Abstract
Hypoksi-induserbar faktor-1 (HIF-1) og dens viktigste subenhet, HIF-1α, spiller en sentral rolle i tumorprogresjon ved å regulere gener involvert i kreftcelle overlevelse, spredning og metastase . HIF-1α aktivitet er forbundet med kjernefysiske opphopning av transkripsjonsfaktoren og regulert av flere mekanismer, inkludert modulering av proteinstabilitet og degradering. Blant nyere fremskritt er de funn som betennelse-indusert cytokiner og vekstfaktorer påvirker protein opphopning av HIF-1α i henhold normoxia forhold. TNFa, en viktig proinflammatorisk cytokin som fremmer tumorigenesis er kjent som en stimulator av HIF-1α aktivitet. For å forbedre vår forståelse av TNFa-mediert regulering av HIF-1α atom akkumulering vi vist en kinase-spesifikke siRNA bibliotek ved hjelp av en celle bildebehandling basert HIF-1α-EGFP chimera reporter analysen. Interessant, dette systematisk analyse fastslått at uttømming av kinaser involvert i konvensjonell TNFa signale (IKK /NFkB og JNK trasé) har ingen skadelig effekt på HIF-1α akkumulering. På den annen side, uttømming av PRKAR2B, ADCK2, TRPM7, og TRIB2 betydelig reduserer effekten av TNFa på HIF-1α stabilitet i osteosarcom og prostata cancercellelinjer. Disse nyoppdagede regulatorer formidlet sin aktivitet gjennom en ikke-konvensjonell relB-avhengig NFkB signalveien og regulering av superoksid aktivitet. Til sammen våre data tillate oss å konkludere med at TNFa bruker en distinkt og kompleks signalering mekanisme for å indusere opphopning av HIF-1α i kreftceller. Oppsummert våre resultater belyse en ny mekanisme som kreft initiering og progresjon kan fremmes av inflammatoriske cytokiner, fremhever nye potensielle veier for å bekjempe denne sykdommen
Citation. Schoolmeesters A, Brown DD, Fedorov Y (2012) Kinome-Wide Funksjonell genom Screen avslører en ny mekanisme av TNFa-indusert Nuclear Opphopning av HIF-1α transkripsjonsfaktor i kreftceller. PLoS ONE 7 (2): e31270. doi: 10,1371 /journal.pone.0031270
Redaktør: Ying Xu, University of Georgia, USA
mottatt: 13 september 2011; Godkjent: 05.01.2012; Publisert: 15 februar 2012
Copyright: © 2012 Schoolmeesters et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Thermo Fisher Scientific. Det er for øyeblikket ingen eksterne finansieringskilder for denne studien
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og har følgende konkurrerende interesse: Alle forfatterne er ansatt av Thermo Fisher Scientific. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatterne sin tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
Betennelse er en primær forsvar prosess mot ulike ekstracellulære stimuli, for eksempel virus, patogener, matvarer og miljøgifter. Flere studier har vist at tumorigenesis i mange kreftformer er nært forbundet med kronisk betennelse. Unormale cellulære endringer som følger kronisk betennelse som oksidativt stress, genmutasjon, epigenetisk endring, og inflammatorisk cytokine release deles med kreftfremkallende prosesser, som danner et kritisk kryss-link mellom kronisk betennelse og kreftutvikling. Nesten 25% av kreft er rapportert å forekomme gjennom kroniske inflammasjonsrelaterte prosesser [1], [2]. De proinflammatoriske regulatorer så som TNFa og andre cytokiner og deres reseptor-nettverk synes å spille viktige funksjoner i tumorgenese [3].
hypoksi-induserbar faktor-1 (HIF-1) og dens viktigste subenhet, HIF -1α, spiller en sentral rolle i tumorprogresjon ved å regulere gener involvert i kreftcelle overlevelse, spredning og metastase [4]. HIF-1 er en hovedkomponent av oksygenfølersystem som styrer cellulære responser til redusert oksygentilgangen. Den hypoksi induserbar transkripsjonsfaktoren HIF-1 er en heterodimer sammensatt av helix-loop-helix-Per-Arnt-Sim (bHLH-PAS) proteiner HIF-1α og aryl hydrokarbon atom Translocator (ARNT) også kjent som HIF-1β. Transaktivering av HIF-1 sender et signal inn i hypoksisk en rekke patofysiologiske responser ved regulering av en rekke målgener [4], [5].
