Abstract
rabdomyosakrom er den hyppigste mykvevssarkom hos barn og ungdom, med en høy grad av tilbakefall som dramatisk påvirker det kliniske resultatet. Multiagent kjemoterapi, i kombinasjon med kirurgi og /eller strålebehandling, er behandling av valget. Imidlertid er tilbakefall skuffende høy og identifisering av nye terapeutiske verktøy er stort behov for. Under denne sammenheng, den selektive blokk av sentrale funksjoner i kreft stamceller (CSC) vises særlig lovende. I denne studien isolert vi rabdomyosakrom CSC med stilk-lignende funksjoner (høy uttrykk for Nanog og OCT3 /4, selvfornyelse evne, multipotency). Rhabdomyosarkom CSC viste høyere invasive egenskaper og en redusert cytotoksisitet til doksorubicin i forhold til naturlige celler, gjennom en mekanisme som ikke er relatert til den klassiske multimedikamentresistens prosess. Dette var avhengig av et høyt nivå av lysosomet surhet mediert av en høy ekspresjon av vacuolar ATPase (V-ATPase). Siden det ikke var forbundet med andre barnekreftformer, som Ewing sarkom og nevroblastom, V-ATPase høyere uttrykk i CSC var rabdomyosakrom bestemt. Inhibering av lysosomal surgjøring av den V-ATPase-inhibitoren omeprazol, eller ved spesifikk siRNA stanse, betydelig forbedret doksorubicin cytotoksisitet. Uventet, lysosomal målretting også blokkerte cellevekst og redusert invasiv potensialet av rhabdomyosarkom CSC, selv ved svært lave doser av omeprazol (10 og 50 uM, henholdsvis). Basert på disse observasjonene foreslår lysosomet surhet som et verdifullt mål for å forbedre kjemosensitivitet av rhabdomyosarkom CSC, og foreslår bruk av anti-v-ATPase-midler i kombinasjon med vanlige regimer som et lovende verktøy for utrydding av minimal restsykdom eller forebyggelse av metastatisk sykdom
Citation. Salerno M, Avnet S, Bonuccelli G, Hosogi S, Granchi D, Baldini N (2014) Nedskrivning av lysosomal aktivitet som en terapeutisk modalitet Targeting kreftstamceller av Embryonalt rabdomyosakrom cellelinje RD . PLoS ONE 9 (10): e110340. doi: 10,1371 /journal.pone.0110340
Redaktør: Adriano Angelucci, University of L’Aquila, Italia
mottatt: 02.05.2014; Godkjent: 21 september 2014; Publisert: 20 oktober 2014
Copyright: © 2014 Salerno et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en FIRB stipend (RBAP10447J til N.B.) fra den italienske utdanningsdepartementet, Universitet og forskning; fra den italienske foreningen for Cancer Research (AIRC 11426 til N.B.); og av den italienske Ministry of Health, økonomisk støtte for Scientific Research «5 promille 2010». Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
rabdomyosakrom (RMS) er den hyppigste solid tumor i barndommen, histologisk med ulike mønstre av tverrstripet muskel differensiering og preget av en svært aggressiv klinisk oppførsel [1]. Selv om utfallet av RMS pasienter har betydelig forbedret i løpet av de siste to tiårene basert på bruk av kirurgi og /eller strålebehandling i kombinasjon med kjemoterapi, tilbakefall forekommer fortsatt i 30-40% av ikke-meta pasientene. Videre er omtrent 15% av barn med RMS viser tegn på systemisk sykdom ved tidspunktet for diagnose. Disse «høy risiko» fag har begrenset behandlingstilbud og en dårlig prognose [2], derav det presserende behovet for å identifisere nye behandlingsformer basert på en grundig kjennskap til RMS biologi.
En økende mengde bevis tyder på at utilstrekkelighet av aktuelle anticancerbehandlinger for å utrydde minimal restsykdom og forhindre tilbakefall delvis avhenger av deres manglende evne til å målrette den undergruppe av hvilende eller lavt-prolifererende tumorceller, kjent som kreft stamceller (CSC) [3]. CSC ble først identifisert i leukemier [4] og senere beskrevet i flere faste tumorer [5], [6], [7], inkludert sarkomer [8], [9], [10], [11], [12]. Det er generelt akseptert at CSC effektivt initiere svulster, vise stilk-lignende egenskaper, og er ansvarlig for lokal og systemisk tilbakefall på grunn av manglende respons på cytostatika [3]. Et forhold mellom CSC og minimal restsykdom har blitt rapportert [13], sterkt tyder på at målretting disse cellene vil ha et betydelig potensial for å forbedre resultatet av pasienter behandlet med konvensjonelle anticancermidler. Faktisk, CSC-lignende kjemoresistent elementer har allerede også blitt identifisert i RMS [14], [15].
