Abstract
Epibrassinolide (EBR) er et polyhydroksylert sterol derivat og biologisk aktive forbindelse av brassinosteroids. I tillegg til godt beskrevne roller i plantevekst, induserer EBR apoptose i prostatakreft LNCaP-celler som uttrykker funksjonell androgenreseptoren (AR). Derfor er det foreslått at EBR kan ha en hemmende potensialet på androgen reseptor signalveien. Imidlertid er mekanismen ved hvilken EBR utøver sin virkning på LNCaP dårlig forstått. For å dekke dette gapet i kunnskap, brukte vi en upartisk global proteomikk tilnærming, dvs. stabil-isotop merking av aminosyrer i cellekultur (SILAC). I alt ble 964 unike proteiner identifisert, 160 av disse ble uttrykt forskjellig etter 12 timers EBR behandling. Kvantifiseringen av de differensielt uttrykte proteiner avslørte at ekspresjonen av den ufoldede protein respons (UPR) anstand protein, calreticulin (CALR), ble dramatisk nedregulert. Nedgangen i CALR uttrykk ble også validert av immunoblotting. Fordi våre data viste involvering av UPR som respons på EBR eksponering, vurderte vi uttrykk for de andre UPR proteiner. Vi viste at EBR behandling downregulated calnexin og oppregulert BIP og IRE1α uttrykk nivåer og indusert CHOP trans fra cytoplasma til kjernen. Den translokasjon av CHOP ble forbundet med caspase-9 og caspase-3-aktivering etter en 12 timers EBR behandling. Samtidig behandling av EBR med rapamycin, en oppstrøms mTOR-reaksjonsveiinhibitor, hindres EBR-indusert celle-levedyktighet tap og PARP-spaltning i LNCaP prostatakreftceller, tyder på at EBR kan indusere ER stress i disse cellene. I tillegg observerte vi lignende resultater i DU145 celler med ikke-funksjonelle androgen reseptor. Når proteasomal degradering av proteiner ble blokkert av MG132 co-behandling, EBR behandling ytterligere indusert PARP cleavage forhold til medikamentell behandling alene. EBR også indusert Ca
2 + beslaglegging, som bekreftet endring av ER veien på grunn av medikamentell behandling. Derfor foreslår vi at EBR fremmer ER stress og induserer apoptose
Citation. Obakan P, Barrero C, Coker-Gurkan A, Arisan ED, Merali S, Palavan-Unsal N (2015) SILAC basert massespektrometri analyse viser at Epibrassinolide induserer apoptose via aktivering endoplasmic nettet Stress i prostata kreft celler. PLoS ONE 10 (9): e0135788. doi: 10,1371 /journal.pone.0135788
Redaktør: Mohammad Saleem, Hormel Institute, University of Minnesota, USA
mottatt: 04.08.2014; Godkjent: 27 juli 2015; Publisert: 09.09.2015
Copyright: © 2015 Obakan et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:.. Denne studien ble støttet av Istanbul Kultur universitetets vitenskapelige prosjekter Support Center og Temple University Fels Institute of Cancer og molekylærbiologi Institutt ved å bruke sine egne ressurser
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Brassinosteroids (BRS) er steroid-avledet molekyler med mange fysiologiske effekter, inkludert regulering av hormon balanse, aktivering av protein og nukleinsyre-syntese, enzymatisk aktivitet, cellesyklus og cellevekst [1, 2]. Foruten de godt beskrevet effekter i planter, er deres roller i pattedyrceller dårlig forstått, og for tiden under etterforskning som anti-kreft agenter [3-5]. Den nylige forståelse er at EBR, et medlem av BRS, induserer apoptose mer effektivt i atom hormon reseptor (NHR) -expressing kreftcellelinjer, slik som LNCaP prostata [med androgen reseptor (AR)] [4] eller MCF-7 bryst kreft cellelinjer [med østrogenreseptor (ER)] [3]. Den strukturelle likheten av EBR med pattedyr-steroider [6] har vært foreslått som mulig årsak til den hormonelle spesifisitet. Imidlertid har det molekylære grunnlag for EBR spesifisiteten ikke blitt klarlagt. Vår tidligere erfaring viste at selv om EBR (25 uM) var en sterk apoptotisk inducer i LNCaP (AR +) prostatakreftceller, det var også overraskende effektive i indusering av apoptose i DU-145 (Ar) celler. Viktigere EBR behandling ble ikke cytotoksiske for PNT1a normale prostata epitelceller [4]. For bedre å klargjøre det terapeutiske potensialet i EBR undersøkte vi hele proteomet av LNCaP celler med eller uten EBR behandling.