I tillegg til hypoksi, nyere bevis tyder på at HIF-1 kan bli akkumulert og aktiveres under normoxia av vekstfaktorer, cytokiner og andre faktorer assosiert med betennelse [5]. Flere rapporter har antydet en viktig rolle i reguleringen av TNFa HIF-1α stabilitet og aktivitet [6] – [8]. Men detaljer om HIF-1 regulering av TNFa fortsatt uklare.
Her beskriver vi signaliserte mekanismer som tilskynder HIF-1α opphopning svar på TNFa. For å forbedre vår forståelse av HIF-1 regulering av cytokin, vi skjermet en kinase-spesifikk små forstyrrelser RNA (siRNA) bibliotek ved hjelp av en HIF-1α-EGFP chimera reporter analysen i henhold TNFa behandling. Denne skjermen bestemt at uttømming av
ADCK2
,
PRKAR2B
,
TRIB2 Hotell og
TRPM7
viktigst nedregulerer atom opphopning av HIF-1α i respons til behandling av osteosarkom celler. Videre våre resultater tyder på at denne veien er også til stede i prostatakreftceller. Overraskende nok ble mekanismen for regulering av TNFa-fremkalte HIF-1α akkumulering forbundet med en ikke-konvensjonell NFkB signalveien og lindring av superoksyd aktivitet. Tatt sammen våre data tillate oss til å konkludere at TNFa benytter en distinkt og komplisert mekanisme for signalering for å indusere akkumulering av HIF-1α.
Resultatene
TNFa er en viktig inflammatorisk cytokin rapportert å være en potent induser av HIF-1α atom opphopning [5] – [8]. Vi undersøkte flere kreftcellelinjer for HIF-1α opphopning henhold TNFa behandling. I våre forsøk, produsert TNFa en betydelig økning i kjerne akkumulering av HIF-1α i flere avbryte cellelinjer (Fig. 1a). Tilsvarende TNFa-indusert kjerne oppbygning av en HIF-1α-EGFP-kimærprotein (fig. S1A, Fig. 1 b, c) i det HIF-1α_U2OS Redistribution assay basert på en osteosarcom-cellelinje. Den observerte effekten var treringstrinnet og tidsavhengig (fig. 1 b, c). 24 timers inkubasjon med TNFa ved 10 ng /ml ble valgt for screening alle eksperimenter for å gi en passende vindu for å studere opp- og nedregulering av HIF-1α akkumulering.
(A) TNFa-indusert kjerne akkumulering av HIF -1α i LNCaP, DU145, MCF10a og MDA MB231 kreftcellelinjer. Ekspresjon og atom akkumulering av HIF-1α ble bestemt ved immunocytokjemi avbildning, som beskrevet i Materialer og Metoder. (B) TNFa-indusert stimulering av HIF-1α-EGFP atom akkumulering i U2OS osteosarkom i en konsentrasjonsavhengig måte. (C) TNFa stimulert HIF-1α-EGFP atom akkumulering i U2OS celler i en tidsavhengig måte. Alle data (Median +/- MAD) normalisert til ubehandlede celler. For hvert panel, data er representative for to uavhengige eksperimenter utført in triplo *, **:. T-test p-verdi mellom behandlede celler og tilsvarende kontrollgruppe, * – p 0,01, ** – p 0,05
Det er to reseptorer beskrevet for TNFa, nemlig TNF reseptor 1 (TNFR1, p55 reseptor) og TNF reseptor 2 (TNFR2, p75 reseptor). TNFR1 er ubikvitært uttrykt mens TNFR2 er hovedsakelig uttrykt i immunceller [9]. Selv om begge reseptorene binde TNFa, den viktigste reseptoren medierer cellulære effekter i de fleste celletyper er TNFR1. I våre eksperimenter knockdown av TNFR1 effektivt redusert TNFa-avhengig atom akkumulering av HIF-1α (Fig S1b). TNFa er kjent for å aktivere flere baner nedstrøms for TNFR1 [9]. For å undersøke hvilken rolle kinaser i å regulere HIF-1α opphopning henhold TNFa behandling, utarmet vi kinaser i HIF-1α-U2OS celler ved hjelp av en siRNA kinase bibliotek targeting 788 kinaser og deretter analysert cellular opphopning av HIF-1α-EGFP etter inkubasjon med TNFa ( fig. 2a). For å minimere siRNA off-target aktivitet vi brukte på målet
