Abstract
Laver er symbiotiske organismer som produserer ulike unike kjemikalier som kan brukes til farmasøytiske formål. Med mål om screening nye kreftlegemidler som hemmer kreft cellemotilitet, testet vi den hemmende aktivitet av sju lavarter samlet inn fra de rumenske Karpatene mot migrasjon og invasjon av menneskelige lungekreft celler og videre undersøkt de molekylære mekanismene bak deres anti- metastatisk aktivitet. Blant dem,
Alectoria samentosa
,
Flavocetraria nivalis
,
Alectoria ochroleuca
, og
Usnea florida
viste signifikant hemmende aktivitet mot bevegelighet av menneskelig lungekreftceller . HPLC-resultater viste at usnic syre er den viktigste forbindelse i disse lav, og (+) – usnic syre viste lignende inhibitorisk aktivitet som urent ekstrakt har. Mekanistisk ble β-catenin-mediert TOPFLASH aktivitet og KITENIN-mediert AP-1-aktivitet ble redusert med (+) – usnic syrebehandling på en doseavhengig måte. Den kvantitative real-time PCR data viste at (+) – usnic syre redusert mRNA nivået av CD44, cyclin D1 og c-myc, som er nedstrøms målgener av både β-catenin /LSF og c-jun /AP-1 . Dessuten ble Rac1 og RhoA aktiviteter redusert ved behandling med (+) – usnic syre. Interessant nok ble det observert høyere inhiberende aktivitet for celle invasjon når cellene ble behandlet med (+) – usnic syre og cetuximab. Disse resultatene antydet at (+) – usnic syre kan ha potensiell aktivitet på hemming av kreft cellemetastase, og (+) -. Usnic syre kan brukes for anti-cancerterapi med forskjellige virkningsmekanismer
Citation : Yang Y, Nguyen TT, Jeong MH, Crişan F, Yu YH, Ha HH, et al. (2016) hemmende aktivitet av (+) – Usnic Acid mot ikke-småcellet lungekreft cellemotilitet. PLoS ONE 11 (1): e0146575. doi: 10,1371 /journal.pone.0146575
Redaktør: Frédéric André, Aix-Marseille Universitet, FRANCE
mottatt: 02.09.2015; Godkjent: 18 desember 2015; Publisert: 11 januar 2016
Copyright: © 2016 Yang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Research Foundation of Korea (NRF-2013R1A1A2004677, NRF-2013R1A2A2A07067609, NRF-2015R1A4A1041219 og MRC-2011-0030132) og av Korea National Research Resource Center Program (NRF-2014M3A9B8002115). Denne studien fikk også støtte fra et forskningsstipend finansiert av Sunchon Research Center for Naturmedisin
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Forkortelser: AP-1, aktivator protein-1; EGF, epidermal vekstfaktor; DMSO, dimetylsulfoksyd; HPLC væskekromatografi med høy ytelse; KITENIN, KAI1 COOH-terminal samspill tetraspanin; LSF, lymfoid styrke faktor; PBD, p21-bindende domene; PCR, polymerase kjedereaksjon; RBD, Rho-bindende domene
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall i utviklede land. På grunn av mangelen på effektiv behandling for fremskreden sykdom, er prognosen for lungekreft fremdeles dårlig, med mindre enn 15% overlevende 5 år etter diagnose [1]. Tilstøtende invasjon og fjernmetastaser er de viktigste årsakene til kreft-relaterte dødsfall [2]. Derfor er et søk etter inhibitorer for kreftcelleinvasjon og migrering evne kunne avsløre en ny terapi for behandling av kreft. Selv om urter er blitt anvendt i behandling av cancer i tusenvis av år, de forblir en meget viktig kilde av biologisk aktive produkter. Målet med denne studien var å identifisere potensielle terapeutiske midler for å forbedre overlevelse av pasienter med lungekreft metastase.