Bruk av kvantitative proteomikk tilnærminger er sannsynlig å gi informasjon om viktige molekylære signaturer og detaljert forståelse av de involverte målene [7]. SILAC (stabile isotoper Merking av aminosyrer i cellekultur) analyse er en massespektroskopi (MS) -Kombinert proteomikk tilnærming uten radioaktiv merking. SILAC er avhengig av inkorporering av en gitt «lys» (
12C-merket L-lysin eller L-arginin) eller «tung» (
13C-merket L-lysin eller L-arginin) formen av aminosyren inn i det proteiner. Etter et antall av celledelinger, er hver spesiell aminosyre erstattes av en isotop analoge og innlemmet i de nylig syntetiserte proteiner [8]. I denne studien har vi brukt SILAC tilnærming til å utforske nye apoptotiske potensialet i EBR i androgen responsive LNCaP prostata kreft celler.
Vi observerte at EBR betydelig påvirket uttrykket profilen til 160 proteiner som involverer i ulike cellulære funksjoner (celle cytoskjelett, nukleinsyre og energimetabolisme, celledød og protein ubiquitinering) sammenlignet med ubehandlede kontrollprøver. Endoplasmatiske retikulum (ER) bosatt calreticulin (CALR), en anstand protein, var signifikant nedregulert blant de 160 proteiner. Vi har fastslått at nivåene av ER stress proteinene ble endret etter EBR behandling i LNCaP AR (+), og den samme profilen ble også observert i den ikke-funksjonelle AR-uttrykkende DU145 prostatakreft-cellelinje. Endringer i ER stress biomarkører utløses apoptose i hver cellelinje; i LNCaP-celler, ble apoptose indusert ved CHOP transaktivering og translokasjon til kjernen. Tilsetningen av rapamycin, som en translatorisk repressor av mTOR (mammalian target rapamycin), eller MG132, en proteasominhibitor som reduserer nedbrytningen av ubiquitin-konjugerte proteiner, endret EBR-indusert apoptose, hvilket antyder at ER stress ble aktivert følgende EBR behandling i LNCaP celler. For å bevise forholdet mellom ER-mediert celledød mekanisme etter EBR behandling, ble CALR plasmid transfeksjon utført. EBR-indusert celle levedyktighet tapet ble forhindret i CALR + LNCaP celler. I tillegg, når CALR + LNCaP celler ble behandlet med EBR, vi ikke observere ER stress mediert apoptotisk induksjon, noe som tyder på at CALR er et viktig mål for EBR.
Materialer og metoder
Kjemi og antistoffer
Heavy lysin og arginin [(13C6, 15N2) -L-lysin og (13C6) -L-arginin] ble oppnådd fra Cambridge Isotope (Andover, MA); lys aminosyrer (L-lysin og L-arginin) ble oppnådd fra Sigma (St, Louis, MO). Den protease-inhibitor cocktail ble oppnådd fra Sigma (St, Louis, MO). Antistoffene mot ER stress (BIP, CALNX, CALR, hogge, IRE1α, Perk, ATF4, ATF6 og PDI) og apoptose (caspase-12, caspase-3, caspase-9 og PARP) ble hentet fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Tunicamycin ble kjøpt fra Sigma (St, Louis, MO) og ble oppløst i DMSO (10 mg /ml). Den pmCherry-merket CHOP plasmid ble kjøpt fra Addgene (CHOP promoter (-649 /+ 136) pmCherry-1, 36035). Kalsium grønt fargestoff for å bestemme den intracellulære Ca
2 + nivåer ble kjøpt fra Molecular Probes (Eugene, Oregon, USA). Rapamycin og MG132 ble kjøpt fra Tocris (Ellisville, MI, USA) og Sigma (St Louis, MO), henholdsvis.