pluss
versjon av den menneskelige kinaser samling av SMART
pool
siRNA reagenser [10]. Den samme kinase-biblioteket ble screenet i en kontrollcellelinje som uttrykker EGFP bare å subtrahere mulige ikke-spesifikke virkninger. HIF-1α-EGFP screening data ble utsatt for Student t-test p-verdi analyse, Benjamini-Hochberg multiple sammenligninger korreksjon [11], og ytelse rangeringen etterfulgt av sammenligning mellom to uavhengige screening eksperimenter med en 1,5 ganger endring terskel. Resulterende data ble ytterligere sammenlignet med data fra disken-skjermen med celler uttrykker EGFP bare (1,2 ganger endring terskel for EGFP bare, Fig S2) og overlappende treff avvist. Blant de 788 kinaser er filtrert av siRNA-mediert stanse, utarming av 77 gener økt HIF-1α-EGFP opphopning over to ganger (tabell S1) og utarming av sju målgener redusert opphopning henhold TNFa behandling (Fig. 2a). Genene som viser et siRNA-formidlet reduksjon av HIF-1α akkumulering var av særlig interesse fordi disse er potensielt medlemmer av TNFa-signaliseringsreaksjonsveier. Disse inkluderer
PRKAR2B, ADCK2, TRPM7, RIOK2, TRIO, ADRA1B og TRIB2
. For å bekrefte at nedgangen i TNFa-indusert HIF-1α akkumulering i siRNA-transfekterte celler ble direkte knyttet til utarming av utvalgte målene vi gjentok dette eksperimentet ved hjelp av nye syntetiserte siRNA bassenger (fig. 2b). Bare én av sju utvalgte hit kandidater ikke ble bekreftet. SiRNA målretting
ADRA1B plakater (data ikke vist), som senere ble utelatt fra videre analyse
(A) Representative datasett fra en kinome -Stort skjermen på 788 siRNAs. Data (Median +/- MAD) er representative for tre individuelle transfections og er normalisert til å kontrollere siRNA. (B) Valgte siRNA treffe kandidater ble testet i egne eksperimenter. sirnas målretting
ADCK2, RIOK2, PRKAR2B, TRIB2, TRIO og TRPM7
ble bekreftet som hit kandidater og utsatt for videre analyse. Alle data normalisert til celler transfektert med kontroll siRNA NTC1. (C) Virkning av utvalgte siRNA treffe kandidater på HIF-1α akkumulering i LNCaP prostatakreft-cellelinje. Data (Median +/- MAD) er representative for tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. Alle data normalisert til TNFa-behandlede celler. *, **. T-test p-verdi mellom behandlede celler og tilsvarende kontrollgruppe, * – p 0,01, ** – p 0,05
En høy innholdsanalyse tilnærming tillater samtidig oppkjøp av flere datastrømmer fra det samme sett av prøver. Vi benyttet denne tilnærmingen til ytterligere analysere screening data. Innsamlede data (celle nummer i hvert felt) foreslo at ingen av de valgte siRNAs (
PRKAR2B, ADCK2, TRPM7, RIOK2, TRIO, og TRIB2)
produsert noen effekt på celle levedyktighet (fig S3). I tillegg til kontroll av proteinstabilitet, kan HIF-1α funksjon reguleres ved prosesser som påvirker den subcellulære lokalisering, f.eks cytoplasma vs. kjernekraft. Samtidig måling av HIF-1α opphopning i kjernen og cytoplasma avslørte at ingen av siRNA målene som er valgt for en nedgang i kjernefysisk opphopning produsert en økning i cytoplasma oppbevaring av HIF-1α (data ikke vist).
