Abstract
1α-25 (OH)
2 vitamin D
3 (1-25D), en aktiv hormonell form for vitamin D
3, er en velkjent chemopreventive og pro-differensierende midlet. Det har blitt vist å hemme veksten av flere prostata cancer-cellelinjer. Gap veikryss, dannet av proteiner som kalles connexins (Cx), er ensembler av celle-celle-kanaler, som tillater utveksling av små vekst regulatoriske molekyler mellom tilstøtende celler. Celle-celle-kommunikasjon formidles ved gap synaptiske kanaler er en viktig homeostatisk kontroll mekanisme for å regulere cellevekst og differensiering. Vi har undersøkt effekten av 1-25D på dannelse og nedbrytning av gap junctions i en androgen responsiv-prostatacancercellelinje, LNCaP, som uttrykker retroviralt-introdusert Cx32. Connexin32 er uttrykt ved de luminale og godt differensierte celler fra normale prostata og prostatakreft. Våre resultater dokumentere at 1-25D forsterker uttrykket av Cx32 og påfølgende montering i gap veikryss. Våre resultater viser videre at 1-25D hindrer androgen-regulert nedbrytning av Cx32, post-translatorisk, uavhengig av androgen reseptor (AR) -mediert signalering. Til slutt, våre funn dokumentere at dannelsen av gap veikryss sensitizes Cx32-uttrykk LNCaP cellene til de veksthemmende effekten av 1-25D og endrer deres morfologi. Disse funnene tyder på at veksthemmende effekter av 1-25D i LNCaP cellene kan være relatert til dens evne til å modulere montering av Cx32 i gap veikryss
Citation. Kelsey L, Katoch P, Ray A, Mitra S, Chakraborty S, Lin MF, et al. (2014) Vitamin D
3 Regulerer Dannelse og Nedbrytning av gap veikryss i Androgen-Responsive menneskelige prostata kreft celler. PLoS ONE ni (9): e106437. doi: 10,1371 /journal.pone.0106437
Redaktør: Michael Koval, Emory University School of Medicine, USA
mottatt: 26 november 2013; Godkjent: 06.08.2014; Publisert: 04.09.2014
Copyright: © 2014 Kelsey et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av National Institutes of Health CA113903, DOD PCRP PC-081198 og PC-111867, Nebraska State Grant LB506 og R0-1DE12308. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
rolle til vitamin D
3, og dens aktive hormonelle skjema 1α-25 (OH)
2 vitamin D
3 (1-25D), som et anti-neoplastisk, pro -differentiating, og pro-apoptotisk middel er blitt etablert i en rekke normale og maligne epitelceller, inkludert prostata cancer (PCA) [1] – [4]. Handlingene til 1-25D formidles ved binding til vitamin D-reseptoren, en av medlemmene av nukleær reseptor superfamilie, som uttrykkes i en rekke forskjellige celler, inkludert prostata. Vitamin D-reseptoren heterodimerizes med RXR reseptor og binder seg til vitamin D reseptor respons element for å endre genuttrykk [1]. Basert på den observasjon at PCA dødelighet i USA er omvendt proporsjonal med geografisk hendelsen ultrafiolett stråling fra sola, og at ultrafiolett lys er viktig for vitamin D
3 syntese i huden, en rolle for dette vitaminet i synkende risikoen for å utvikle PCA har blitt foreslått [5], [6]. Tallrike
in vitro
studier viser konsistent vekst inhiberende og differensieringsinduserende effekter av vitamin D
3 på prostata carcinoma celler og dyrestudier viser at det ikke bare reduserer forekomsten av PCA ved å virke som et middel Kjemopreventivt men også undertrykker metastase [7] – [10]
Gap junction (GJ) s er ensembler av celle-celle-kanaler som signaliserer ikke-kanonisk, ved å tillate direkte utveksling av små molekyler (≤1500Da) mellom. de cytoplasmatiske interiør med sammenhengende celler [11]. Konstituerende proteiner av GJS, kalt connexins (CXS), er kodet med 21 gener, som er blitt utpekt i henhold til deres molekylvekt [12]. Celle-celle-kanaler er bicellular strukturer dannet av samarbeid mellom to celler. For å danne et GJ celle-celle-kanal, CXS første oligomerisere i det endoplasmatiske retikulum eller trans-Golgi-nettverk som en heksamer, kalt connexon, som dokker med connexon vist på en tilstøtende celle [13], [14]. Flere linjer av bevis nå låne troverdighet til den oppfatningen at celle-celle kommunikasjon formidles av gap junctional kanaler er en viktig homeostatic kontroll mekanisme for å regulere cellevekst og differensiering, og for å dempe tumorvekst. For eksempel, svekket Cx uttrykk, eller tap av GJ funksjon, har vært implisert i patogenesen av en rekke typer av kreft og sykdommer [15] – [19]. Dessuten mutasjoner i flere Cx-gener er blitt påvist i genetiske lidelser karakterisert ved avvikende cellulær proliferasjon og differensiering [13], [20].
