammer. Hver celle gruppe ble belagt i 3 to brønner. Etter inkubasjon i 48 timer ble det ikke-invasive celler fjernes fra den øvre overflaten av transwell membran med en bomullsdott, og cellene som hadde migrert gjennom membranen og fast til den nedre membranoverflaten ble fiksert med metanol, farget med Giemsa og fotografert under mikroskop. For migrasjon assay prosedyrene var like, bortsett fra at 2 x 10
5-celler ble plassert i den øverste kammeret uten matrigel matrise pre-coated. Til slutt, ble cellene i nedre avdeling av kammeret som hadde invadert til basalsiden av membranen tellet ved hjelp av et lysmikroskop i 5 tilfeldige synsfelt (x 200).
Protein isolasjon og western blotting
i proteinekspresjon analysene standard vestlige blottings ble utført. Dyrkede eller transfekterte celler ble vasket to ganger med kald fosfatbufret saltløsning (PBS) og ble lysert på is i RIPA-buffer med 1% PMSF (KeyGen, Nanjin, Kina). Protein lysater ble løst i 10% SDS polyakrylamidgel, overført til PVDF-membraner og blokkert i 0,1% Tween 20 og 5% skummet melk-proteinet i Tris-buffer Saline. Proteiner ble probet med kanin-anti-PRL-1 monoklonalt antistoff (1:800, Proteintech Corporation, USA) og kanin-anti-ERK1 /2, fosfo-ERK1 /2 (p-ERK1 /2) monoklonalt antistoff (1:1000, BioWorld Corporation, USA), kanin-anti-β-tubulin-antistoff (1:2000, Epitomics Corporation, USA) over natten ved 4 ° C. Membranen ble vasket og visualisert med pepperrot peroksidase (HRP) – konjugert sekundært antistoff i 1 time. Signaler ble oppdaget av forsterket kjemiluminescens (KeyGen, Nanjin, Kina)
Luciferase reporter analysen
Prediksjon av MIR-339-5p bindingssteder ble utført ved hjelp TargetScan programvare (http: //www.. targetscan.org). Et fragment av 3’UTR av PRL-en inneholder den antatte MIR-339-5p bindingssetet ble forsterket ved PCR ved bruk følgende primere: wt-PRL-1 (fremover) 5 «CCGGCTCGAGATCTCCCACATTCATACC 3», wt-PRL-1 (bakover) 5 «TAAGCGGCCGCTTCATTAGCAGAAACCC 3» og satt på
Xol jeg
og
Noti-
restriksjonssetene, umiddelbart nedstrøms av luciferase genet i psiCHECK ™ -2 vektor (Promega, Madison, WI) En psiCHECK -2 konstruksjon innehold 3’UTR av PRL-en med en mutant frø sekvens av MIR-339-5p ble også generert ved hjelp av primere: mut-PRL-1 (fremover) 5 «GTCAAAGGGGCCTGAGAAAAGAATG 3», mut-PRL-en (revers ) 5 «TAAGTTGCACCTCAGAGTGCAAACA 3». Alle konstruksjoner ble verifisert ved DNA-sekvensering. HEK-293ft celler og HCT116-celler ble sådd i 48-brønners plater (2 × 10
3 levedyktige celler per brønn). Etter 24 timers inkubering ble cellene transfektert med psiCHECK ™ -2-PRL-en 3’UTR og psiCHECK ™ -2-mut-PRL-en 3’UTR i kombinasjon med kontroll oligonukleotid (endelig konsentrasjon på 80 nM) eller etterligner (80 nM) ved anvendelse av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i følge produsentens protokoll. Førti-åtte timer etter transfeksjon, ble luciferase aktivitet målt ved hjelp av Dual luciferaserapportørplasmid analysesystem (Promega). Ildflue luciferase-aktiviteten ble normalisert til Renilla luciferase-aktivitet for hver transfektert brønnen. Alle transfeksjon eksperimenter ble utført i triplikat og gjentatt 3 ganger, uavhengig av hverandre.