For å undersøke hvis utvalgte kandidat treff kan påvirke TNFa-mediert opphopning av HIF-1α i andre celletyper vi bestemt HIF-1α kjernefysiske buildup i prostata kreft cellelinjer. HIF-1α akkumulering i LNCaP og DU145-celler ble funnet å være følsomme overfor TNFa mens PC3, en prostata cellelinje med sterk invasiv potensial [12], viste ingen slik følsomhet (Fig. 1a,). Nedbryting av
PRKAR2B
,
ADCK2
,
TRPM7 Hotell og
TRIB2
betydelig redusert HIF-1α akkumulering i LNCaP, en androgen-sensitive menneskelige prostata adenokarsinom celle linje med lav invasiv potensial (fig. 2c). Data tilsvarende til U2OS og LNCaP ble også oppnådd fra MCF10a, en ikke-tumorigen mammary epitelcellelinje (Fig S4a). I DU145 cellene, en prostatakreft cellelinje med moderat invasiv potensial, bare
TRIB2
uttømming var effektive i abrogere TNFa-indusert HIF-1α akkumulering (Fig S4B). Basert på ovennevnte resultater
PRKAR2B, ADCK2, TRPM7 og TRIB2
ble valgt for videre analyse. siRNA bassenger rettet mot disse genene produsert konsentrasjonsavhengig effekt på TNFa-stimulert HIF-1α akkumulering i U2OS osteosarkom-celler (fig. 3a)
(A) Utvalgte sirnas redusere TNFa-mediert HIF-1α akkumulering i en konsentrasjonsavhengig maner. (B) siRNA bassenger og individuelle siRNA-molekyler som produseres sammenlignbare effekter på HIF-1α akkumulering. (C) siRNA bassenger og individuelle siRNA-molekyler for de utvalgte hit kandidatene gi effektiv målgenet uttømming. U2OS celler ble inkubert med TNFa i 24 timer. Alle data normalisert til celler transfektert med kontroll siRNA NTC1. Dataene er representative for to uavhengige eksperimenter, tre (A, B, Median +/- MAD) eller to (C, Mean +/- STDEV) individuelle transfections hver.
I alle våre eksperimenter vi ansatt strategier som er kjent for å redusere siRNA off-target effekter: anvendelse av kjemisk modifisert siRNA-molekyler og bruk av en siRNA pooling strategi. For ytterligere å bekrefte at nedgangen i TNFa-indusert HIF-1α akkumulering i siRNA-transfekterte celler ble direkte relatert til on-target effekter av siRNA, vi gjentok dette eksperimentet ved hjelp av nye syntetiserte siRNA bassenger og fire separate siRNA tomannsboliger (som utgjør hvert basseng ) for å tømme alle fire cellulære mål. Disse forsøk ga resultater tilsvarende til screening data – for alle fire målene siRNA bassenger og fire individuelle siRNA duplekser produsert signifikant reduksjon i HIF-1α akkumulering (mer enn to gangers, fig 3b.). Effektiviteten av målet genet knockdown for utvalgte siRNA treff ble bestemt ved hjelp av Q-PCR og Solaris sonder. Målgenet uttømming korrelerer med HIF-1α fenotypisk assay – for alle fire målene siRNA bassenger som brukes i screening-kampanje og fire individuelle siRNA duplekser viste potent knockdown (mer enn 60%, figur 3c.). TRPM7 er dårlig uttrykt i U2OS celler og anvendelsen av noen RNAi reagent effektivt eliminert uttrykk for dette målet til en undetectable nivå (Fig. 3c).
TNFa er kjent for å regulere uttrykket av proteiner i sin egen signalkaskader. Vi fant at uttrykket av ADCK2 og TRIB2 mRNA er regulert av TNFa i U2OS kreftceller (Fig S5). Ingen statistisk ble påvist signifikante endringer for PRKAR2B og TRPM7.
Nye rapporter viser at HIF-1α stabilitet og aktivitet kan reguleres gjennom oksidativt stress-sensitiv trasé [6], [13], [14]. Slike veier er også godt kjent regulatorer av TNFa signaliserer [6], [15]. For å undersøke en mulig rolle for oksidativt stress mekanismer i TNFa-stimulerte HIF-1α opphopning vi undersøkte effekten av eksogent hydrogenperoksid. Mens hydrogenperoksid alene produserte en signifikant økning i HIF-1α akkumulering, ble en motsatt effekt observert på TNFa-forbehandlede celler (Fig. 4a). Dette resultatet tyder mulig negativ regulering av HIF-1α opphopning av superoksid, en viktig kilde til intracellulær peroxide [16]. Vi antok at nyoppdagede positive regulatorer av HIF-1α akkumulering kan styre enten superoksid produksjon eller en konvertering til peroxide. I U2OS celler, TNFa robust øket ekspresjon av MnSOD, en av de store superoksyd /peroksyd konverterings enzymer (fig S6). Imidlertid uttømming av de identifiserte positive regulatorer av HIF-1α opphopning hadde ingen virkning på ekspresjon av MnSOD (Fig S6).