Vårt tidligere studier viste at ekspresjon av Cx32, som uttrykkes ved luminal cellene i prostata, falt sammen med oppkjøpet av den differensierte tilstand av luminal celler [21], [22]. Videre dokumenteres vi at utviklingen av PCA fra en androgen-avhengige tilstand til en invasiv, androgen-uavhengig stat var preget av avvikende handel med Cx32 og /eller nedsatt enheten i GJS [22] – [24]. Videre våre studier viste at tvangs uttrykk for Cx32 inn androgen-responsive human PCA cellelinje, LNCaP, tilbakestående cellevekst
in vivo Hotell og
in vitro product: [22]. Vi har også vist at i LNCaP-celler som uttrykker Cx32, dannelse og nedbrytning av GJS ble regulert av androgener, som kontroll på ekspresjonsnivået av Cx32 posttranslationally ved å hindre dets nedbrytning ved endoplasmatisk retikulum tilhørende degradering (erad) [25]. Androgener er nødvendig for å opprettholde den sekretoriske (differensiering-beslektet) funksjonen til de luminale epitelceller i normal prostata som uttømming av androgener ved kirurgisk eller kjemisk måte utløser apoptose og /eller dedifferentiation av disse cellene [26] – [29]. Vårt nylige studier har vist at retinoider, som også regulerer proliferasjon og differensiering av prostata epitelceller [28], [30], også forbedre monteringen av Cx32 inn i GJS [31]. Disse studiene låne troverdighet til den oppfatningen at dannelse og nedbrytning av GJS kan være knyttet til spredning og differensiering av luminal prostata epitelceller.
Som androgener og retinoider, vitamin D
3 er viktig for normal utvikling av prostata og har også blitt dokumentert å modulere PCA progresjon [7], [9]. Nyere studier har vist at vitamin D trykt prostata epitel neoplasi i Nkx3.1 /PTEN gene mus [32]. Epidemiologiske, cellekultur, og kliniske studier har implisert antitumor-virkningene av 1-25D for PCA og det har blitt foreslått å være en potent Kjemopreventivt middel [3], [4]. Men i motsetning til tykktarmskreft [1], [33], den potensielle effektivitet av 1-25D i kjemoprevensjon av PCA har vært kontroversielt til tross for tallrike studier i transgene musemodeller av PCA og dets bruk i kliniske forsøk [1], [2]. Tidligere studier, inkludert våre, har vist at vekst-hemmende og differensieringsinduserende effekter av chemopreventive midler kan være relatert til deres evne til å forbedre gap junctional kommunikasjon [34] – [38]. Luminal cellene i normal prostata uttrykke Cx32 og danne store GJS og progresjon av PCA er ledsaget av tap av evne til å danne GJS [22], [23]. Dannelse av GJS har vært innblandet i å opprettholde den polariserte og differensierte tilstand av epitelceller [39]. Disse studiene bedt oss om å undersøke effekten av 1-25D på montering av Cx32 inn GJS i androgen-responsive human PCA cellelinje LNCaP. Fordi 1-25D har vist seg å øke ekspresjonen av AR i LNCaP-celler [40], rasjonalisert vi at det kan modulere androgen-regulert dannelse og nedbrytning av GJS og påvirke veksten av androgen-responsive PCA-celler som uttrykker Cx32. Ved å bruke androgen-responsive LNCaP celler som uttrykker retroviralt-introdusert Cx32 [25], viser vi at 1-25D forbedrer montering av Cx32 inn GJS. Videre viser vi videre at 1-25D hindrer androgen-regulert nedbrytning av GJS post-translatorisk, uavhengig av AR-mediert signalering. Til slutt, våre funn viser at dannelsen av GJS sensitizes LNCaP celler til veksthemmende effekter av 1-25D og endrer deres morfologi.