Cell kultur
LNCaP (CRL-1740) og DU 145 ( HTB-81) humane prostatacancercellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC). HEK-293 (CRL-1573) celler ble anvendt for villtype CALR mRNA isolert og erholdt fra ATCC. Celler ble dyrket i DMEM-medium (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), supplert med 10% føtalt bovint serum (PAN Biotech, Aidenbach, Tyskland) og 10 000 U penicillin /ml og 10 mg streptomycin /ml (PAN Biotech, Aidenbach , Tyskland). Cellene ble dyrket ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 inkubator (HERAcell 150; Thermo Electron Corporation, Waltham, MA, USA).
Cell kultur i SILAC media
SILAC DMEM (Pierce Bioteknologi) ble supplert med 10% dialysert føtalt bovint serum (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), 1% streptomycin /penicillin. Den tunge medium ble supplert med
13C
6 L-arginin og
13C
6
15N
2-L-lysin. Lyset medium ble supplert med normal L-arginin og L-lysin. For SILAC eksperimenter ble LNCaP-celler dyrket i parallell i enten lette eller tunge media i 5 dager, med media erstattet hver 24 timer.
1 D-SDS-PAGE separasjon og in-gel trypsin fordøyelse
av totalt celleprotein ble isolert fra LNCaP-celler ved bruk av RIPA-buffer (25 mM Tris-HCl pH 7,6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% natriumdeoksycholat, 0,1% SDS). Protein kvantifisering ble utført i henhold til Bradford fremgangsmåten (Bio-Rad Protein Assay) [9]. Prøver inneholdende en kombinert 40 ug totalt protein (20 ug » tung «og 20 pg » light») ble fortynnet med Laemmli-prøvebuffer (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) inneholdende 5% β-merkaptoetanol. Blandingen ble deretter oppvarmet i 5 minutter ved 90 ° C og fylt på 10% polyakrylamid gels.1-D-SDS-PAGE separasjon ble utført med mini Protean II-system (Bio-Rad) ved 200 V i 45 minutter. Bånd ble visualisert med Simply Blue Sikker Stain (Life Technologies, CA, USA), og baner ble skåret i 12 deler, som ble terninger inn ~ 1×1 mm firkanter. Etter distaining med 50% volum /volum acetonitril (ACN) i 25 mM ammoniumbikarbonat buffer (bikarbonat-buffer), ble proteiner i gelbitene redusert med 10 mM ditiotreitol (DTT) i bikarbonatbuffer og alkylert ved inkubasjon med 50 mM jodacetamid i bikarbonatbuffer . Etter gel dehydrering med 100% ACN, ble gelbitene dekket med ca 50 ul av 12,5 ug /ml trypsin i bikarbonat-buffer for i-gel fordøyelse. Inkubasjon for fordøyelse ble utført ved 37 ° C i 12 timer. Trypsin ble inaktivert med maursyre ved 2% sluttvolum, og peptider ble hentet ut og rengjøres med en C18 Tips kolonne (ZipTips, Millipore, Medford, MA, USA), som tidligere beskrevet [10].
GeLC- MS /MS og dataanalyse
peptider ble tørket i en vakuumsentrifuge og resuspendert i 20 mL av 0,1% volum /volum trifluoreddiksyre (TFA) /H
2O. Peptidprøver ble lastet opp på to-mikrogram kapasitet peptid feller (CapTrap, Michrom-ressurser BIO) og separert ved hjelp av en C18 kapillær kolonne (15 cm 75 mm, Agilent) med en Agilent 1100 LC pumpe levere mobile fasen på 300 nl /min. Gradienteluering ved bruk av mobile faser A (1% ACN /0,1% maursyre, resten H
2o) og B (80% ACN /0,1% maursyre, resten H
2o) var som følger (prosentandeler for B, balansen A): lineær fra 0 til 15% på 10 min, lineær til 60% ved 60 minutter, lineær til 100% ved 65 min. Nano ESI MS /MS ble utført ved anvendelse av en HCT Ultra ion trap mass spektrometer (Bruker). ESI ble levert med en distal-belegg spray Silica tips (id 20 mikrometer, tips indre id 10 mikrometer, New Mål, Ringoes, NJ). Massespektra ble kjøpt i positiv ion modus, kapillær spenning på -1100 V og aktiv ion ladekontroll felle skanning 300-1500 m /z; ved hjelp av en automatisk veksling mellom MS og MS /MS-moduser, ble MS /MS fragmentering utført på de to mest tallrike ioner på hvert spektrum bruker kollisjon indusert dissosiasjon med aktiv utelukkelse (ekskludert etter to spektra og løslatt etter 2 min). Det komplette systemet ble fullt kontrollert av Hystar 3.2 software.