In vivo-tumorvekst assay
4 til 6 uker gamle atymiske nakne mus (Southern Medical Experimental Animal Center, per) ble anvendt for svulst implantasjon. Alle dyreforsøk strengt overholdt forskrift for forvaltning av saker Angå forsøksdyr, den kinesiske nasjonale retningslinjer for dyreforsøk, utstedt i 1988. Alle prosedyrer som involverer dyr og deres omsorg i denne studien ble godkjent og utført av Southern Medical University Institutional Animal Care og bruk Committee (Permit Number: SCXK GUANGDONG 2011-0015). Cellene ble høstet ved trypsinering, vasket to ganger med kald serumfritt medium, og re-oppslemmet med 200 ul serumfritt medium. For å evaluere kreft vekst in vivo, 2 × 10
6 SW620 /pLVTHM-pre-miR339 og SW620 /pLVTHM-NC celler ble uavhengig injisert subkutant inn på baksiden av 2 nakne mus. Etter tumorer ble påvist, ble mus vekt og tumorstørrelse målt hvert 5 dager. Den tumorstørrelse ble målt ved hjelp av et skyvelære som lengde x bredde
2 x 1/2. Den midlere tumorvolum ± SD for hver gruppe ble beregnet. Alle mus ble avlivet 20 dager etter implantasjon. Høstet svulster ble fotografert umiddelbart etter avliving. Da disse dannede tumorer ble fjernet, og tumorvev ble analysert med H . E farging
Statistisk analyse
Resultater av alle forsøk er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik SD på minst 3 uavhengige eksperimenter . Shapiro-Wilk test ble brukt til å kontrollere de kliniske prøvene «distribusjon. Forskjeller ble analysert ved hjelp av parametriske testen Mann-Whitney-Wilcoxon. For in vitro og in vivo studier ble t-test eller analyse av varians brukt for å sammenligne verdier av test- og kontrollprøver. Data ble ansett for å være statistisk signifikant når P . 0,05 (
*)
Resultater
MiR-339-5p er nedregulert i menneskelige kolon kreft vev og celler linjer
for å studere uttrykk mønster av MIR-339-5p, undersøkte vi MIR-339-5p mRNA uttrykk i 20 tykktarm kreft vev og deres pair-matchet tilstøtende normale colonic vev ved hjelp av real-time kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) . Som vist i (figur 1A), er MIR-339-5p ofte nedregulert minst todelt i CRC vev (80%) sammenlignet med det i de sammenkoblede tilstøtende ikke-tumorvevet. I tillegg har vi oppdaget uttrykket av MIR-339-5p på seks menneskelige colonic carcinoma cellelinjer (nemlig HCT116, HT29, LS174T, SW480, SW620 og Løvø) av sanntids kvantitativ revers transkriptase-PCR (RT-PCR) og funnet at det er forskjeller i nivåene av MIR-339-5p mRNA også eksisterende blant de seks humane tykktarmkreft cellelinjer. Viktigere var MIR-339-5p nedregulert i kreftcellelinjer SW620 og Løvø med høyere metastatisk abilitity sammenlignet med HCT116, HT29, LS174T, SW480 med lavere cellelinje (figur 1B).
(A) Expression nivåer av MIR-339-5p ble undersøkt ved QRT-PCR i 30 tykktarm kreft vev og deres pair-matchet tilstøtende normale colonic vev. Hver prøve ble analysert i triplikat og normalisert til U6 (* P 0,05). T: tumorvev; N: tilstøtende normalt vev. (B) Expression nivåer moden MIR-339-5p ble oppdaget av QRT-PCR i seks menneskelige colonic carcinoma cellelinjer. Den relative uttrykk for MIR-339-5p ble normalisert til den endogene kontroll U6. Hver prøve ble analysert i triplikat. Den relative MIR-339-5p ekspresjon i tykktarmskreftcellelinjer var mye lavere enn for de tre ikke-kreft i kolon vev (N1, N2, N3 og). (* P 0,05).