Materialer og metoder
Cell Culture
Androgen -responsive human PCA-cellelinje, LNCaP, ble dyrket som beskrevet [41], [42]. LNCaP-32-celler, en av flere kloner av LNCaP-celler som uttrykker retroviralt-transduserte rotte Cx32, og LNCaP-N-celler, er en av de flere kontroll kloner ble valgt i G418 etter infeksjon med kontrollretrovirus, er blitt beskrevet [25], [ ,,,0],31]. Sperre LNCaP-celler, heretter referert til som LNCaP-P-celler, ble dyrket i RPMI inneholdende 5% føtalt bovint serum i en atmosfære av 5% CO
2/95% luft, mens LNCaP-N og LNCaP-32-celler ble opprettholdt i RPMI inneholdende 5% føtalt bovint serum inneholdende G418 ved 200 ug /ml som beskrevet [25], [31]. Steroid-utarmet (trekull-strippet) serum og fenol-rød-fri RPMI ble oppnådd fra HyClone Laboratories (Salt Lake City, Utah).
Antistoffer og Farging
Kildene til både monoklonale og polyklonale antistoffer mot Cx32 er blitt beskrevet tidligere [24], [25], [31], [43], [44]. Mouse anti-occludin (klone OC-3F10) var fra Zymed laboratorier, Inc. (South San Francisco, California). Kaninantistoffer mot α- og β-catenin og mus anti-β-aktin (klon C-15) var fra Sigma (St. Louis, MO). Monoklonale antistoffer mot E-cadherin (E-cad), α-catenin, β-catenin, sjenerøst gitt av legene. Johnson og Wheelock (Eppley Institute), er blitt beskrevet [25], [43], [44]. En kanin polyklonale anti-AR-reseptor-antistoff var fra Santa Cruz Biotech (sc-13062, San Diego, California). Celler (1,5 x 10
5), sådd ut i seks brønn klyngene som inneholder glass dekkglass og fikk vokse til tilnærmet 50% konfluens, ble immunfarget med forskjellige antistoffer som beskrevet [24], [25], [31], [ ,,,0],43] – [45]. Sekundære antistoffer (kanin eller mus), konjugert med Alexa 488 og Alexa 594, ble brukt som passer. Bilder av immunostained celler ble kjøpt med Leica DMRIE mikroskop (Leica Microsystems, Wetzler, Tyskland) utstyrt med Hamamatsu ORCA-ER2 CCD-kamera (Hamamatsu-City, Japan) og analysert ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare (Volocity, versjon 6.3, Impro, Inc; Perkin Elmer) som beskrevet [43] -. [45]
Stock Solutions
Syntetisk androgen Mibolerone (MB) og en naturlig androgen dihydro-testosteron (DHT), 1-25D, og Casodex ( Bicalutamide) ble kjøpt fra BIOMOL (ENZO Life Sciences, Inc., Farmingdale, New York). Stamløsninger av MB og DHT ble fremstilt ved 1 mM i etanol og lagret ved -20 ° C i små aliquoter beskyttet mot lys. Stamløsning av 1-25D (10 uM) ble fremstilt i etanol og lagret i alikvoter ved -80 ° C beskyttet mot lys. Stamløsning av Casodex (10 mM) ble fremstilt i DMSO og lagret i alikvoter ved -20 ° C. De ble passende fortynnet i mediet på tidspunktet for behandlingen. Alle forsøkene ble utført i gult lys, som beskrevet [36], [37].
Androgen Nedbrytning og andre behandlinger
Cellene ble utsådd i seks brønn klynger med glass dekkglass (1,5 x 10
5 celler per brønn) og i 6 cm (2 × 10
5 celler per parabol) og 10 cm retter (3,5 × 10
5 celler per parabol) i 2, 4 og 10 ml komplett medium hhv. Celler ble behandlet ved etterfylling av friskt medium inneholdende forskjellige reagenser i den ønskede konsentrasjon når de oppnådd 50% konfluens. Kontroller ble behandlet med etanol slik at sluttkonsentrasjonen av løsningsmidlet ikke overskred 0,1%. Når celler skulle dyrkes under androgen fattige betingelser, ble normal cellekulturmediet erstattet med androgen-fratatte cellekulturmedium (fenol-rød-fri RPMI inneholdende 5% trekull-strippet serum). Kontrollene fikk frisk fenol-rød-fritt medium inneholdende normalt serum. Vi brukte fenol-rød-free medium fordi fenol-rød er dokumentert å ha steroidogenic effekter på veksten av hormon-responsive cellelinjer, inkludert LNCaP [46], [47].