Microenvironmental betingelser er i stand til i betydelig grad å modulere den stemness fenotypen under fysiologiske betingelser, så vel som i kreft. Spesielt i CSC nisje, tumorceller svare på hypoksi ved å konvertere fra aerob respirasjon til glykolyse, noe som i sin tur produserer melkesyre og forårsaker lokal acidose. Tilstedeværelsen av slike særegne microenvironmental egenskaper har vært relatert til induksjon og vedlikehold av multipotency og stemness [16]. Ekstracellulære acidose er derfor en stor aktør i dannelsen og vedlikeholdet av CSC, fordi, per se, er i stand til å fremme en stilk-lignende fenotype. Det er allerede kjent at maligne tumorer, inkludert sarkomer, er kjennetegnet ved et ekstracellulært surt miljø og at kreftceller inneholder vanligvis en betydelig mengde av sure lysosomer. Disse funksjonene er i tråd med flere funksjoner malignitet, inkludert invasivitet og motstand mot kreft terapier [17]. Faktisk, er akkumulering av basiske medikamenter i sure vesikler, eller deres nøytralisering ved surgjøring av det ekstracellulære miljø en effektiv mekanisme for chemoresistance og kan legge til rette for tumor invasjon [18], [19]. . Av denne grunn er det CSC oppførsel påvirkes av biokjemiske og biofysiske variabler av den ekstracellulære avdeling
I denne studien utforsket vi rollen til lysosomet surgjøring, holdt oppe av den vacuolar (H +) – ATPase (V-ATPase ) protonpumpe som en særegen mekanisme overdragelse en selektiv fordel til RMS CSC. Vi viste at V-ATPase er involvert i invasivitet så vel som i kjemosensitivitet av disse cellene, og at slike funksjoner av malignitet kan være fullstendig reversert ved blokkering av surgjøring prosessen ved terapeutiske doser av protonpumpeinhibitorer (PPI), noe som antyder den potensielle fordel av denne klassen legemidler i kombinasjon med konvensjonelle legemidler mot kreft effektivt å målrette RMS CSC.
Materialer og metoder
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP
RD (RMS), MG-63 (osteosarkom ), SK-ES-1, A-673 (Ewings sarkom, ES), SH-SY5Y, NB-100, og CHP-212 (neuroblastom, NB) cellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC) og dyrket i IMDM (Life Technologies), og 20 U /ml penicillin, 100 mg /ml streptomycin og 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS) (komplett medium). Multilegemiddelresistente MG-63-celler ble isolert ved trinnvis eksponering for økende doser av doxorubicin (DXR). Den resulterende MG-63-cellelinjen som har vokst eksponentielt i nærvær av 100 ng /ml DXR ble betegnet som multimedikament resistent variant MG-63-DXR100. MG-63-DXR100 ble kontinuerlig utsatt for 100 ng /ml DXR for å opprettholde den multimedikamentresistent fenotype [20].
Sphere kulturer
Sphere dannende celler ble oppnådd som tidligere beskrevet [12 ]. I korthet ble alle cellene ble dyrket i forankringsuavhengig tilstander i DMEM: F12-medium med progesteron (20 nM), putresceine (10 mg /ml), natriumselenitt (30 nM), apo-transferrin (100 ug /ml), og insulin (25 ug /ml) (Sigma-Aldrich) i lav-feste kolber (Nunc). Frisk human epidermal vekstfaktor (20 ng /ml) og basisk fibroblast vekstfaktor (10 ng /ml) (Peprotech) ble tilsatt to ganger i uken inntil cellene begynte å vokse danne flytende aggregater, kalt rhabdospheres. Kulturer ble ekspandert ved mekanisk dissosiasjon av kuler, etterfulgt av re-plettering av celler og gjenværende celleaggregater i komplett medium. Bare kulturer stand til vekst under spherogenic kolonier og vise stamcellerelaterte funksjoner ble vurdert. Kulene ble analysert under serum-sultet medium på lave feste underlag (ikke vedheftende tilstand) eller tilhenger tilstand i nærvær av serum, avhengig av analysen. Alle de isolerte kuler ble karakterisert for ekspresjon av stamcellerelaterte markører (Nanog og OCT3 /4) og, kun for RMS CSC, for tjeneste formingseffektiviteten og multipotency.