Masse spektra databehandling ble utført ved hjelp av Mascot Distiller (versjon 2.4.3.3) med søk og kvantiteringsstandarder verktøykasse alternativer. Den genererte de-isotoped topp listen ble sendt til en in-house Mascot server 2.4.0 for å søke mot SwissProt databaseversjonen 2013_01 (538849 sekvenser; 191337357 rester). Mascot søkeparametere ble satt som følger: arter, Homo sapiens (20,233 sekvenser); enzym, trypsin med maksimal to savnet cleavage; fast modifikasjon: cystein carbamidomethylation; variable modifikasjoner: metionin oksidasjon, Gln- pyro-Glu (N-term Q), Glu- pyro-Glu (N-term E), Label: 13C (6) 15N (2) (K), og Label : 13C (6) (R); 0,90-Da masse toleranse for forløper peptid ioner; og 0,6 Da for MS /MS-fragmentioner. SILAC kvantifisering ble utført i Mascot Distiller bruker SILAC K + 8 R + 6 kvantifisering metoden; SILAC forholdstall for tunge og lette peptid parene ble beregnet ved hjelp av Simpsons integrasjonsmetoden, minimum ett peptid med unik sekvens og 0,05 betydelig terskel. Følgende kriterier ble brukt for å evaluere protein identifikasjon: en eller flere unike peptider med ion poengsum ≥45 og to eller flere unike peptider med ion poengsum ≥30 (p 0,05 terskel); proteiner identifisert ble hentet ved hjelp av MS data gruvearbeider (MDM) [11]. Kvantifiserte proteiner med ≥ 2 og ≤ 0,5 ganger endring ble valgt ut og gruppert etter biologiske funksjoner, sti og nettverksanalyse ved hjelp av oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA) programvare (www.ingenuity.com) for bioinformatikk analyse.
Bygging av p-EGFP CALR plasmid
Total RNA ble isolert fra HEK-293 humane embryonale nyreceller ved hjelp TRIPure (Roche) i henhold til produsentens angivelser. Første kjede-cDNA ble transkribert ved bruk av iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad). CALR cDNA ble amplifisert ved anvendelse utformet CALR genspesifikke klonings primere: 5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3 «; omvendt, 5»-GCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3 «. Protokollen inkluderte en innledende denatureringstrinn ved 94 ° C i 3 minutter, etterfulgt av 30 sykluser med 30 sek. av denaturering ved 94 ° C, 30 sek av hybridisering ved 55 ° C og 45 sek. av forlengelse ved 72 ° C, etterfulgt av en avsluttende forlengelsestrinn 72 ° C i 10 min. Ti mikroliter av PCR-produktet og 1 ug pEGF-LC3.1 plasmider ble spaltet med 10 U /pl EcoRI og Bglll (Fermentas, St. Leon-Rot, Tyskland) i 30 minutter ved 37 ° C. Fordøyelsen produktene ble utsatt for 1.5% agarosegel-elektroforese, og deretter ekstraheres fra agarosegel. Ligering av PCR-produktet: plasmid ble fremstilt ved anvendelse av 1: 1, 1: 3 og 1: 5-forhold med T4 DNA-ligase (Fermentas, St. Leon-Rot, Tyskland). Rekombinant DNA ble forvandlet til HB101 celler som ble utarbeidet ved hjelp av CaCl
2-metoden. Positive kloner ble utvalgt ved hjelp av ampicillin (Amp) LB-agarplater. Alle kolonier ble plukket og dyrket i 1 ml Amp + LB og inkubert over natten ved 37 ° C. Plasmider fra hver koloni ble isolert ved hjelp QIAPrep Spin miniprepp kolonner (Qiagen, Valencia, CA, USA). Plasmider fra utvalgte ti kolonier ble anvendt som templater for å forsterke den CALR-genet ved hjelp av klonings primere i PCR. En som er valgt amplifisert positiv plasmid ble sekvensert for å bekrefte den åpne leseramme (ORF) av den EGF-CALR fusjonsgenet (İontek, Tyrkia). Den sekvens rekombinante plasmid ble anvendt for overekspresjon forsøkene.