laver er symbiotiske organismer som produserer et stort antall bioaktive stoffer over 800 [3], som omfatter mange klasser av forbindelser: aminosyre derivater, sukker alkoholer, alifatiske syrer, -y-, δ- og makrocykliske laktoner, monocykliske aromatiske forbindelser, kinoner, Chromones, xantoner, dibenzofuraner, depsides, depsidones, depsones, terpenoider, steroider, karotenoider [4] og difenyletere [5, 6]. Sakte voksende organismer i lav ressurs habitater produsere høyere nivåer av forsvarskjemikalier [7]. Derfor laver er en kilde til unike kjemiske stoffer hvorav noen har allerede vist seg å være effektiv mot ulike kreft
in vitro
modeller [8]. Her, studien undersøkte den hemmende aktiviteten av syv lavarter samlet inn fra Norsk Karpatene mot migrering og invasjon evne til humane lungekreftceller og videre undersøkt de mulige molekylære mekanismer som ligger under deres anti-metastatisk aktivitet for å identifisere mulige forbindelser for nye anti- metastase agenter.
Materiale og metode
Utarbeidelse av lichen ekstrakter
Lichen eksemplarer brukt i denne studien, hentet fra Romania i 2011, ble identifisert på den koreanske Lichen Research Institute ( KoLRI), Sunchon National University, Korea. Kort, thalli av lichen ble hentet fra Romania i 2011 under ekskursjon i nasjonalparken Calimani (47 ° 07’28.6 «N, 25 ° 13’34.8» E) og naturparken Bucegi (45 ° 20’21.7 «N 25 ° 27’41.4 «E) organisert av Dr. Crişan på Babes-Bolyai universitet, Cluj-Napoca, Romania [9]. Tillatelsen til å samle lichen prøver fra disse stedene ble utstedt av administrasjonen av nasjonalparken Calimani og administrasjonen av naturparken Bucegi, med godkjenning av Kommisjonen for beskyttelse av naturlige monumenter (rumenske Academy). Feltstudiene ikke innebærer noen truede eller vernede arter. Duplikatene ble avsatt i den koreanske Lichen og Allied Bioresource Senter (KOLABIC) i den koreanske Lichen Research Institute (KoLRI), Sunchon National University, Korea. Den tørkede thalli av de laver ble ekstrahert med aceton ved romtemperatur i 48 timer. Acetonet Ekstraktene ble deretter filtrert og tørket i vakuum-rotasjonsfordamper ved 45 ° C. De tørre ekstraktene ble oppløst i dimetylsulfoksyd (DMSO) og 5 mg /ml konsentrasjon (1000 x) for alle forsøkene. Sju rumenske lavarter og deres kupong prøve tallene som brukes i denne studien ble oppført i tabell 1.
Høy ytelse væskekromatografi (HPLC) analyse av lichen materialet
Aceton ekstrakt av lichen thalli ved en konsentrasjon på 5 mg /ml ble underkastet høytrykks-væskekromatografi (HPLC) analyse (LC-20A, Shimadzu, Kyoto, Japan) på en YMC-Pack ODS-A (150 x 3,9 mm ID) reversert-fase-kolonne innehold fullt end-capped C18 materiale (partikkelstørrelse 5 um, porestørrelse 12 nm). Eluering ble utført ved en strømningshastighet på 1 ml /min under de følgende betingelser før påfølgende injeksjon: kolonnetemperatur, 40 ° C; løsningsmiddelsystem, metanol: vann: fosforsyre (80: 20: 1, v /v /v). Analyser ble overvåket av en fotodiode array detektor (SPD-M20A, Shimadzu) med en rekkevidde på 190 ~ 800 nm i løpet av HPLC-kjøringen. Observerte toppene ble skannet mellom 190 og 400 nm. Standarden som brukes for salazinic syre (t
R = 2,27 ± 0,2 min) ble isolert fra lav
Lobaria Pulmonaria
. Usnic syre som brukes i vår studie ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) (329967-5G). Voucher prøvene ble avsatt i herbarium av Lichen Allied Bioresource Centre på den koreanske Lichen Research Institute, Sunchon National University, Sør-Korea.
Væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) og optisk rotasjon analaysis av lav materialet
LC-MS spektra ble registrert på et spektrometer med en electrospray ionisering kilde med Agilent 6460 trippel kvadrupol LC /MS. Verdiene av optisk dreining ble målt ved 25 ° C ved anvendelse av Jasco P-1010 polarimeter med en natrium-lampe, og beskrives som følger: [α] D, T (c (g /100 ml), løsningsmiddel). Spesifikk rotasjon av rent (+) – usnic syre (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) er en fysisk egenskap ved en gitt bølgelengde og temperatur og kan bli sett opp i litteraturen
Cell kultur
humane lungekreftceller, inkludert A549, H460, H1650 og H1975 ble dyrket i RPMI 1640 dyrkningsmedium supplert med 10% føtalt bovint serum, 1% penicillin-streptomycin-løsning under en fuktig 5% CO
2 atmosfære ved 37 ° C.
sårheling assay
A549 celler ble platet ved en tetthet på 2,5 x 10
5-celler /brønn på 6-brønners vevkulturplater (Corning, New York , USA) og dyrket over natten til samløpet. Monolags celler ble skrapet med en pipettespiss for å skape et sår. Cellene ble deretter vasket to ganger med serumfritt RPMI 1640 for å fjerne flytende celler og inkubert i RPMI 1640 dyrkningsmedium supplert med 2% FBS med 5 ug /ml av lav ekstrakt eller 5 uM usnic syre. Fotografier av celler ble tatt ved 0, 24, 48 og 72 timer etter at såret for å måle bredden av såret. For hver prøve ble et gjennomsnitt av fem sår analyser tatt for å bestemme den gjennomsnittlige hastighet av migrasjon ved en gitt konsentrasjon av aceton ekstrakt eller usnic syre. Forsøkene ble gjentatt minst tre ganger.
Invasion assay
bølgen analyser ble utført i Transwell kamre (Corning, New York, USA) med 8 pm porestørrelse polykarbonat-membran som er belagt med 1% gelatin. Celler ble sådd ut i 2 x 10
5-celler /brønn i RPMI 1640 inneholdende 0,2% bovint serumalbumin i det øvre rom av kammeret, med eller uten 5 ug /ml urene lichen ekstrakter. Deretter RPMI1640 medium med 10 pg /ml fibronektin ble tilsatt til det nedre kammer for å tjene som et kjemotaktisk middel. Etter 48-timers inkubering ble cellene i det øvre kammer fiksert med Diff Quik kit (Sysmex, Kobe, Japan). Da cellene inne i kammeret ble mekanisk fjernet fra membranen med en bomullspinne, og cellene fester seg til undersiden av membranen ble farget og tellet under lysmikroskop (5 felt per kammer). Hver invasjon Analysen ble gjentatt i tre uavhengige forsøk. Resultatene er uttrykt som gjennomsnittlig antall celler som migrerer per høyeffekts felt.
Reporter assay
HEK293T-celler ble sådd ut i 24-brønners plater i 12 timer før transfeksjon. Etter transfeksjon av TOPFLASH eller AP-1 reporter plasmid med den respektive aktivator, β-catenin eller KITENIN, ble cellene behandlet med usnic syre i 48 timer og deretter analysert ved bruk av en dual-Luciferase
® rapportøranalysesystemet (Promega, Madison , WI, USA). Den Renilla luciferase reporter plasmid (PRL-TK) ble benyttet som intern kontroll for transfeksjonseffektiviteten. Forsøkene ble utført in triplo, og minst tre resultater fra uavhengige eksperimenter ble inkludert i analysen. Brett endringer ble beregnet ved hjelp av verdiene normalisert til Renilla luciferase aktivitet.
kvantitativ real-time PCR
kvantitativ real-time PCR ble utført som beskrevet tidligere [9]. Kort fortalt ble totalt RNA isolert fra humane lungekreftceller ved hjelp RNAiso Plus (Takara, Otsu, Shiga 520-2193, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner. Total RNA (1 ug) fra hver gruppe av behandlede celler ble konvertert til cDNA ved hjelp av en M-MLV revers transkriptase kit (Invitrogen, Carlsbad, USA) og SYBR grønt (Enzynomics, Seoul, Korea). Primere som brukes for real-time PCR var cyclin D1 (fremover) 5′-ccgtccatgcggaagatc-3 «og (revers) 5′-gaagacctcctcctcgcact-3′; c-myc (fremover) 5»-aatgaaaaggcccccaaggtagttatcc-3 «og (revers) 5′-gtcgtttccgcaacaagtcctcttc-3′; CD44 (fremover) 5»-tgccgctttgcaggtgtat-3 «og (revers) 5′-ggcctccgtccgagaga-3′; GAPDH (fremover) 5»-atcaccatcttccaggagcga-3 «og (revers) 5′-agttgtcatggatgaccttggc-3». Real-time PCR reaksjon og analyse ble utført ved hjelp av CFX (Bio-Rad, Hercules, USA).