karakterisering av stamcelle egenskaper av rhabdospheres
sfære dannende effektivitet i løpet av seriepassasjer ble undersøkt ved utsåing av enkeltceller fra rhabdospheres ved en tetthet på 2000 celler /ml i en 48-brønners plate for å skaffe nye kuler. Det totale antall tumor sfærer ble tellet, og kulene dissosiert for å oppnå den andre og tredje generasjon av kuler. For å evaluere multipotency ble rhabdospheres opprettholdt som heft kulturer for 3 dager og deretter seedet i forskjellige forhold. I korthet, for osteogene differensiering, ble 100.000 celler sådd ut i 6-brønns plater og dyrket i α-MEM supplert med 10% FBS, 10 mM β-glycerofosfat, 10
-8 M deksametason og 50 mg /ml L-ascorbinsyre -2-fosfat (Sigma). Etter 14 dager ble cellene fiksert med 3,7% paraformaldehyd, og mineralisering ble evaluert ved farging med 1% Alizarin Red S (pH 4,2; Sigma-Aldrich). For adipogenic differensiering, ble 100.000 celler sådd ut i en 6-brønns plate og dyrket i DMEM høy glukose (Lonza) supplert med 10% FBS, 0,5 uM deksametason, 0,5 mM 3-isobutyl-1-metylxantin, og 50 uM indomethacine (Sigma- Aldrich). Etter 17 dager ble cellene fiksert og lipider farget med 0,3% Oil-Red-O. For chondrogenic differensiering, ble 500.000 celler sentrifugert i et 15 ml polypropylen-konisk rør og inkubert i DMEM høy glukose supplert med 10% FBS, 10 mg /ml TGFβ1 (Peprotech), 100 uM L-askorbinsyre 2-fosfat, 6,25 ug /mL insulin, 40 ug /ml L-prolin (Sigma-Aldrich). Etter 3 uker, ble deler avledet fra chondrogenic pellets farget med Alcian Blå (pH 2,5).
Gene uttrykk
Gene uttrykk ble undersøkt for å fastslå stamcellerelaterte funksjoner og ytterligere karakterisere sfære kulturer . Total RNA ble isolert fra RMS, ES, og NB flytende kuler eller innfødte celler med NucleoSpin RNA II (MACHEREY-NAGEL) og revers transkribert. Uttrykket av mRNA for OCT3 /4 (NM_002701.4), Nanog (NM_024865.2), MDR1 (AF016535.1), ATPase V
0 ° C (NM_001101.2), matriksmetalloproteinase (MMP) 9 (NM_004994.2 ), og CXC chemokine reseptor-4 (CXCR4) (NM_001008540.1) ble evaluert med en lys sykler instrument (Roche Diagnostics), forsterke en mikrogram av cDNA, og Universal Probe Library (Roche Applied Science). Prober og primere ble valgt ved hjelp av web-baserte analysen design software (ProbeFinder https://www.roche-applied-science.com): OCT3 /4-f 5′-CTTCGCAAGCCCTCATTTC-3′; OCT3 /4-r 5′-GAGAAGGCGAAATCCGAAG-3 «; Nanog-f 5»-ATGCCTCACACGGAGACTGT-3 «; Nanog-r 5»-AGGGCTGTCCTGAATAAGCA-3 «; MDR1-f 5»-GCCATCAGTCCTGTTCTTGG-3 «; MDR1-r 5»-GCTTTTGCATACGCTAAGAGTTC-3 «; ATPase V
0 c-f 5′-TTCGTTTTTCGCCGTCAT-3 «; ATPaseV
0 c-r 5′-CCACTGGGATGATGGACTTC-3 «; MMP9-f 5»-GAACCAATCTCACCGACAGG-3 «; MMP9-r 5»-GCCACCCGAGTGTAACCATA-3 «. Resultatene ble uttrykt som forholdet mellom genet av interesse og Tata bindende protein (TBP, NM_003194.4; TBP-f 5»-TTGGGTTTTCCAGCTAAGTTCT-3 «, TBP-r 5′-CCAGGAAATAACTCTGGCTCA-3») som referanse-gen i henhold til 2
-ΔΔCT metoden [21].