(A) Selv om tilsetning av hydrogenperoksyd (100 uM, 3 timers inkubering) kan stimulere HIF -1α akkumulering, minker slik opphopning i TNFa-behandlede celler (21 timers inkubasjon med TNFa bare etterfulgt av 3 timers inkubering i nærvær av både TNFa og hydrogenperoksyd). Data (Median +/- MAD) normalisert til celler transfektert med kontroll siRNA NTC1 og behandlet med DMSO. (B) Superoxide åtseletere redning HIF-1α akkumulering i cellene transfektert med sirnas målretting
ADCK2 Hotell og
TRIB2
men ikke
PRKAR2B
eller
TRPM7
. Celler ble behandlet med TNFa lik (A) og inkubert med Tiron (0,3 mM), 4-hydroksy-TEMPO (0,1 mM) eller DMSO (bærerkontroll) i 3 timer. Data (Median +/- MAD) normalisert til celler transfektert med kontroll siRNA NTC1 og behandlet med DMSO. For hvert panel data er representative for to uavhengige eksperimenter utført i fire paralleller. *, **. T-test p-verdi mellom behandlede celler og tilsvarende kontrollgruppe, * – p 0,01, ** – p 0,05
Vi observerte at superoksyddannende åtseletere Tiron og TEMPOL er i stand til å redde HIF-1α akkumulering i TNFa-behandlede celler transfektert med siRNA mot ADCK2, og TRIB2 når den anvendes i en konsentrasjon som ikke i vesentlig grad påvirker kontrollceller (fig. 4b). Celler transfektert med PRKAR2B og TRPM7 siRNA var upåvirket av superoksid scavengers (Fig. 4B). Til sammen våre data tyder på at TNFa formidler HIF-1α akkumulering gjennom en mekanisme som begrenser superoksid produksjon, og ADCK2, PRKAR2B og TRIB2 er positive regulatorer av denne mekanismen.
Flere veier og faktorer rapporteres som regulatorer av HIF- 1α aktivitet i andre eksperimentelle systemer og betingelser, inkludert konvensjonelle NFkB, JNK, STAT3, og proteasome aktivitet [5]. I tillegg er TNFa kjent for å indusere signalering gjennom de konvensjonelle NFkB veien [9], [17]. Analyse av resultatene viser at nedbrytning av kinaser som er nødvendige for disse banene produserte ingen negativ effekt på TNFa-mediert HIF-1α akkumulering. I våre forsøk, produsert TNFa ingen signifikant effekt på den STAT3-avhengige reaksjonsveien (Fig S7a). Vi antok at fordi TNFa induserer HIF-1α akkumulering, kan det også hemme proteasom-aktivitet. For å oppnå dette har vi testet TNFa som en mulig agonist i U2OS_E6-AP: p53 nedbrytning og U2OS_SCF-Skp2 E3: p27 nedbrytnings Omfordeling analyser. Proteasome aktivitet hemmer MG132 indusert opphopning av EGFP chimeras i begge analysene mens inkubasjon med TNFa hadde ingen effekt (fig S7b, c).
Data fra våre screening eksperimenter tyder på at nedbryting av oppstrøms regulatorer av JNK-reaksjonsveien resulterer i en økning av HIF-1α opphopning i respons til TNFa-behandling (tabell S1). Nedbryting av oppstrøms regulatorer av den konvensjonelle NFkB veien
Chuk, IKBKB eller IKBKE
ikke modulere HIF-1α opphopning i respons til TNFa behandling (Fig S8). Videre siRNA-mediert uttømming avdekket at NFkB proteiner RELA og NFκB2 kan fungere som negative regulatorer av en slik opphopning fordi deres knockdown produsert kraftig økning i HIF-1α akkumulering (Fig. 5a). I motsetning til dette, NFkB proteiner relB, Crel og NFκB1 synes å være nødvendig for TNFa-indusert HIF-1α akkumulering på grunn uttømming av tilsvarende gener som er produsert sterke negative effekter på akkumulering (fig. 5a). Aktivering av NFkB proteiner korrelerer med deres intracellulære trans [17]. Vi fant ut at i U2OS osteosarkom celler, TNFa stimulerer translokasjon av relB og Crel mellom kjernen og cytoplasma, med relB å bli ekskludert fra kjernen og Crel akkumuleres i kjernen. I likhet med uttømming av TNFR1, uttømming av TRIB2 og TRPM7 hindret atom utelukkelse av relB (Fig. 5b). Crel trans ble ikke påvirket av uttømming av utvalgte mål (data ikke vist). Videre ble effekten av relB uttømming svekkes av superoksid scavengers Tiron og TEMPOL (fig. 5c). Tatt sammen tyder våre resultater på at TNFa-mediert HIF-1α akkumulering kan være i det minste delvis styres av en ikke-konvensjonell NFkB signalveien aktiveres av TRIB2 og TRPM7.