Affinity Nedbør av Cellular GTPases
De cellulære Rac1 og Cdc42 aktiviteter ble bestemt ved hjelp av GST-RBD /PBD som tidligere beskrevet [10, 11]. I korthet ble cellene lysert i lyseringsbuffer (50 mM Tris, pH 7,4, 1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoksykolat, 0,1% SDS, 500 mM NaCl, 10 mM MgCl
2, og protease-inhibitor blanding) . Lysatene ble inkubert med GST-RBD /PBD perler ved RT i 1 time. Perlene ble deretter vasket fire ganger med vaskebuffer (50 mM Tris, pH 7,4, 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl
2, og protease-inhibitor blanding). De bundne Rac1 og Cdc42-proteiner ble påvist ved immunblotting ved å bruke et monoklonalt antistoff mot Rac1 (MILLIPORE 05-389) og Cdc42 (SANTA CRUZ SC-87). Den relative aktivitet av hver GTPase ble bestemt ved å kvantifisere hvert bånd av GTP-bundet GTPase og den totale mengden av GTPase ved hjelp av multi Gauge 3,0, og verdiene av de GTP-bundne bånd ble normalisert til verdien av den totale mengden. Alle resultater ble bestemt ved hjelp av tre forskjellige eksponeringer fra minst tre uavhengige eksperimenter.
Resultater
Hemming av A549 cellemotilitet av lichen ekstrakter
Cell migrasjon spiller en avgjørende rolle under kreft metastasering. For å finne den anti-vandrende lav sekundær metabolitt på humane lungekreftceller, sårheling Analysen ble utført blant syv aceton ekstrakter av rumenske lav oppført i tabell 1. Laver produsere unike polyketide sekundære metabolitter inkludert depsides, depsidones, dibenzofuraner og depsones; og disse hydrofobe forbindelser som normalt ble ekstrahert med aceton [12]. Som vist i figur 1A,
Alectoria samentosa
,
Flavocetraria nivalis
,
Alectoria ochroleuca
, og
Usnea florida
hemmet A549 cellemigrasjon ved en konsentrasjon på 5 ug /ml. Lengden mellom kantene av såret på 72 timer med disse kandidatene var betydelig større enn i DMSO-behandlede gruppen, eller det ikke-aktive prøven (
Bryoria capillaris
). Spesielt
F
.
nivalis
viste mer enn 60% inhibitorisk aktivitet sammenlignet med kontrollen (Fig 1A og 1B).
(A-B) Kvantitativ analyse av migrasjonsanalyse av A549 celler behandlet med 5 pg /ml aceton ekstrakter av
Alectoria samentosa
,
Flavocetraria nivalis
,
Alectoria ochroleuca
,
Bryoria capillaris
,
Hypogymnia physodes
,
Usnea florida Hotell og
Evernia divaricata product: (A), og representative bilder av migrasjon analysen av A549 celler behandlet med ekstrakter av
A
.
samentosa
,
F
.
nivalis
,
A
.
ochroleuca
,
U
.
florida Hotell og
B
.
capillaris product: (B). (C-D) invasjon analyse av A549-celler ble behandlet med 5 pg /ml av aceton ekstrakter av
A
.
samentosa
,
F
.
nivalis
,
A
.
ochroleuca
,
U
.
florida Hotell og
B
.
capillaris plakater (C), og kvantitativ analyse av invaderte celletall i hver gruppe (D). Representative bildene ble vist fra tre uavhengige forsøk, n = 3. Data representerer gjennomsnitt ± SEM (Standardfeil av middelverdien). *** P 0,001; NS, ingen signifikant forskjell sammenlignet med 0,01% DMSO-behandlet A549 celler.
Effekten av aceton ekstrakter av
A
.
samentosa
,
F
.
nivalis
,
A
.
ochroleuca
, og
U
.
florida
på A549 celle invasjon ble deretter bestemt ved hjelp av transwell kammer invasjon analysen. Som et resultat, lichen ekstrakter betydelig redusert de invaderte celle tall med så mye som 50% sammenlignet med DMSO eller
B
.
kapillærer
(negativ kontroll) (figur 1C og 1D). Disse funnene viste at aceton ekstrakter av
A
.
samentosa
,
F
.
nivalis
,
A
.
ochroleuca
, og
U
.
florida
hemmet både migrasjon og invasjon evne A549 lungekreftceller.