Western blotting
Western blotting ble utført for å oppdage stamcellerelaterte markører OCT3 /4 og Nanog samt MDR1, ATPase V
0A1 subenhet, og TBP. Flytende sfære eller naturlige celler ble lysated med varm lyseringsbuffer (1% SDS, Tris pH 7,4 20 mM, 5% β-merkaptoetanol) for analyse av OCT3 /4 og Nanog, eller med RIPA-buffer (Tris pH 7,6 50 mM NaCl 150 mM, Triton-X-100 5%, natriumdeoksycholat 0,25%, EGTA pH 8 1 mM NaF 1 mM, Sigma) supplementert med proteasehemmere (Roche), for de andre proteiner. Like mengder protein lysatene ble utsatt for reduksjon av SDS-PAGE på en polyakrylamid gel, etterfulgt av å immunoblotting analyse. Blotter ble undersøkt med en sau anti-OCT3 /4 (Abcam), en mus anti-Nanog (Abcam), en mus anti-MDR1 (D-11, Santa Cruz), en kanin anti-ATPase V
0A1 (Abcam ), eller en kanin anti-TBP (Santa Cruz) som referanse. Inkubasjon med pepperrot-peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer fulgt. Reaksjonen ble avslørt av en chemiluminescence substrat (Pierce ECL Plus Western Blotting Underlag, Thermo Scientific). Immunoblotanalyse analyser ble gjentatt tre ganger. Signalet fra hvert band ble kvantifisert ved en dedikert programvare for densitometrisk evaluering (VisionWorksLS Analysis Software, Biospectrum, UVP).
immunfluorescens
For farging av V-ATPase, ble rhabdospheres lov til å følge i 24 timer i komplett medium og fast, deretter inkubert med et anti-v-ATPase V
0A1 polyklonalt antistoff (Sigma-Aldrich), etterfulgt av en sekundær anti-kanin-antistoff Alexa grønn 488 nm (Life Technologies). Å observere vesikulær lokalisering av V-ATPase, aktin cytoskjelettet var co-farget bruker 0,5 mikrogram /ml Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC) fluorescerende fargestoff (Sigma). Kjerner ble kontra med Hoechst 33258 (Sigma), og cellene ble observert av konfokal mikroskopi (Nikon TI-E).
Migrasjon analysen
migrasjon evne rhabdospheres ble evaluert av Boyden kammeret teknikk i forhold til RD. I korte trekk ble enkeltceller avledet fra RD eller rhabdospheres etter trypsinering suspendert i serumfritt medium inneholdende 0,1% bovint serumalbumin (BSA) og sådd ut i det øvre kammeret av en Boyden kammer (8-um pore, Euroclone). De nedre kammer inneholdt 10% FBS i IMDM medium som en cellegift-tiltrekkende. Celler ble inkubert ved 37 ° C og tillatt å migrere i 8 timer. Celler som er festet til den øvre overflaten av filteret ble mekanisk fjernet ved skrubbing med bomullspinner. Chambers ble farget i 0,5% krystallfiolett fortynnet i 100% metanol i 30 minutter, skylles i vann og undersøkt under lys-felt mikroskopi. Verdier for migrering ble oppnådd ved å telle 5 felt per membran (X20 objektiv) og representerer gjennomsnittet av fire uavhengige eksperimenter.
Invasion assay
MMP-aktivitet ble kvantifisert som tidligere beskrevet [22]. I korte trekk ble celler fra rhabdospheres og RD utsådd i 6-brønners plater (300,000 celler /brønn) og fikk følge. Etter 48 timer ble cellene vasket og inkubert ved 37 ° C med 400 ul av fosfatbufret saltvann (PBS) i 3 timer. PBS ble deretter oppsamlet, sentrifugert og supernatanten ble benyttet for analysen. Like mengder av supernatanten ble tilsatt til 100 ul av gelatin quenching (DQ Gelatin, Life Technologies) i en 96-brønns plate. Adherente celler ble løsnet og tellet. Etter 24 timer ved 37 ° C, ble fluorescensemisjonen målt med en mikroplateleser (Tecan). Resultatene ble rapportert som den prosentandelen av fluorescensemisjon med hensyn til acellulær supernatant og normalisert med det totale antall celler. Forsøket ble gjentatt tre ganger.