Western Blot analyse og vaskemiddel Løseligheten av Connexin32
Celler (5 x 10
5) ble utsådd i 10 cm skåler i replikere i 10 ml fullstendig medium og dyrket til konfluens i nærvær og fravær av forskjellige reagenser. Cellelyse, vaskemiddel-løselighet assay med 1% Triton X-100 (TX100) og ekspresjonsnivået av Cx32 ble analysert ved hjelp av Western blot-analyse, som beskrevet [25], [43], [44]. I korthet etter lyse i en buffer SSK (10 mM Tris, 1 mM EGTA, 1 mM PMSF, 10 mM NaF, 10 mM NEM, 10 mM Na
2VO
4, 10 mM jodacetamid, 1% TX100, pH 7.4 ), total, vaskemiddel-løselig og -insoluble ekstrakter ble separert ved ultrasentrifugering ved 100.000 x g i 60 min (35 000 rpm i analytisk Beckman ultrasentrifuge, Model 17-65 ved hjelp av en SW50.1 rotor). De detergent-uløselig pellet ble oppløst i buffer C (70 mM Tris /HCl, pH 6,8, 8 M urea, 10 mM NEM, 10 mM jodacetamid, 2,5% SDS, og 0,1 M DTT). Etter normalisering basert på celle nummer, ble de totale og TX100 løselige og -insoluble fraksjoner blandes med 4xSDS-ladningsbuffer til en endelig konsentrasjon på 1 x og inkubert ved romtemperatur i 1 time før SDS-PAGE-analyse. Blottene ble utviklet med C-Digit (Li-COR, Lincoln, Nebraska) bruker SuperSignal WestFemto maksimal følsomhet substrat (Thermo Scientific, Rockford, IL).
kommunikasjons Analyser
Gap junctional kommunikasjon ble analysert av microinjecting Lucifer Yellow (MW 443 Da; Lithium salt), Alexa Fluor 488 (MW 570 Da; A-10436), og Alexa Fluor 594 (MW 760 Da; A-10438) med Eppendorf InjectMan og FemtoJet mikroinjeksjon systemer (modeller 5271 og 5242, Brinkmann Instrument, Inc. Westbury, NY) montert på Leica DMIRE2 mikroskop. Etter å fange bilder av microinjected celler ved hjelp av CCD-kamera (Retiga 2000R, FAST 1394) bruker QCapture (British Columbia, Canada), permeabilitet av ulike fluorescerende tracere ble kvantifisert ved scoring antall fluorescerende celler på 1 min (Lucifer Yellow ), 3 minutter (Alexa 488) og 15 min (Alexa 594) etter mikroinjeksjon inn i testcellen som er beskrevet [22], [25], [43], [48].
Colony Forming and Cell Growth Assays
Celleveksten veksten~~POS=HEADCOMP ble bestemt enten ved kolonidannende analyse, eller ved å telle antallet celler som beskrevet [22], [48]. For kolonidannende analyse, 1 x 10
3-celler ble sådd ut i 6 cm skåler i tre eksemplarer i 3 ml dyrkningsmedium. Etter 24 timer, en ml medium inneholdende 1-25D, MB eller DHT ble tilsatt til retter for å gi den ønskede sluttkonsentrasjon. Celler ble dyrket i 21 dager, med en utskiftning av medium hver 4 dager inneholdende den passende konsentrasjon av de ovennevnte reagenser, når de er dannet synlige kolonier. Kolonier i rettene ble fiksert med 3,7% bufret formaldehyd, farget med 0,025% løsning av krystallfiolett i PBS, og fotograferte. For måling av cellevekst, 5 × 10
4 celler ble sådd i 6 cm retter i replikere og behandlet med 1-25D beskrevet ovenfor. Cellene fikk vokse i 10 dager med en middels endring på dag 5. Cellene ble trypsinert og telt i en hemocytometer.