Transient transfeksjon av pEGFP-CALR plasmid
LNCaP-celler ble sådd ut over natten på 6-brønners plater ved en densitet på 3×10
5 celler /brønn. Omtrent 1 pg /pl pCMV-CALR i nærvær av transfeksjon reagens (Fugene HD, Roche, Mannheim, Tyskland) ble fremstilt i serumfritt medium. Blandingen ble inkubert i 15 minutter ved romtemperatur og forsiktig tilsatt dråpevis til cellene. Etter 48-h plasmid transfeksjon ble cellene behandlet med 25 mikrometer EBR, og total RNA ble isolert for CALR uttrykk analyse eller protein utvinning for western blotting.
Transient transfeksjon av CHOP promoter (-649 /+ 136) pmCherry -1 plasmid
for å bestemme aktiviteten til CHOP ble LNCaP celler transfektert med reporteren konstruere CHOP promoter (-649 /+ 136) pmCherry-en (Addgene plasmid 36035) med Fugene HD i henhold til produsentens instruksjoner ( Roche, Mannheim, Tyskland), og kloner motstandsdyktig mot kanamycin (500 mikrogram /ml Sigma, St. Louis, MO, USA) ble generert.
Evaluering av apoptotisk celledød ved Annexin V-FITC flekker
LNCaP celler ble sådd i 6 brønners plater (3×10
5 celler /brønn) og behandlet med 25 mikrometer EBR i 24 timer. Både flytende og adherente celler ble oppsamlet, resuspendert i Annexin V bindingsbuffer og inkubert med Annexin V-FITC og PI å følge produsentens instruksjoner (BD Biosciences, Bedford, MA). Ett tusen hendelser per prøve ble ervervet på Accuri C6 (BD Biosciences). Fluorescens utslipp ble samlet gjennom 530 nm og 570 nm-band-pass filter for FITC og PI, henholdsvis. Data er presentert som dot plots (Annexin fluorescens på x-aksen; PI fluorescens på y-aksen). Tallene som finnes i de fire kvadrantene representerer prosentandelen av levedyktige (nederst til venstre), nekrotisk (øverst til venstre), tidlig apoptotisk (nederst til høyre), og sent apoptotisk (øverst til høyre) celler evaluert ved bruk av BD Accuri C6 programvare (BD Biosciences).
Western-blot-analyse
Cellene ble dyrket i 60 mm Petri-skåler i komplett medium. Mediene ble fjernet, og cellene ble vasket med iskald 1 x PBS og lysert med ProteoJET pattedyrcellelyseringsbuffer (Fermentas, St. Leon-Rot, Tyskland). Total proteinnivåer ble bestemt ved anvendelse av Bradford fremgangsmåten (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) [9]. Totalt cellelysater ble atskilt med 12% SDS-PAGE-geler og elektrooverført på polyvinylidenedifluoride (PVDF) membraner (Roche, Mannheim, Tyskland) utsatt for elektroforese. Membranene ble vasket i tris-bufret saltvann med Tween-20 (TBS-T) [10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 0,05% Tween-20] (Tween 20, Sigma Ultra, St. Louis, MO, USA). Membranene ble blokkert i 5% skummet melk inneholdende TBS-T melk over natten ved 4 ° C. PVDF membraner ble inkubert med buffer som inneholder 5% (v: v) skummet melk løsning med egnede antistoffer CALR, CALNX, BIP IRE1α, CHOP, ATF4, ATF6, ekstra fordel, PDI, caspase 12, kløyvde caspase 9, caspase 3, PARP, spaltede PARP, β-aktin (hver fortynnet 1: 1000) og inkubert ved 4 ° C over natten. Anti-kanin sekundært antistoff ble fremstilt 1: 1000 fortynning i 5% (v: v) skummet melk løsning (CST, Denvers, MA, USA). Membranene ble skylt med TBS-Tween 20 og inkubert med HRP-konjugerte sekundære antistoffer ved 4 ° C over natten. Etter tilsetning av forsterket kjemiluminescens-reagens, ble signalene fra de HRP-koblet antistoff detektert ved bruk av ChemiDoc MP bildebehandlingssystem (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Alle resultater ble replikert minst tre ganger og representasjons blotter ble gitt.