Strømningscytometri
Rhabdosphere celler og RD ble dissosiert av trypsin, telles og farget som følger. For kvantifisering av CD133 ekspresjon, ble cellesuspensjoner inkubert med monoklonalt CD133 /1-antistoff (AC133, Miltenyi Biotec) i 10 minutter, etterfulgt av 20 minutters inkubasjon med anti-geit-antistoff Alexa grønn 488 nm (Life Technologies) ved 4 ° C. For evaluering av CXCR4 innhold, ble cellesuspensjoner farget med monoklonalt CD184 (CXCR4) -PE (Miltenyi Biotec) i 10 min ved 4 ° C. Etter farging ble cellene deretter resuspendert i PBS og analysert ved hjelp av en Coulter EPICS XL Flowcytometer (Coulter Corporation, Beckman Coulter). Forsøkene ble gjentatt tre ganger.
Drug følsomhet analysen
Rhabdosphere celler og RD ble belagt i 6-brønners plater (200000 /brønn) og lov til å følge. Etter 24 timer ble cellene inkubert med DXR (10, 50, og 100 ng /ml; Sigma), eller cisplatin (5, 10 og 100 uM, Sigma), og etter ytterligere 72 timer ble antall levedyktige celler ble bestemt ved trypan blått fargestoff eksklusjon analysen. Prosentandelen av veksthemming ble beregnet i forhold til ubehandlede celler. Stoffet halvparten av maksimal effektiv konsentrasjon (EC
50) for hver cellelinje ble beregnet ved lineær regresjon metode. Forsøket ble gjentatt to ganger.
DXR opptak
Rhabdosphere celler og RD ble sådd på åtte-brønns glass chamberslides og lov til å følge. Cellene ble deretter eksponert for DXR (10 ug /ml) i 15 minutter, vasket og direkte observert ved konfokal mikroskopi. Nivået av atom DXR ble kvantifisert i minst 100 celler enn ulike felt ved hjelp av NIS-Elements mikroskop bildebehandling (Nikon).
lysosome surhet evaluering
Utslipps spektrum av pH-sensitive akridin orange (AO) ble anvendt for å måle pH-variasjoner i sure organeller [23], [24]. Rhabdosphere celler og RD ble sådd ut i 6-brønns plater og tillatt å holde seg i 24 timer i komplett medium. Cellene ble deretter eksponert for AO (1 ug /mL) i 10 minutter, vasket og direkte observert ved spektral konfokal mikroskopi. For å karakterisere profilen til AO emisjonsspektra, ble det røde båndet bidraget (R%) i hele emisjonsspektrum, beregnet som følger: R% = 100
I
655 /(
I
655 /
i
530) der
i
655 og
i
530 er den grønne (520-540 nm ) og den røde (645-665 nm) integrert utslippsintensitet, henholdsvis. Den gjennomsnittlige R% ble beregnet for alle de sure organeller i 10 celler. Forsøket ble gjentatt to ganger.
cytosolisk pH-måling
cytosolisk pH (PHC) av rhabdosphere celler og RD ble målt ved hjelp av karboksy-seminaphthorhodafluor-1 (karboksy-snarf-1) (Molecular Probes ). Celler ble sådd ut i kammers objektglass og tillatt å holde seg i 24 timer, og deretter ble 10 uM av karboksy-snarf-1 ble tilsatt til kulturmediet i 30 minutter. Kammerobjektglass ble plassert på fasen av det konfokale mikroskop og tillatt å tilpasse seg i minst 20 minutter før oppstart PHC målinger. Eksitasjon laserstrålen fra 514 nm (Arlaser) var rettet mot prøven via S Plan Fluor EL WD 40X objektiv (Nikon). Den resulterende fluorescensemisjon ble oppsamlet ved 644 nm og 594 nm. Flere regioner av interesse (ROI) med en diameter på 1 um ble deretter tilfeldig valgt unntatt atom regioner. Den emisjonsforholdet ble kalibrert ved bruk av oppløsninger (110 mM KCl, 25 mM KHCO
3, 11 mM glukose, 1 mM MgCl
2, 1 mM CaCl
2, 10 mM HEPES) med varierende pH-verdier og innehold 10 mm nigericin (K + /H + ionofor). Fluorescens-emisjonsforholdet (644 nm /594 nm) ble beregnet og anvendt for å estimere PHC fra kalibreringskurven. Forsøket ble gjentatt tre ganger.