Resultater
Vitamin D
3 Forbedrer Cx32 Expression nivå
Vi brukte LNCaP-32 celler som uttrykker retroviralt-omformet rotte Cx32 beskrevet tidligere [25], [31]. Vi har tidligere vist at i LNCaP-celler 32 androgener regulert dannelse av GJS, post-translasjonelt, ved regulering av ekspresjonsnivået av Cx32 ved å hemme erad-mediert degradering [25]. Våre etterfølgende studier viste at androgen-regulert nedbrytning av Cx32 ble opphevet ved all-trans retinsyre (ATRA) og 9-cis-retinoinsyre (9-CRA) [31]. Vi dermed rasjonaliserte at 1-25D kan fungere som ligner på Atrå og 9-CRA. Basert på tidligere studier som viser virkningen av vitamin D på LNCaP-cellevekst [10], [49] – [52], behandlet vi LNCaP-32 celler med forskjellige konsentrasjoner av 1-25D for å undersøke dets effekt på ekspresjonsnivået av Cx32 . Vi fant at 1-25D øket Cx32 ekspresjonsnivået i en doseavhengig måte (figur 1A). Signifikant forbedring ble observert selv ved en konsentrasjon så lav som 1 nM (figur 1B, venstre graf). Konsentrasjoner høyere enn 10 nM var giftig for disse cellene som vurderes av kolonidannelse analysen (upubliserte data). For senere undersøkelser vi valgte 10 nM 1-25D. Tidsforløpsstudier viste at en betydelig økning i Cx32 ekspresjonsnivået fant sted så tidlig som 12 timer etter behandling med 1-25D og nådde et platå etter 72 timer (figur 1CD, høyre graf). Effekten av 1-25D på Cx32 ekspresjonsnivået var like potent som av syntetisk androgen, MB, og 9-CRA. Dessuten, kombinert behandling med 1-25D og MB var mer effektive i å øke Cx32 ekspresjonsnivået (figur 2AB). Vitamin D
3 var tidligere blitt vist å påvirke ekspresjon av nivået av E-CAD, en bestanddel av protein adherens knutepunkter, i kolon kreftceller [33]. For å bestemme om 1-25D også påvirket ekspresjonsnivået av adherens koplings assosierte proteiner, målte vi ekspresjonsnivået av E-cad og dens tilknyttede proteiner a- og p-catenins 72 timer etter behandling med 1-25D. Resultatene viste at 1-25D hadde ingen effekt på ekspresjonsnivået av E-cad og a- og p-catenins (figur 2C). Som målt ved semi-kvantitativ RT-PCR-analyse, 1-25D hverken indusert ekspresjon av endogene Cx32 i LNCaP-P eller LNCaP-N-celler (data ikke vist) og heller ikke forandret ekspresjonsnivået av retroviralt-transkribert mRNA Cx32 i LNCaP-32 som dokumentert tidligere [25].
A. Doseavhengig forsterkning av Cx32 ekspresjonsnivået ved 1-25D behandling i 48 timer. B. Kvantitativ analyse av ekspresjonsnivået av dataene som er vist i A. Hver søyle representerer middelverdi og standardavvik av gjennomsnittet fra 4-17 eksperimenter. Legg merke til at betydelig forbedring er observert selv på 1 nM. Stjernene (**) indikerer P verdien av ≤0.0001. En to tailed Student
t
test ble brukt til å beregne P-verdi forutsatt ulik varians. C. Kinetikk for økning av Cx32 ekspresjonsnivået ved behandling med 1-25D (10 nM) i de angitte tidsrom. Merk at ekstrautstyret er observert så tidlig som 12 timer og platåer på 72 timer. D. Kvantitativ analyse av ekspresjonsnivået av dataene som er vist i C. Hver søyle representerer middelverdi og standardavvik av gjennomsnittet fra 3-11 eksperimenter. Stjernen (*) indikerer P verdien av ≤0.0016 og stjerner (**) angir P verdien av ≤0.0001. En to tailed Student
t
test ble brukt til å beregne P-verdi forutsatt ulik varians.
Cx32-uttrykke LNCaP-32 celler ble behandlet med den 1-25D, 9-CRA, DHT og MB som angitt. A. Kombinert behandling med 1-25D med MB eller 9-CRA er mer effektive i å øke Cx32 uttrykk nivå enn behandling med monoterapi alene. B. Kvantitativ analyse av ekspresjonsnivået av dataene som er vist i A. Hver søyle representerer middelverdi og standardavvik av gjennomsnittet fra 4-13 eksperimenter. Stjernene (**) indikerer P verdien av ≤0.0001. En to tailed Student
t
test ble brukt til å beregne P-verdi forutsatt ulik varians. C. Effekt av 1-25D på adherens koblings forbundet proteiner. Ekspresjon av adherens koplingsproteiner E-cadherin (E-CAD), α-catenin (α-katt), og β-catenin (β-cat) ble analysert ved hjelp av Western blot-analyse av totalt cellelysat (10 ug). Merk at det ikke er noen effekt.