Usnic syre er den aktive inhibitor fra lavarter
For å identifisere komponentene i aceton ekstrakt av lichen,
A
.
samentosa
,
F
.
nivalis
,
A
.
ochroleuca
, og
U
.
florida
ekstrakter ble kjørt på HPLC. Som vist i figur 2A, ble usnic syre identifisert som den viktigste forbindelse i alle fire av disse kandidatene etter sammenligning med indre standard renset (+) – usnic syre (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA), og disse var i overensstemmelse med forrige rapport (tabell 1) [13-20]. Identiteten til usnic syre og deres optisk status ble analysert ved LC-MS-analyse og optisk aktivitet analyse, henholdsvis (S1-fil). Intensiteten av toppen for den usnic syre i kandidat laver ved en konsentrasjon på 5 mg% /ml ble oppnådd ved å sammenligne med den i topp for ren 5 mg /ml usnic syre. Det er verdt å merke seg at usnic syreinnholdet er høyest i
F
.
nivalis
ekstrakt, noe som kan forklare sin potent hemmende effekt på cellemigrasjon (Fig 2A). Det ble spekulert at (-) – usnic syre har lik eller mer potent inhibitorisk aktivitet på cellemotilitet acetonekstrakt av
A
.
samentosa Hotell og
A
.
ochroleuca
som er kjent for å ha (-) – usnic syre i form av deres delkomponenten [13, 16, 18] viste lik eller mer potent inhibitorisk aktivitet på migrering og invasjon, henholdsvis enn (+) – usnic syre innehold
U
.
florida plakater (figur 1). I vår forrige rapport, viste vi at aceton ekstrakt av lichen
F
.
cucullata Hotell og dens komponent, usnic syre, hemmet tumorigenitet og bevegelighet av kreftceller [9]. I samsvar med dette, (+) – usnic syre i en konsentrasjon på 5 uM inhiberte signifikant migrering og invasjon av A549-celler (figur 2). Ved denne konsentrasjonen ble usnic syre ikke viser cytotoksisitet og /eller inhibere celleformering (IC
50 verdi av usnic syre på A549-celler = 65,3 ± 0,65 uM) [9]. Som vist i figur 2B-2E, inhiberende aktivitet av (+) – er usnic syre ved 5 uM så høy som 50% ved 72 h behandling for migrering og er omkring 40% ved 48 h behandling for invasjon. For å undersøke den hemmende aktiviteten av (+) videre – usnic syre på de andre lungekreftceller, ble invasjon analyse utført ved anvendelse av H1650 og H1975 celler. Som et resultat av (+) – usnic syrebehandling betydelig redusert invaderte celletall på H1650 og H1975-celler ved en konsentrasjon på 5 pM (figur 3A). Den kvantitative analyse viste at inhiberingen var så høy som 40% i begge celler sammenlignet med bærer-behandlede celler (figur 3B). Sammen resultatene viste at (+) – usnic syre har hemmende aktivitet mot celle motilitet av humane lungekreftceller
(A) med høy ytelse væskekromatografi (HPLC) analyse av lav aceton ekstrakter.. Intensiteten av toppen for den usnic syre i ekstraktet ved en konsentrasjon på 5 mg% /ml ble oppnådd ved å sammenligne med den i topp for ren 5 mg /ml usnic syre. (B-C) Migrering analyse av A549-celler ble behandlet med 5 uM av (+) – usnic syre (B), og kvantitativ analyse av sår lengde (C). (D-E) invasjon analyse av A549-celler ble behandlet med 5 uM av (+) – usnic syre (D), og kvantitativ analyse av invaderte celletall i hver gruppe (E). Representative bilder vises fra tre uavhengige forsøk, n = 3. Data representerer gjennomsnitt ± SEM (Standardfeil av middelverdien). *** P 0,001; NS, ingen signifikant forskjell sammenlignet med 0,01% DMSO-behandlede A549-celler