Effekt av MIR-339-5p på tykktarmskreftceller vekst, migrasjon og invasjon in vitro
For å evaluere effekten av MIR-339-5p på cellevekst, etablerte vi en SW620 stabil klone å gjenopprette uttrykk for pre-MIR-339 i SW620 kreftceller, som hadde lav endogen MIR-339-5p uttrykk (Figur S1). Og vi testet celleproliferasjon hastighet, cellesyklusfordeling og kolonidannelse. Ved å bruke QRT-PCR, fant vi at uttrykket nivåer av MIR-339-5p ble økt til ca 30 folder i SW620 /pLVTHM-pre-MIR-339 sammenlignet med SW620 /pLVTHM-NC celler (figur 2A). Som vist på fig. 2B, resultatene av CCK8 assay viste at overekspresjon av MIR-339-5p hemmet celleproliferasjon i SW620 kolon kreftcellen. Videre ble kolonidannelse analysen utført for å vurdere den langsiktige effekten av MIR-339-5p på cellevekst. Som vist i figur 2C, SW620 /pLVTHM-pre-MIR-339 celler dannet mye færre kolonier enn SW620 /pLVTHM-NC celler. Statistisk analyse viste at økning av MIR-339-5p trykt kolonien dannelsen av SW620 celler med 34,5% (figur 2C). Vi foreslo at det reduserte spredningen i MIR-339-5p overekspresjon tykktarmskreftceller kan være assosiert med endret cellesyklusprogresjon. Analyse av cellesyklusfordelingen viste at MIR-339-5p overekspresjon SW620-celler ble arreted i G1 fase, med en tilsvarende reduksjon i prosent av S-faser (figur 2D). For å undersøke om MIR-339-5p regulerer CRC celle migrasjon og invasjon, utførte vi en transwell analyse for å fastslå om MIR-339-5p var involvert i bevegelsen av kolon carcinoma kreftceller. Som vist i figur 2E, SW620 /pLVTHM-pre-MIR-339 celler viste svekkelse av trekkfugl og invasiv evne (redusert med 49,6% og 36,5%, henholdsvis P 0,05). Omvendt, etter transfektert med MIR-339-5p inhibitor, ble Mir-339-5p uttrykk nivåer målt i HCT 116 celler (figur 3A). Økt spredning egenskaper HCT116 transfektert med MIR-339-5p inhibitor ble også oppdaget av CCK-8 analysen. Og disse transfekterte celler som er presentert øket proliferative egenskapene sammenlignet med negativ kontroll (figur 3B). Videre analyser cellesyklus angitte reduksjon av celler i G1 fase og tilsvarende økning i celletall S og G2 fasene (figur 3C). Tilsvarende antall trekk og invasive HCT116-celler transfektert med den MIR-339-5p inhibitor var mer enn med kontroll inhibitor, som viser fremmet migrering og invasjon av HCT116-celler ved 72% og 55% (figur 3D). Resultatene viste at Mir-339-5p kan kontrollere tykktarmskreftceller spredning og tykktarmskreft celler mobilitet.
(A) Uttrykket av MIR-339-5p var analyse i SW620 celler infisert med PLVTHM-NC eller pLVTHM Pre-MIR-339 ved QRT-PCR (* P 0,05). (B) Den vitalitet av celler infisert med PLVTHM-NC eller pLVTHM-pre-MIR-339 ble oppdaget ved hjelp av CCK-8 analysen. Verdier ved de angitte tidspunkter ble gitt som gjennomsnitts absorbans med et SD-fem brønner (* P 0,05). (C) Effekt av MIR-339-5p på cellesyklusen SW620 celler. Prosentandelen av celler i G1, S og G2 fasene er vist i panelet til venstre. Og statistisk analyse er også vist i panelet til høyre. (D) Kolonier dannet av PLVTHM-NC eller pLVTHM-pre-MIR-339 smittet SW620 celler ble vist 2 uker etter plating. Høyre panel viste kvantifisering av den relative kolonidannelse i PLVTHM-NC versus pLVTHM-pre-MIR-339-infiserte celler. Verdier er gjennomsnitt ± SD av triplikate eksperimenter (* P 0,05). (E) Transwell analysen ble ansatt for å vurdere migrasjon og invasjon av SW620 celler infisert med PLVTHM-NC eller pLVTHM-pre-MIR-339. Representative felt av migrasjon (øverst) eller invasive (nederst) celler på membran (venstre) (Original forstørrelse: × 200). Gjennomsnittlig antall invasiv eller migrasjonsceller antall per feltet fra tre uavhengige eksperimenter ± standard (* P 0,05).