Vitamin D
Assembly 3 Forbedrer Gap Junction og junctional Kommunikasjon
Vi neste undersøkt effekten av 1-25D på montering av Cx32 inn GJS. Vi har funnet at, samtidig med en økning i ekspresjonsnivået av Cx32, 1-25D økte også GJ sammenstilling som bedømt ved immunocytokjemisk analyse (figur 3A) og biokjemisk ved Western blot-analyse av total, TX100 løselige og -insoluble ekstraktene ved 48 t etter behandling (figur 3BC). Denne biokjemiske fremgangsmåten er basert på prinsippet om at CXS, som er innlemmet i GJS, blir uoppløselig i TX100 mens CXS som ikke er innlemmet i GJS forbli oppløselig [53]. Denne analysen er reproduserbart vist seg å måle montering av CXS inn GJS som dokumentert av tidligere studier [24], [25], [53]. Videre fant vi at forbedring av GJ forsamlingen ble ledsaget av en 2-3 ganger parallell økning i junctional kommunikasjon som bestemmes av junctional overføring av tre GJ gjennomtrengelig fluorescerende sporstoff, Lucifer Yellow (MW 443), Alexa 488 (MW 570), og Alexa 594 (MW 760). For eksempel, øket 1-25D junctional overføring av Alexa 594 ved 2-3 folder sammenlignet med kontroller (tabell 1). Effekten av 1-25D på junctional kommunikasjon var like potent som av syntetisk androgen, MB, og det naturlige androgen DHT (tabell 1). For å avgjøre om 1-25D påvirket montering av andre junctional komplekser, vi også undersøkt vaskemiddel-løseligheten av adherens og trange junction assosiert proteiner. Begrunnelsen for disse studiene var at E-cad har vist seg å lette montering av CXS inn GJS [43], [44], [54], og Cx uttrykk har vist seg å lette montering av tett veikryss og deres bestanddeler proteiner [39]. Vi fant at 1-25D hadde ingen effekt på løseligheten av E-cad og dens tilknyttede proteiner, α- og β-catenin, og tette forbindelses assosierte proteiner, ZO-1 og occludin, i TX-100 antyder at deres sammenstillingen var ikke ytterligere forbedret i respektive celle Forbindelsesstykke (figur 3B). Samlet utgjør disse data tyder på at 1-25D, som androgener og retinoider, forsterker uttrykket nivået av Cx32, og påfølgende montering i GJS, uten discernibly endre uttrykket nivået av andre cellekoblings forbundet proteiner.
LNCaP -32-celler, dyrket enten i seks brønn klynger eller 10 cm skåler, ble behandlet med 1-25D (10 nM), MB (5 nM), og 1-25D pluss MB i 48 timer. A. Montering av Cx32 (grønn) i GJS ble vurdert immunocytochemically. E-cad vises i rødt og kjernene er i blått. Bar = 20 mikrometer. Merk at GJ formasjonen ble forbedret ved behandling med 1-25D og MB. B. TX100- oppløselighet analyse ble anvendt for å måle sammensetningen av Cx32 inn i GJS, med stramme koblingstilknyttet protein, occludin (Occl) og ZO-1, og den adherens krysset protein, E-cadherin (E-CAD) og α-catenin (α-katt). T = total fraksjon; S = løselig fraksjon og I = Uløselig fraksjon. C. Kvantitativ analyse av uttrykket nivået av Cx32 vist i B. Hver søyle representerer middelverdi og standardavvik av gjennomsnittet fra 4-17 eksperimenter. Legg merke til at både det totale nivå og detergent-uoppløselige fraksjon av Cx32 økt betydelig. Hver søyle representerer middelverdi og standardavvik av gjennomsnittet fra 3-11 eksperimenter. Stjernen (*) indikerer P verdien av ≤0.0016 og stjerner (**) angir P verdien av ≤0.0001. En to tailed Student
t
test ble brukt til å beregne P-verdi forutsatt ulik varians. Merk fravær av effekt på adherens krysset forbundet proteiner, E-cad, og stram krysset assosiert protein, occludin (Occl).