Vekst analyser etter lysosome målretting
For å svekke lysosome funksjon, rhabdosphere celler og RD ble behandlet ved hjelp av to ulike strategier. For det første, ble cellene sådd ut i 6-brønns plater (200 000 /brønn), tillates å følge i 24 timer i komplett medium, og deretter behandlet med AO (0,1, 0,5, og 1 ug /ml; Sigma) som selektivt akkumuleres i sure lysosomer og påvirke veksten av kreft celler [25]. Etter 72 timer ble antall levedyktige celler bedømt ved fargestoffeksklusjonsanalysen. Forsøket ble gjentatt to ganger. Den andre strategien ble vurdert ved hjelp av PPI omeprazol (OME), et stoff som er kjent for å hemme V-ATPase-aktivitet [26]. Celleviabilitet etter OME behandling ble bestemt ved hjelp av to ulike analyser. a) For de indirekte analyse, rhabdospheres og RD, eller celler representative for ES eller NB histotype, ble sådd i 96-brønners plater (8000 celler /brønn) og lov til å følge. Etter 24 timer ble mediet skiftet med ikke-bufret RPMI med 10% FBS og behandlet med 10, 25, 50 og 100 uM av OME (Sigma-Aldrich). Etter 24, bare for rhabdomyosarcoma-celler, og 72 timer for RMS, ES og NB-celler, ble levedyktigheten evaluert ved en sur fosfatase (AP) assay. I korthet ble cellene vasket og inkubert ved 37 ° C med 100 ul buffer inneholdende 0,1 M natriumacetat (pH 5,0), 0,1% Triton X-100, og 5 mM p-nitrophenil fosfat. Etter 3 timer ble reaksjonen stanset ved tilsetning av 10 pl av 1 N NaOH, og fargeutviklingen ble målt ved 405 nm ved anvendelse av en mikroplateleser (Tecan) [23]. b) For de direkte analyse, rhabdospheres og RD ble sådd i 6-brønners plater og lov til å følge. Etter 24 timer ble 50 uM OME tilsatt til kulturmediet. Etter ytterligere 24 timer ble antall levedyktige celler bestemt ved fargestoffeksklusjonsanalysen. Forsøket ble gjentatt to ganger.
apoptose analyse
Rhabdosphere Cellene fikk følge etter 24 timer i fullstendig medium og utsatt for 50 M av OME i bufret RPMI med 10% FBS. Etter 24 og 48 timer ble cellene merket med Hoechst 33258 og tilstedeværelse av apoptotiske legemer ble påvist i henhold til fluorescens mikroskopi.
cellesyklusanalyse
Rhabdospheres ble eksponert for 100 uM av OME i ikke vedheftende betingelser ved pH 6,8 i 24 timer. DNA-innhold og bromdeoksyuridin (BrdU) inkorporering i S-fase ble bestemt ved samtidig analyse av propidiumjodid (PI) for det totale DNA-innhold og av FITC-konjugert anti-BrdU fluorescens. I korthet ble cellene inkubert med 40 pM 5-BrdU (Sigma) i 60 minutter ved 37 ° C, vasket og deretter 5 x 10
6 enkle celler ble fiksert med 75% etanol i 20 minutter ved 4 ° C. Delvis DNA-denaturering ble utført ved å inkubere celler i HCl, etterfulgt av nøytralisering med Na-tetraborat. Prøvene ble deretter inkubert med et muse-monoklonalt anti-BrdU-FITC-antistoff (BD Biosciences), vasket, farget med 2,5 pg /ml PI (Sigma-Aldrich), og analysert. Monoparametric og biparametric analysene ble utført ved hjelp av WinMDI 2.7-programvaren. Forsøket ble gjentatt to ganger.
Effekter av DXR på celle levedyktighet etter OME behandling
Rhabdosphere celler la til å følge i 24 timer i komplett medium. Cellene ble deretter forbehandlet med 10, 25, 50 og 100 uM av OME i ikke-bufret RPMI med 10% FBS. Etter ytterligere 24 timer ble cellene eksponert for 50 og 25 ng /ml DXR i bufret medium. Etter ytterligere 48 timer ble cellelevedyktigheten bestemt ved AP-analysen, som beskrevet tidligere. Data ble rapportert som celle overlevelse i forhold til ubehandlede celler (sett = 100%). Forsøket ble utført i fire eksemplarer.