(A) expresson av MIR-339-5p ble analysen i HCT116-celler transfektert med MIR-339-5p hemmer eller negativ kontroll ved QRT-PCR. (* P 0,05). (B) Den vitaliteten av celler transfektert med MIR-339-5p inhibitor eller negativ kontroll ble detektert ved bruk av CCK-8-analyse. Verdier ved de angitte tidspunkter ble gitt som gjennomsnitts absorbans med et SD-fem brønner (* P 0,05). (C) Effekt av MIR-339-5p på cellesyklus av HCT116-celler. Prosentandelen av celler i G1, S og G2 fasene er vist i panelet til venstre. Og statistisk analyse er også vist i panelet til høyre. (D) Transwell-analyse ble benyttet for å evaluere migrering og invasjon av HCT116-celler transfektert med MIR-339-5p inhibitor eller negativ kontroll. Representative felt av migrasjon (øverst) eller invasive (nederst) celler på membran (Original forstørrelse: × 200). Gjennomsnittlig antall invasive eller migrasjonsceller antall per feltet fra tre uavhengige eksperimenter ± standard (* P 0,05).
PRL-1 er et funksjonelt mål for Mir-339-5p i CRC celler
de miRNA mål spådde ble hentet fra miRBase Targets, TargetScan versjonen 5.0 og PicTar, i skjæringspunktet mellom de tre områdene anbefales at PRL-en var et nedstrøms mål av MIR-339-5p. For ytterligere å bekrefte potensialet forholdet mellom MIR-339-5p og nedstrøms genet PRL-en, vi videre oppdaget PRL-en uttrykksnivået i primær CRC tumorvev i de samme prøvene som nevnt i foregående forsøk ved QRT-PCR (figur S2). Våre resultater viste at noe reduksjon i PRL-1-ekspresjon i vevsprøver fra nontumorous kolon. Uttrykket av PRL-en ble videre bestemt i colonic carcinoma cellelinjer HCT116, HT29, LS174T, SW480, SW620 og Løvø (Figur 1b). Interessant, fant vi motsatt korrelasjon mellom MIR-339-5p og PRL-en (mRNA nivåer) i colonic carcinoma celler. For å gi enda bekrefte potensialet undertrykkende effekt av MIR-339-5p på PRL-1 uttrykk, transfektert vi pre-MIR-339 til SW620 celler. Resultatet viste at Mir-339-5p trykt PRL-1 mRNA og protein uttrykk i SW620 /pLVTHM-pre-MIR-339 celler sammenlignet med SW620 /pLVTHM-NC celler (P 0,05) (Fig. 4B, fig 4C). Består med det resultat, både mRNA og proteinnivåene av PRL-1 ble oppregulert ble observert i HCT116-celler transfektert med den MIR-339-5p inhibitor sammenlignet med kontrollen inhibitor (P 0,05) (Figur 4B Figur 4C). For å avklare om MIR-339-5p direkte kontakt med 3′-UTR regionen av målgener (PRL-1) har vi utført luciferaserapportørplasmid analyser. Vi fant ut at MIR-339-5p rettet sekvens på nt739-745 av PRL-en 3′-UTR. En reporter plasmid drevet av sv-promoteren, inkludert 519 nt-villtype-3′-UTR av PRL-en ble klonet. Så klonet vi en annen reporter konstruksjon der konservert rettet mot regionen MIR-339-5p innen nt739-745 ble spesielt mutert. Vi cotransfect MIR-339-5p ligner og luciferase reporter konstruksjoner som inneholder villtype (figur 4D) eller mutant (figur 4D) PRL-en 3′-UTR. Luciferaseaktivitet ble dramatisk redusert med omtrent 50% i nærvær av MIR-339-5p sammenlignet med den negative kontroll miRNA (figur 4E). I kontrast, gjorde MIR-339-5p ikke endre aktiviteten til mutant PRL-en luciferase reporter (figur 4E), noe som indikerer MIR-339-5p spesifikt handle på villtype PRL-en 3′-UTR. Vi fant også at hemming av MIR-339-5p oppregulert PRL-1 uttrykk og forbedret p-ERK1 /2 plan. Mens restaurering av ekspresjonen av MIR-339-5p kan hemme ekspresjon av PRL-1 og p-ERK1 /2 (figur 5).