(AB) invasjon analyse av H1650 og H1975-celler behandlet med 5 uM av (+) -. Usnic syre (A), og kvantitativ analyse av invadert celletall i hver cellelinje (B). Representative bilder vises fra tre uavhengige forsøk, n = 3. Data representerer gjennomsnitt ± SEM (Standardfeil av middelverdien). ** P 0,01; *** P 0,001; NS, ingen signifikant forskjell sammenlignet med 0,01% DMSO-behandlet A549 celler
(+) -. Usnic syre reduserer β-catenin-mediert TOPFLASH aktivitet og KITENIN-mediert AP-1 aktivitet
for å undersøke underliggende mekanismer for den hemmende aktiviteten av (+) – usnic syre, utførte vi TOPFLASH og AP-1 reporter-analyser for å vurdere hvorvidt (+) – usnic syre kan modulere β-catenin-mediert og /eller KITENIN-mediert signalise aktivitet. Som vist i figur 4A, (+) – usnic syre redusert betraktelig TOPFLASH aktivitet på 18% ved 1 pM og 37% ved 10 uM. Som for AP-1-aktivitet, ble doseavhengig reduksjon observert fra 0,5 pM, og var nedgangen betydelig, så mye som 50% ved 10 uM. Videre har (+) – usnic syre også redusert betraktelig EGF-aktivert KITENIN-mediert AP-1-aktivitet med 32% ved 1 pM og 41% ved 10 uM (figur 4B). For å kontrollere om nivået av nedstrøms målgener av β-catenin /LSF og c-jun /AP-1 ble påvirket av (+) – usnic syrebehandling, ble utført kvantitativ real-time PCR-analyse. Som vist i figur 5, ble relative uttrykk nivåer av CD44, cyklin D1, og c-myc betydelig redusert ved (+) – usnic syrebehandling i lungekreftceller i forskjellig grad (figur 5A-5D). Disse resultater antyder at (+) – usnic syre viser hemmende aktivitet mot cellemotilitet gjennom modulering av β-catenin-mediert og KITENIN-mediert signalisering aktivitet i lungekreftceller
(A) β-catenin-mediert. transkripsjonen aktivitet av TOPFLASH promoteren ble redusert med (+) – usnic syrebehandling. HEK-293T-celler ble transfektert med β-catenin og TOPFLASH reporter plasmid. Etter 12 timers transfeksjon, ble cellene behandlet med (+) – usnic syre i 48 timer. (B) KITENIN-mediert transkripsjonen aktivitet av AP1-promoteren ble redusert med (+) – usnic syrebehandling. De HEK-293T-celler ble transfektert med KITENIN og AP-1 reporter plasmid. Etter 12 timers transfeksjon, ble cellene behandlet med (+) – usnic syre i 48 timer med eller uten EGF. Eksperimenter ble utført i minst tre uavhengige kulturer, n = 3. Data representerer middelverdi ± S.E.M. (Standardfeil av middelverdien). * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001; NS, ingen signifikant forskjell sammenlignet med 0,01% DMSO-behandlede HEK-293T-celler.
(AD) Kvantitativ analyse av mRNA-nivået av CD44, c-myc, og Cyclin D1 i A549 (A), H1650 (B), H1975 (C), og H460 (D) celler behandlet med 5 uM av (+) – usnic syre. Data representerer gjennomsnitt ± SEM (Standardfeil av middelverdien), n = 3 * p 0,05; *** P 0,001; NS, ingen signifikant forskjell sammenlignet med 0,01% DMSO-behandlede gruppen i hver cellelinje
(+) -. Usnic syre reduserer GTP-Rac1 og -RhoA nivå
aktivitetene til Rac1 og Cdc42 er involvert i mesenkymal måte migrasjon [21, 22]. For å bestemme hvorvidt (+) – usnic syre kan påvirke aktiviteten til disse proteinene i A549-celler, ble GST pull-down-analyser utført ved anvendelse av GST-PBD (p21-bindingsdomene). Som vist i figur 6, (+) – usnic syrebehandling betydelig redusert nivå av GTP-Rac1 med 22% sammenlignet med bærer-behandlede celler (figur 6A). Imidlertid, ingen vesentlig endring i nivået av GTP-Cdc42 ble observert av (+) – usnic syrebehandling (figur 6B). RhoA fremmer junctional formasjon, apikale innsnevring, og reduserer vedheft og cellespredning [23, 24]. For å bestemme hvorvidt (+) – usnic syre kan påvirke aktiviteten av RhoA i A549-celler, ble GST pull-down-analyser utført ved anvendelse av GST-RBD (Rho-bindende domene). Som vist i figur 6C, (+) – usnic syrebehandling betydelig redusert nivå av GTP-RhoA med 40% sammenlignet med bærer-behandlede celler. Samlet utgjør disse resultatene tyder på at (+) -. Usnic syre hemmer cellemotilitet gjennom regulering av Rho GTPases