DXR opptak etter OME behandling
Rhabdosphere celler la til å følge i 24 timer i komplett medium. Cellene ble deretter forbehandlet med 10 og 20 uM av OME i ikke-bufret RPMI med 0,1% FBS i 1 time, og deretter eksponert for 5 ug /ml DXR i 15 min. Nivået av atom DXR ble kvantifisert i minst 100 celler over forskjellige felter, som tidligere beskrevet, og sammenlignet med ubehandlede celler. Forsøket ble gjentatt to ganger.
siRNA transfeksjon
Spesifikk gen tie effekt ble oppnådd ved å siRNA-teknologi i forbindelse med pipette-type elektroporering. Kort fortalt ble rhabdosphere cellene trypsinert og 100 mL av cellesuspensjon som inneholder 2.000.000 celler og 1,6 nmol av spesifikke siRNA (ON-TARGETplus Menneskelig ATP6V0C siRNA Smart basseng, Dharmacon, Thermo Scientific) eller kontroll siRNA (siRNA CTR, ON-TARGETplus Ikke- målretting kontroll Pool, Dharmacon) eller vann (ingen siRNA) ble overført til en 1 mm kyvette (Neon Transfeksjon System, Life Technologies). Elektroporerte celler ble sådd i 6-brønns plater (500,000 celler /brønn) for RNA isolering, og i en 96-brønners plate for vekstanalyse (15.000 celler /brønn). Etter 24 timer ble reduksjon av mRNA nivå for V
0 c ATPase verifisert av Real Time PCR, som tidligere beskrevet. For vekstanalyse ble cellene eksponert for 25 ng /ml DXR i bufret medium og inkubert i ytterligere 48 timer. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved AP indirekte analyse, som beskrevet tidligere. Resultatene ble rapportert som prosent celleoverlevelse
vs
kontrollcellene (ingen siRNA). Forsøket ble gjentatt to ganger.
Inhibering av rhabdosphere celle migrasjon av OME
Rhabdospheres ble dissosiert og sådd ut i 6-brønns plater la å følge i 24 timer i komplett medium. For å evaluere evnen migrasjon, ble cellene deretter forbehandlet med 50 uM av OME i ikke-bufret RPMI med 10% FBS. Etter 24 timer ble levedyktige celler tellet, og deretter et tilsvarende antall ubehandlede eller OME-behandlede celler ble sådd inn i det øvre kammer av den Boyden kammer, som tidligere beskrevet. Forsøket ble gjentatt to ganger.
Hemming av rhabdosphere celle invasiv potensial ved OME
For å evaluere invasiv potensial, rhabdosphere celler ble utleid til følge i 24 timer i fullstendig medium og deretter forbehandlet med 50 uM av OME i ikke-bufret RPMI med 0,1% FBS i 3 timer. Frigjøringen av MMP’er i supernatanten ble kvantifisert ved gelatin bråkjøling assay, som beskrevet tidligere, og normalisert med det totale antall levedyktige celler. For å evaluere virkningen på CXCR4-uttrykkende populasjon, ble rhabdospheres sådd i sfære dannende tilstand ved pH 6,8 og forbehandlet med 100 uM av OME. Etter 48 timer ble cellene underkastet levedyktig telling og CXCR4-positive fraksjon i bestanden av levende celler (valgt av forover- og sidespredningsparametere) ble evaluert ved flow-cytometri, som tidligere beskrevet. Eksperimentene ble gjentatt to ganger.
Statistisk analyse
På grunn av det lille antall observasjoner, data ble betraktet som ikke normalt fordelt. Verdier ble uttrykt som betyr ± SE. Statistisk analyse ble utført med Statview 5.0.1 programvare (SAS Institute Inc., Cary, NC). Den parametriske Mann-Whitney U-test ble brukt og p. 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
Rhabdosphere dannelse og berikelse
Etter 2-3 uker med kultur i vekstfaktor anriket serum-sultet medium, RD celler dannet kulturer som består i flytende celleaggregater, de såkalte rhabdospheres, som kan bli ytterligere utvidet
i
vitro plakater (figur 1A). For å vurdere evnen til rhabdosphere celler for å starte selvfornyelse, ble antallet kuler som dannes i løpet av tre seriepassasjer i hver passasje bestemt. Antallet kuler oppnådd ved den tredje generasjonen var betydelig høyere, noe som indikerer at rhabdospheres kan serielt beriket. (Figur 1B; p = 0,0495
vs
passasje 1)