(A) Nedbrytning av NFκB1, relB og Crel men ikke NFκB2 og RELA forstyrre HIF-1α akkumulering i TNFa-behandlede celler. (B) Nedbryting av ADCK2 og PRKAR2B hindrer ansamling av relB i kjernen av TNFa-behandlede celler. (C) Effekt av utarming av relB blir reddet av ROS åtseldyr. Celler ble behandlet i likhet med fig. 4C. (D) Alle data (Median +/- MAD) er normalisert til celler transfektert med kontroll siRNA NTC1 behandlet med TNFa (10 ng /ml, 24 timer). Dataene er representative for to uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. *, **. T-test p-verdi mellom behandlede celler og tilsvarende kontrollgruppe, * – p 0,01, ** – p 0,05
Diskusjoner
TNFa er godt kjent for å fremkalle flere signaleringsmekanismer der ulike kinaser spiller uerstattelige roller. Nylige fremskritt innen funksjonell genomforskning og celleavbildningsteknikker mulig for oss å utføre systematisk undersøkelse av mulige mekanismer for TNFa-mediert HIF-1α akkumulering. For å undersøke hvilken rolle kinaser i å regulere HIF-1 aktivitet ved behandling med TNF-α, utarmet vi kinaser i U2OS osteosarkom celler ved hjelp av en kjemisk modifisert siRNA kinase bibliotek targeting 778 kinaser og deretter analysert atom opphopning av HIF-1α-EGFP chimera konstitutivt uttrykt i disse cellene. I denne analysen TNFa sterk økning av HIF-1α-EGFP akkumulering av proteiner (Fig. 1 b, c).
Under normale fysiologiske betingelser HIF-1α opphopning er sterkt undertrykt av flere regulatoriske reaksjonsveier. Kinaser og relaterte proteiner er godt kjent for å spille en viktig rolle i slike veier. Derfor forventet vi at flertallet av siRNA treffe kandidatene ville gi en utgivelse fra undertrykkelse av HIF-1α akkumulering. Faktisk, blant de 788 kinaser er filtrert av siRNA-mediert stanse, uttømming av 6 kinaser betydelig redusert HIF-1α akkumulering og utarming av ytterligere 89 kinaser økte HIF-1 aktivitet i celler behandlet med TNFa (Fig. 2a, b og tabell S1).
til en viss grad, rekapitulerer våre data tidligere funn om negative regulatorer av HIF-1α aktivitet [18]. Det ble rapportert at SMG-1 undertrykker HIF-1-aktivitet i henhold til hypoksiske betingelser, og at siRNA-mediert nedbrytning av genproduktet øker aktiviteten av en HIF-1α-sensitive reporter [18] betraktelig. Resultater av våre screening eksperimenter tyder på at nedbryting av SMG-en spesifikt up-regulerer TNFa-indusert HIF-1α akkumulering (data ikke vist).
Flere veier ble funnet å være betydelig overrepresentert i gruppen av 77 negative regulatorer: 16 gener representerer GO: 0007049 cellesyklusen (
NEK4
,
TAF1L
,
CKS2
,
TTK
,
MAP3K8
,
PIM2
,
TLK1
,
PPP2CA
,
NEK9
,
PRKAG1
,
NEK6
,
PLK4
,
DGKZ
,
DUSP1
,
PIM1
,
PRKAA2
), 11 gener representerer GO: 0000165 MAPKKK signalkaskade (
PPP2CA
,
RPS6KA3
,
DUSP5
,
MAPKAPK3
,
MAPK8IP3
,
MAP4K5
,
DUSP2
,
MAPK11
,
MAP4K1
,
DUSP1
,
MAP3K9
), og fire kinaser representerer GO: 0007254 JNK kaskade system (
MAP4K1
,
MAP4K5
,
MAPK8IP3
,
MAP3K9
) (tabell S1). Disse dataene antyder at slike baner kan motsette TNFa signalering og hemme HIF-1α akkumulering.