(AC) Nivåene av GTP-bundet Rac1, Cdc42 og RhoA ble målt i A549 celler behandlet med 5 uM av (+) – usnic syre. GTP-Rac1 og -Cdc42 ble målt ved hjelp av GST-PBD, og GTP-RhoA ble målt ved hjelp av GST-RBD. Den samlede RhoA, Rac1, og Cdc42 ble også vist. De relative aktivitetene av Rac1 (A), Cdc42 (B), og RhoA (C) ble bestemt som beskrevet i Materialer og Metoder. Dataene representerer gjennomsnittet ± SEM (standardfeil av middelverdien), n = 3 ** p 0,01; *** P 0,001; NS, ingen signifikant forskjell sammenlignet med 0,01% DMSO-behandlet A549 celler
(+) -. Usnic syre viser additiv hemmende aktivitet med cetuximab
Cetuximab (Erbitux, C225), monoklonalt antistoff mot epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) brukes som en anti-EGFR-midler for behandling av metastatisk kolon og lungekreft. For å undersøke hvorvidt (+) – usnic syre har terapeutisk relevant med cetuximab ble invasjon analysen utført med forskjellige konsentrasjoner av cetuximab og /eller (+) – usnic syre. Som vist i figur 7, inhiberende aktivitet av cetuximab var ~ 30% ved 1 pg /ml og ~ 40% ved 10 ug /ml på A549-celler, og behandlingen av 5 um (+) – usnic syre viste lignende inhibitorisk aktivitet med 10 ug /ml cetuximab (~ 40% inhibering) på disse cellene. Interessant nok ble det observert høyere inhiberende aktivitet for celle invasjon når cellene ble behandlet med 1 pg /ml cetuximab sammen med 5 uM av (+) – usnic syre (figur 7). Disse resultater antyder at (+) – usnic syre ikke bare kan hemme lungekreft celle motilitet ved alene, men også kan forsterke den terapeutiske aktivitet av cetuximab. Som usnic syre redusert KITENIN-mediert AP-1-aktivitet (figurene 4 og 5) og KITENIN /ErbB4-mediert nedstrøms signal av EGF spiller en av det molekylære grunnlag for utviser resistens mot anti-EGFR-midler [25], tyder disse resultatene på at usnic syren kan ha potensiell gunstig aktivitet i å overvinne den begrensede kliniske effekten av anti-EGFR-terapi
(AB) invasjon analyse av A549 celler behandlet med 5 uM av (+) -. usnic syre og /eller forskjellige konsentrasjoner av cetuximab (A), og kvantitativ analyse av invaderte celletall i hver gruppe (B). Representative bilder vises fra tre uavhengige forsøk, n = 3. Data representerer gjennomsnitt ± SEM (Standardfeil av middelverdien). * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001; NS, ingen signifikant forskjell mellom angitt gruppe.
Diskusjoner
Kreft celle kjøper biologiske funksjoner, inkludert motsette celledød, opprettholde proliferativ signalering, gå utenom vekstdempere, aktivere invasjon og metastasering, og så videre i utviklingen fra tidlig til sene stadier [26, 27], og målretting en av disse acquirements kan grupperes som «kreft». I denne forbindelse våre observasjoner at (+) – usnic syre hemmer migrering og invasjon evne hos lungecancerceller er nye i anticanceraktivitet av (+) – usnic syre. I tillegg viser våre resultater viste at (+) – usnic syre har spesifikke virkningsmekanismer for deres antikreft-aktivitet, og disse er ganske forskjellig fra de foregående litteratur viser cytotoksisitet, en mekanisme av handlinger for anticancer aktivitet av (+) – usnic syre i ulike kreftceller.