Vitamin D
3 modulerer Androgen-regulert Dannelse og nedbrytning av gap veikryss
Tidligere studier med LNCaP-32 celler hadde vist at androgen utarming forårsaket degradering av Cx32 av erad, og at androgener forbedret GJ formasjon ved omruting den erad-målrettet pool av Cx32 til celleoverflaten , noe som gjør det mottagelig for GJ montering [25]. I senere studier, viste vi at androgen-regulert dannelse og nedbryting av GJS ble forhindret av 9-CRA og atras [31]. Vi rasjonaliserte at 1-25D kan forbedre GJ forsamlingen ved å redde den erad-målrettet pool av Cx32 som 9-CRA og Atrå. Derfor, undersøkte vi ekspresjonsnivået av Cx32 og dens montering til GJS på androgen uttømming i nærvær og fravær av 1-25D i LNCaP-32-celler. For disse studiene har vi brukt androgen-utarmet (trekull-strippet) og fenol-rødt-fritt celledyrkningsmedium for å dyrke celler fordi fenol-rødt har en svak effekt steroidogenic [46]. Som ble observert i våre tidligere studier [25], har vi funnet at androgen-uttømming ble redusert ekspresjonsnivået av Cx32 i løpet av 12 timer, noe som ikke bare er forhindret ved tilsetning av MB, men også ved 1-25D (figur 4AB). Dessuten, kombinert behandling med MB og 1-25D syntes å være mer effektive i å forbedre uttrykket nivået av Cx32 (figur 4A, øvre blot). Vi fant også at androgen uttømming redusert uttrykket nivået av AR, som også ble forhindret ved behandling med ikke bare androgener, men også med 1-25D (figur 4A, bunn blot). For å underbygge ovennevnte data, vi videre undersøkt dannelse av GJS immunocytochemically (figur 5A) og funksjonelt ved å måle junctional overføring av Lucifer Yellow, Alexa 488 og Alexa 594 (tabell 2). Resultatene viste at GJS var knapt observert i celler dyrket i androgen-utarmet medium som bestemt ved mangel på Cx32-spesifikk immunfarging ved celle-celle-kontaktområder, mens de lett ble observert når androgen-utarmet medium ble supplert med 1-25D og MB (figur 5A). Funksjonelle analyser viste at junctional overføring av Lucifer gult, Alexa 488 og Alexa 594 sank signifikant ved androgen uttømming, som ble forhindret ved påfylling av androgen-utarmet medium med MB og 1-25D (tabell 2), noe som underbygger de immunocytokjemiske dataene.
LNCaP-32 celler, seeded i 10 cm retter, ble byttet til kull-strippet (androgen-utarmet) medium (ST). Ekspresjonsnivået av Cx32 og AR ble bestemt ved Western blot-analyse (A) i nærvær og fravær av 1-25D (10 nM) og MB (5 nM). Merk at Cx32 og AR blir degradert på androgen bruk og forringelse blokkert på 1-25D behandling. BC. Kvantitative analyser av ekspresjonsnivået av Cx32 (B) og AR (C) av de data som er vist i A. Hver søyle representerer middelverdi og standardavvik av gjennomsnittet fra 5-11 eksperimenter. Stjernene (**) indikerer P verdien av ≤0.0001. En to tailed Student
t
test ble brukt til å beregne P-verdi forutsatt ulik varians.
LNCaP-32 celler, seedet i seks brønnklynger eller 10 cm retter, ble byttet til kull -stripped, androgen-utarmet medium (ST). GJ montering og ekspresjonsnivået av Cx32 ble bestemt ved immunocytokjemisk (A) og Western blot (B) analyser av TX100-løselighet assay i nærvær og fravær av 1-25D (10 nM) og MB (2,5 nM). In (A), er Cx32 i grønt og E-cad er rød og kjerner (blå) er farget med DAPI. Scale bar i A = 20 mikrometer. I (B), T = total fraksjon; S = løselig fraksjon og I = Uløselig fraksjon. TX100-løselige og uløselige fraksjoner, samt immunocytokjemisk analyse ble utført 24 timer etter stripping, som beskrevet i Materialer og Metoder. Merk at GJS brytes ned på androgen bruk og forringelse blokkert på 1-25D behandling (A). Merk også at TX100 løselige fraksjon av E-cad (E-cad), β-catenin (β-katt) og ZO-en ikke er berørt. Merk også at androgen-uttømming øker den oppløselige fraksjon av occludin (B) uten å påvirke den totale occludin nivåene som kvantifisert i D. Stjernen (*) indikerer P-verdi av ≤0.0016 og stjerne (**) indikerer P-verdi av ≤0.0001. En to tailed Student
t
test ble brukt til å beregne P-verdi forutsatt ulik varians.