Nedbryting av flere målgener hemme TNFa-mediert HIF-1α akkumulering (fig. 2). Disse genene kan representere en eller flere av TNFa-signaliseringsmekanismer, og er av spesiell interesse. I vår screening kampanje identifiserte vi seks mål av denne typen (fig. 2b). Videre våre resultater tyder på at fire av disse genene –
ADCK2
,
PRKAR2B
,
TRIB2 Hotell og
TRPM7 Anmeldelser – synes å regulere HIF-1α opphopning i flere cancercellelinjer (fig. 2, fig S4). Alle fire gener ble tidligere beskrevet i forbindelse med regulering av cancer celleproliferasjon og motilitet men eksisterende data viser ingen deres deltagelse i TNFa-signalisering [19] – [23]. Funksjonene til
ADCK2
protein er ennå ikke klart. Det er ikke kjent om den har proteinkinase-aktivitet, og hvilken type underlag ville det fosforylere. Flere rapporter etablert en forbindelse av
ADCK2
til kreftcelle spredning og motilitet [20].
PRKAR2B
koder cAMP-avhengig protein kinase type II-beta regulatorisk subenhet. CAMP-avhengig protein kinase A (PKA) er en allestedsnærværende serin /treonin protein kinase. PKA er akseptert som en viktig formidler av intracellulære cAMP-signaler i eukaryoter. Til dags dato har et stort antall cytoplasmatiske og noen få kjernefysiske PKA underlag blitt rapportert [23]. Interessant, uttømming av
PRKAA1 plakater (den katalytiske subenheten til PKA) også fremstilt en reduksjon i HIF-1α akkumulering om enn i lavere grad enn
PRKAR2B
uttømming (data ikke vist). Videre studier er nødvendig for å avklare eksakte rolle PKA i TNFa-stimulerte HIF-1α akkumulering. Selv om den molekylære funksjon av TRIB2 (Tribbles homolog 2) fremdeles er uklar, er det blitt identifisert som et potensielt fører av lunge tumordannelse og en myeloid oncogen [21], [22]. TRPM7 er en allestedsnærværende uttrykt og konstitutivt aktiv toverdig kation kanal. Det gir en mekanisme for Mg2 + oppføring og dermed er det viktig for celle overlevelse og spredning [19], [24]
Nøkkel regulatorer av TNFa-signalveier er reaktive oksygenforbindelser (ROS;.
f.eks
., superoksid, hydrogenperoksid, og hydroksylradikal) [6], [15]. ROS er blitt foreslått å modulere TNFa-signalisering, noe som gir både positiv og negativ regulering av NFkB systemet nedstrøms for TNFR1 avhengig av eksperimentelle system og betingelser [6], [25]. Våre resultater antyder at hydrogenperoksid undertrykker TNFa-mediert HIF-1α akkumulering (Fig. 4a). Disse dataene tyder på at kilden for intracellulær hydrogenperoksyd, kan superoksid anion hemme TNFa-mediert HIF-1α opphopning i tillegg. Vi antok at de nylig beskrevet regulatorer av akkumulering kan lokke fram sin effekt gjennom modulering av superoksid produksjon. Faktisk, lindring av superoksid anion aktivitet redder HIF-1α opphopning på bakgrunn av uttømming av ADCK2 og TRIB2 (Fig. 4b). Alle disse resultatene tyder på at TNFa-indusert HIF-1α akkumulering kan reguleres ved en superoksyd følsom bane, og at de ovennevnte tre proteinene kan være involvert i negativ regulering av superoksydproduksjon (fig. 6).
Våre resultater tyder at TNFR1 reseptoren kan formidle sin virkning gjennom en kompleks mekanisme som inkluderer en ikke-konvensjonell NFkB-avhengig reaksjonsvei. Denne mekanismen kan negativt regulere produksjonen av reaktive oksygenforbindelser og ser ut til å være styrt av TRIB2, ADCK2 og PRKAR2B.
Det er vel etablert at konvensjonelle og ikke-konvensjonelle NFkB signale kaskader er store mekanismer som formidler effekter av TNFa på intracellulær fysiologi [26]. Våre screening resultater tyder på at uttømming av positive regulatorer oppstrøms av konvensjonell NFkB – IKK-α (
Chuk
), IKK-β (
IKKB
) eller IKK-ε (
IKBKE
) – produsert noen negativ innvirkning på HIF-1α atom akkumulering (fig S8)
Dessuten fant vi at uttømming av
RELA Hotell og
NFKB2
resulterer i en betydelig. oppregulering av HIF-1α opphopning mens uttømming av
relB
,
Crel Hotell og
NFKB1
gir en nedgang i HIF-1α akkumulering. En slik reduksjon kan bli reddet av innstrammingen av superoksid anion aktivitet (Fig. 5). Videre uttømming
TRIB2 Hotell og
TRPM7
ble funnet å hindre intracellulære translokasjon av relB ved behandling med TNFa. Disse funnene tillatt oss å spekulere i at TNFa kan regulere HIF-1α akkumulering gjennom både konvensjonelle og ikke-konvensjonelle NFkB veier. Den faktiske mengden av akkumulert HIF-1α vil da være avhengig av en balanse mellom forskjellige TNFa-indusert NFkB veier. Den foreslåtte modellen ser ut til å være på linje med den kjente kompleksiteten av betennelse-cancer forbindelser [3].