Hepatotoksisitet av usnic syre kan begrense sitt potensial medisinsk bruk i kreftbehandling [28]. Men de fleste av hepatotoksisitet i human ble observert når høye doser av usnic syre ble oralt administrert som et kosttilskudd for det formål å vekttap [29-31]. I kreftbehandling, kan levertoksisitet unngås ved å justere dosering, formulering og /eller ruten for medisinering. For eksempel da Silva Santos et al. viste at nano-innkapsling av usnic syre gjør det mulig å opprettholde og forbedre antitumor aktivitet og betydelig redusere hepatotoxicity [32]. Videre har det vist seg at tilskudd av anti-oksidanter, dvs. vitamin E, sammen med usnic syre kan i stor grad redusere den usnic syre-indusert levertoksisitet i primære dyrkede hepatocytter mus [33]. Det bør også bemerkes at noen av de papirer som viser hepatotoksisitet ble gjennomført på HepG2-celler, har sin opprinnelse fra leverkreft vev på 15 år hann unge [34, 35]. I vår tidligere papir [9], demonstrerte vi at usnic syre har en eller annen måte selektiv cytotoksisitet i kreftceller i forhold til normale celler. I alternativ vinkler, alvorlig cytotoksisitet av usnic syre på HepG2 celler reflekterer selektiv og spesifikk anticancer aktivitet av usnic syre på leverkreft hos testede konsentrasjoner.
I vår forrige rapport, ble det vist at cytotoksisiteten til usnic syre er spesifikke for kreftceller som HT29 (kolorektal kreft celler, IC
50 = 95,2 ± 0,85 mm), AGS (magekreftcelle, IC
50 = 15,01 ± 0,52 mm), A549 (kreft celle lunge, IC
50 = 65,3 ± 0,65 uM), og CWR22Rv-1 (prostatakreftceller; IC
50 = 24,1 ± 0,63 uM), mens ikke-cancerceller som MDCK (Mardin-Darby kaninnyre, IC
50 = 133,04 ± 3,5 mm), RIE (rotte intestinal epitelceller, IC
50 = 126 ± 4,25 mm), NIH 3T3 (mus embryonale fibroblast, IC
50 = 164,2 ± 3,7 mm), og HaCaT ( human keratinocyte; IC
50 = 185,7 ± 4,8 mm) celler, ble ikke alvorlig skadet [9]. Gitt at den gjennomsnittlige sirkulerende blodvolum for mus er 72 ml /kg [36] og molekylvekten av usnic syre er 344, LD
50 verdi av usnic syre (mus-oral, 838 mg /kg) i SDB ark usnic syre kan beregnes til 33,8 mM. Som inhiberende aktivitet av usnic syre ved inhibering av lungekreft cellemotilitet er observert ved konsentrasjoner på 5 pM, våre resultater indikerte at usnic syre ville bli brukt til anti-metastasering middel med liten toksisitet ved arbeidskonsentrasjoner.
Usnic syre har en lav grad av vannløselighet, noe som er en hindring i utvikling av legemidler som det er sannsynlig å resultere i dårlig biotilgjengelighet. For å unngå dette problemet, kan det anvendes forskjellige tilnærminger bli gjort for forbedring av løseligheten med sin egen forbindelse med partikkelstørrelsesreduksjon, krystall engineering, saltdannelse, fast dispersjon, bruk av overflateaktivt middel, kompleksering, og så videre [37]. Valget av den forbedring fremgangsmåten bør bestemmes for hver enkelt medikament i nødvendige dosering form egenskaper. For usnic syre, nylig artikkel rapporterte at kaliumsaltet av usnic syre (kalium usnate) har 100% løselighet uten å miste sin biologiske aktivitet ved 10 ug /ml (ca. 26 um) [38]. Sammen med de fakta som (+) og (-) enantiomere former av usnic syre viste moderat til sterke biologiske aktiviteter [39, 40], videre studier er nødvendig for å vurdere potensialet medisinske bruk av usnic syre i anticancerterapi i forskjellige cancere
Hjelpemiddel Informasjon
S1 fil. LC-MS-analyse (figur A i S1 File) og optisk aktivitet analyse (Figur B i S1-fil) av prøver som brukes i denne studien
doi:. 10,1371 /journal.pone.0146575.s001 product: (PDF)