(A) fasekontrast bilder av rhabdospheres avledet fra RD dyrket i forankringsuavhengig tilstand, i serum-sultet medium supplert med bFGF og EGF. Representant bilde, skala bar 100 mikrometer. (B) Sphere dannende effektivitet av rhabdospheres enn tre serie passasjer. Grafen viser mengden av primær, sekundær (generert fra dissosierte primære kuler), og tertiær (generert fra dissosierte sekundære kuler) kuler fra 2000 celler. * P 0,05
vs
primære kuler. (C) mRNA nivåer for stamcellemarkører OCT3 /4 og Nanog i rhabdospheres forhold til opprinnelig RD av Real Time PCR. * P 0,05. (D) Western blotting for OCT3 /4 og Nanog i rhabdospheres forhold til RD innfødte celler (venstre, representative bilder) og densitometrisk analyse (høyre; * p 0,05). (E) differensieringsanalyser av rhabdospheres etter inkubasjon med passende differensierende stimuli. Venstre: osteogene differensiering evaluert av Alizarin Red S farging, skala bar 100 mikrometer; midten: adipogenic differensiering evaluert av Olje-Red-O lipid flekker, skala bar 10 mikrometer; høyre: chondrogenic differensiering evaluert av Alcian blå flekker, skala bar 50 mikrometer. Representative bilder. (F) Transwell chemotaxis analysen av rhabdospheres
vs
innfødte RD. Grafen viser antall migrerte celler i fem X20 felt etter 8 timer. * P 0,05. (G) mRNA nivåer for MMP9 i rhabdospheres
vs
innfødte RD av Real Time PCR. * P 0,05. (H) MMP aktivitet i supernatanten av rhabdospheres
vs
RD innfødte celler ved gelatin quenching analysen. * P 0,05. (I) mRNA nivåer for CXCR4 i rhabdospheres forhold til opprinnelig RD av Real Time PCR. * P 0,05. (L) Cytofluorimetric analyse av CXCR4-positive cellefraksjon i rhabdospheres og innfødte RD. Representative intensitet tomter for rhabdospheres og innfødte RD (til venstre) og prosentandel av CXCR4-positive celler (høyre). ** P. 0,001
Stemness funksjonene rhabdospheres
For å vurdere stamcellemessige kjennetegn rhabdospheres, nivået av uttrykk for to stemness markører, faktorer transkripsjon OCT3 /4 og Nanog, ble evaluert og sammenlignet med innfødte RD celler. Transkripsjon av både gener ble oppregulert i rhabdospheres (figur 1C). Nærmere bestemt ble det observert en betydelig økning for Nanog mRNA og en tendens til økning, selv om det ikke er vesentlig, for OCT3 /4 (figur 1C; p = 0,0283). Lignende resultater ble oppnådd for Nanog protein ved Western Blot analyse, der vi har oppdaget en svak, men signifikant økning for kuler (figur 1D; p = 0,0495), mens vi ikke fant forskjell for OCT3 /4. Spesielt, fant vi også at CD133 ikke var forbundet med stammen lignende fenotype (45,9 ± 3,4% for RMS CSC
vs
43,8 ± 1,8% for RD, henholdsvis). Til slutt viste vi stamcelle plastisitet rhabdospheres av deres evne til å skille langs tre mesenchymale linjer, som demonstrert av Alizarin Red S (osteogenesis), Olje-Red-O (adipogenesen), og Alcian Blå (chondrogenesis) farging (figur 1E) .
Forbedrede migrasjons og invasjonsegenskapene til rhabdospheres
antall rhabdosphere celler som migrerte gjennom Boyden Chamber var betydelig høyere enn RD (figur 1F; p = 0,0162). Rhabdosphere celler viste også en markert
in vitro
ekstracellulær matriks nedbrytning potensiale sammenlignet med nativ RD, som vist ved oppregulering av MMP9 mRNA (figur 1G; p = 0,0495), og ved de høyere nivåer av gelatin nedbrytningsaktiviteten av utskilt MMP9 (figur 1 H, p = 0,0368). I tillegg rhabdospheres uttrykte svært høye nivåer av celleoverflatereseptoren CXCR4, som demonstrert av Real Time PCR (fig 1I; p = 0,0495) og flow-cytometri (figur 1 L; p = 0,0027). Dette kjemokinreseptor formidler migrering av tumorceller mot sin ligand uttrykke vev [27].
Redusert følsomhet for DXR gjennom MDR1-uavhengig mekanisme i rhabdospheres
For å evaluere chemoresistance i RMS CSC, rhabdospheres og innfødt RD ble utsatt for økende konsentrasjoner av cisplatin eller DXR. I form av levedyktighet hemming, begge cellepopulasjoner viste samme mønster som svar på cisplatin (figur 2A, EC
50 verdier: 18,7 mikrometer for kuler og 14,6 mikrometer for RD). På den annen side, i motsetning til naturlig RD, RMS CSC viste en signifikant lavere veksthemming i respons til DXR (figur 2B; p = 0,018 til 10 ng /ml, p = 0,0209 for 50 ng /ml, og p = 0,0202 for 100 ng /mL).