Tatt sammen tyder våre resultater på at TNFa-indusert HIF-1α oppbygging er regulert av en flere baner (fig. 6 ). I det minste delvis, kan TNFa formidle sin virkning gjennom TNFR1 reseptorsignalisering som fører til en ikke-konvensjonell NFkB-avhengig mekanisme som negativt regulerer produksjon av reaktive oksygenarter. Denne mekanismen synes å være styrt av ADCK2 og TRIB2. TRPM7 ser ut til å stimulere relB trans, men dens uttømming fenotype kan ikke bli reddet av lindring av superoksid aktivitet. Dermed kan TRPM7 representere en selvstendig sti for regulering av HIF-1α akkumulering. Videre studier er nødvendig for å forstå større kompleksitet TNFa avhengig stimulering av HIF-1α atom akkumulering og dens rolle i tumordannelse og tumorprogresjon.
Materialer og Metoder
Cellelinjer
PC3, DU145, LNCaP, MCF10a, MDAMB-231, ble MCF7 SW480 og HepG2 innhentet fra ATCC og vedlikeholdt i henhold til anbefalte protokoller.
HIF-1α_U2OS Omfordeling analysen ble brukt i screening kampanje for å overvåke HIF- 1α atom opphopning: rekombinante U2OS-celler som stabilt uttrykker human
HIF-1α plakater (NM_001530) fusjonert til C-terminalen av forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP). U2OS celler er adherente epitelceller avledet fra humant osteosarkom. Ekspresjon av EGFP-HIF-1α blir styrt av en standard CMV-promoter og kontinuerlig ekspresjon opprettholdes ved tilsetning av G418 til kulturmediet i overensstemmelse med fabrikantens protokoll. U2OS stabil cellelinje som uttrykker EGFP ble bare brukt som en subtraksjon kontroll i screening kampanje
I tillegg til HIF-1α_U2OS effekten av TNFa behandling ble testet i tre separate Thermo Fisher Scientific Omfordeling Analyser. Den STAT3_U2OS Omfordeling analysen , E6-AP: p53 degradering Omfordeling analyse (U2OS), og SCF-Skp2 E3 Ligase: p27 degradering Omfordeling analyse (U2OS). Analyser ble utført i henhold til fabrikantens protokoller for alle referanseforbindelser. For TNFa-behandling, ble hver analysecellelinje behandlet i 24 timer ved 37 ° C med TNFa ved følgende konsentrasjoner: 80 ng /ml, 40 ng /ml, 20 ng /ml, 10 ng /ml, 5 ng /ml, 2,5 ng /ml, 1,25 ng /ml og 0,63 ng /ml. Hver TNFa-titreringen ble utført i fire på 96-brønners analyseplater, og hvert analyseplaten ble utført in triplo. Etter TNFa behandling ble platene fiksert, farget med Hoechst 33258 og avbildes som beskrevet nedenfor. TNFa ble kjøpt fra R D Systems, hydrogenperoksid, Hoechst 33258, Tiron og 4-hydroxy-TEMPO (TEMPOL) ble kjøpt fra Thermo Fisher Scientific
Transfeksjon
Alle cellelinjer ble transfektert. med Dharmafect (DF) transfeksjon reagenser (Thermo Fisher Scientific): DF1 (HepG2, MCF7-, MCF10A), DF2 (SW480), DF3 (HIF-1α_U2OS, DU145, LNCaP, PC3) og DF4 (MDA-MB-231). Den screening kampanje i HIF-1α_U2OS og kontrollceller ble utført ved hjelp av en PÅ-TARGET
pluss
versjon av den menneskelige kinaser samling av SMART
pool
siRNA regenter kinase bibliotek targeting 788 kinaser (Thermo Fisher Scientific ).