(A) ekspresjon nivåer av PRL-1 ble detektert ved QRT-PCR i seks humane kolon carcinoma-cellelinjer. Den relative ekspresjon av PRL-1 ble normalisert til den endogene kontroll GAPDH. Hver prøve ble analysert i triplikat (* P 0,05). (B) uttrykk for PRL-en var analyse i SW620 celler infisert med PLVTHM-NC eller pLVTHM-pre-MIR-339 ved QRT-PCR (* P 0,05) (til venstre). Ekspresjonen av PRL-1 var analysen i HCT116-celler transfektert med MIR-339-5p inhibitor eller negativ kontroll ved QRT-PCR (* P 0,05) (til høyre). (C) Et uttrykk nivåer av PRL-1 ble detektert ved anvendelse av Western blot. (D) En skjematisk fremstilling av basis paring mellom MIR-339-5p og 3’UTR av PRL-1. Substitusjon av syv på hverandre følgende baser (GTCAAAG til ACAGGGA) ved 3’UTR av PRL-1 for den mutante reporter-konstruksjonen er også vist. (E) Analyse av luciferase-aktivitet. 293 celler og HCT116-celler ble ko-transfektert med psiCHECK ™ -2 luciferase reporter-plasmid inneholdende enten villtype eller mutant PRL-1 3′-UTR (indikert som WT MUT eller på X-aksen), og enten det MIR-339-5p ligner eller NC etterligner. Luciferase-aktiviteten ble analysert 48 timer etter transfeksjon. Renilla luciferase-aktivitet av hver prøve ble normalisert ved ildflueluciferase aktivitet. Y-aksen representerer den relative luciferaseaktivitet. Data ble vist som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter (* P 0,05).
(A) Protein nivåene av ERK1 /2 og fosfor-ERK1 /2 ble påvist ved Western Blot etter transfeksjon i 48 timer. β-tublin ble brukt som lasting kontroll.
MiR-339-5p hemmer tumorvekst in vivo
For å utforske videre rolle MIR-339-5p i tumorvekst vivo, ble SW620 /pLVTHM-pre-MIR-339-celler eller SW620 /pLVTHM celler injisert subkutant til emnet på nakne mus, respektivt, inn i nakne mus. Svulsten vekst på SW620 /pLVTHM-pre-MIR-339 celler var tregere enn for SW620 /pLVTHM celler (Figur 6A). 3 uker etter injeksjonen. SW620 /pLVTHM-pre-MIR-339-celler som dannes mindre svulster enn SW620 /pLVTHM-NC-celler in vivo, og deres gjennomsnittlige volum var ~36.9% av kontrollgruppen på dag 20 (P 0,05) (figur 6B, figur 6C). Representative fotografier av H E farging av primære kreft vev forløp. Disse resultatene indikerer MIR-339-5p har et potensial som en roman tumor suppressor som kan undertrykke tumorvekst (figur 6D).
(A) I det hele tatt, 2 × 10
6 SW620 /pLVTHM-NC og SW620 /pLVTHM-pre-miR339 celler ble uavhengig injisert inn på baksiden av 2 nakne mus. Tumorstørrelsene ble målt ved forskjellige tidspunkter inntil dag 20 når mus ble drept. Gjennomsnittlig størrelse av tumorene per dyr ble plottet (* P E farging av primære kreft vev vises (forstørrelse, × 200)
Diskusjoner
Akkumulerende studier har avdekket microRNAs kunne påvirke tumorvekst, invasjon. , angiogenese og metastase i hematologiske malignances og solide tumorer inkludert tykktarmskreft. I en fersk undersøkelse, har det blitt rapportert at Mir-339-5p kan være unormalt nedregulert i colon-cancer vev ved hjelp av nye mikroRNA screening verktøy.