immunocytokjemiske og junctional overføre data ble ytterligere bekreftet av TX100-løselighet assay ( Figur 5BC). Vi undersøkte også effekten av androgen-utarming på vaskemiddel-oppløseligheten av E-cad og β-catenin og stramme-kryss-assosierte proteiner, ZO-1 og occludin. I samsvar med våre tidligere studier [25], viste resultatene at androgen utarming økte vaskemiddel-løseligheten av occludin men ikke fra ZO-1 og E-cad og β-catenin (figur 5BD). Vi undersøkte også effekten av MB og 1-25D enten alene eller i kombinasjon på dannelsen av GJS i foreldre LNCaP-P og G418-resistente LNCaP-N celler, og fant at de hadde ingen effekt (data ikke vist). Sammen er disse data tyder på at 1-25D hindrer androgen-regulert nedbrytning av Cx32 og forbedrer GJ formasjonen i LNCaP-32 celler. Fordi kombinert behandling med androgener og 1-25D ikke forbedre GJ montering videre, er det sannsynlig at forsamlingen ble forsterket ved å redde den samme pool av Cx32 som ble målrettet for erad på androgen uttømming. Videre, som ble observert i våre tidligere studier, montering og vaskemiddel-løseligheten av Cx32 og occludin inn celle veikryss, eller vice versa, ser ut til å være regulert coordinately [25].
1-25D Forbedrer Gap Junction Formation uavhengig av androgen Receptor Funksjon
Våre data viste at 1-25D hindret nedbrytning av AR på androgen mangel (figur 4A, bunn blot). Også behandling av LNCaP-celler med 1-25D hadde blitt vist å forbedre AR ekspresjonsnivået [40]. Således, vurderte vi muligheten for at virkningen av 1-25D på forbedring av GJ enheten avhengig av funksjonen til AR alene – og ikke på den uavhengige virkning av 1-25D. For å teste denne forestillingen, behandlet vi LNCaP-32 celler med anti-androgen, Casodex (Bicalutamide), for å blokkere androgen action [55], [56]. Både androgen uttømming og behandling med Casodex forårsaket degradering av AR (figur 6A, øvre blot, figur 6B) og opphevet virkningen av MB og DHT på Cx32 ekspresjon nivå (figur 6A, bunn-blot, figur 6B) som ble observert i våre tidligere studier [25], [31]. Imidlertid har vi funnet at Casodex hadde ingen effekt på forbedring av ekspresjonsnivået av Cx32 som følge av behandling med 1-25D i androgen-utarmet medium (figur 6AB). For å underbygge disse dataene, vi neste undersøkt dannelse av GJS immunocytochemically i celler behandlet med Casodex i nærvær og fravær av MB eller 1-25D. Vi har funnet at GJS ikke ble dannet når cellene ble behandlet med Casodex i normalt serum eller i androgen-utarmet medium inneholdende MB som ble observert i våre tidligere studier (figur 7) [25], [31]. På den annen side har vi funnet at GJS ble dannet rikelig når cellene ble behandlet med Casodex og 1-25D (figur 7). Til sammen tyder disse data på at mekanismen ved hvilken 1-25D hindrer nedbrytning av Cx32 og forbedrer GJ dannelse på androgen uttømming er uavhengig av AR.
LNCaP-32-celler, sådd i 6-cm skåler, ble dyrket 70% samløpet. Cellene ble deretter dyrket i ytterligere 24 timer i vanlig medium (NS), androgen-utarmet medium alene (ST), normalt serum supplert med Casodex (CDX; NS + CDX), androgen-utarmet medium supplert med MB (ST + MB), MB og Casodex (ST + MB + CDX), 1-25D (ST + 1-25D), 1-25D og Casodex (ST + 1-25D + CDX) og i normal serum med 1-25D (NS + 1-25D ).