Måling av intracellulær Ca
2 + nivåer
LNCaP prostata kreft celler ble behandlet med EBR for 12 timer, og intracellulær Ca
2 + nivåer ble bestemt av kalsium green-en (1 mikromol /L, molekylære prober, Eugene, OR, USA) flekker i 30 minutter. Flowcytometrisk analyse av fargede celler ble utført med et flowcytometer Accuri C6 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Kalsium grønne-en-fargede celler ble observert av fluorescens mikroskopi (eksitasjon 506 nm, emisjon: 531 nm).
Statistisk analyse
Statistisk signifikans ble vurdert ved hjelp av ensidige uparet t-test . P 0,05 ble tatt som et signifikansnivå. Western blot resultater ble gjentatt minst tre ganger. Band intensiteter ble kvantifisert ved hjelp ImageJ programvare og normalisert til p-aktin.
Resultater
Proteome av EBR-behandlede LNCaP celler
For å få et globalt perspektiv av endringer i hele proteom-, LNCaP-celler ble behandlet med EBR (25 uM) og underkastet SILAC behandling. I alt ble 964 unike proteiner identifisert med denne teknikken. Endringer større enn 2 ganger (≥ 2 og ≤ 0,5) mellom lette og tunge proteiner ble betraktet som signifikant i henhold til konsentrasjon av tidligere studier [10]. Kvantitativ analyse mellom sammenkoblede prøvene viste at blant de 964 proteiner, ble 160 vesentlig endret etter 12 timer EBR behandling (S1 tabell).
Funksjonell karakterisering av identifiserte proteiner og bioinformatikk analyse
Vi neste analysert 160 differensielt uttrykte proteiner med hensyn på biologisk funksjon, sti og nettverk ved hjelp av IPA-programvare. Som vist i figur 1, i henhold til den biologiske funksjonsanalyse, EBR-endrede proteiner har funksjoner i cellevekst og proliferasjon (16,6%), celledød og overlevelse (14%), mobilenheten og organisasjon (13,3%), cellulær funksjon og vedlikehold (13,3%), nucleic acid metabolism (5%), DNA-replikasjon (4%), proteinsyntese og folding protein (3,7 og 1%, henholdsvis) (figur 1). Analysen av kanoniske baner (p ≤ 0,05) identifisert aldosteron signalering i epitel-celler, så vel som cellulære metabolske baner (inkludert UDP-N-acetyl-D-galaktosamin-biosyntese, glukoneogenese, fettsyre biosyntese, protein ubiquitinering vei, cytoskjelettet signalering og andre) (fig 2). CALR viste en betydelig endring etter 12 timer EBR behandling med resultatet 150, 11 kamper, en tung /lett forholdet mellom 0.4372 og 4 peptider (S1 Table). I tillegg i henhold til de molekylene som er knyttet til SILAC analyseresultatene CALR ble nedregulert med 2,287 sammenlignet med kontrollprøver (tabell 1).
sektordiagram presenterer de 160 differensielt uttrykte proteiner.
grafen representerer vertscellefunksjoner med høyest score (y-aksen) basert på antall forskjellig regulert proteiner. Gjengitt fra oppfinnsomhet Pathways Analyse under en CC BY-lisens, med tillatelse fra Qiagen Silicon Valley, original copyright 2000-2013.
EBR-indusert modulering av CALR uttrykk
Forskjellig uttrykte proteiner følgende EBR behandling ble kartlagt til 7 spesifikke funksjonelle nettverk med hvert nettverk som inneholder 11 eller flere «fokus» medlemmer. Nettverkene av interesse samsvarer celledød og overlevelse, cellular montering og organisasjon, mobilnettet kompromiss, cellular funksjon og vedlikehold, legemiddelmetabolisme, lipidmetabolisme, celle morfologi og cellulær funksjon. CALR ble funnet en hovedproteinet i den cellulære responsen, cellulær montering og organisering nettverk (fig 3A). Fordi CALR er en anstand protein og fordi endringer i CALR uttrykk fører til utfoldet protein respons og ER stress, vi har oppdaget interaksjoner av CALR med andre molekyler til å oppdage tegn på UPR følgende EBR behandling i LNCaP prostatakreftceller. Mens vi kjører IPA for sti analyse etter EBR behandling, spådde systemet som heat shock anstand protein familie kanskje også vært involvert i EBR-indusert spenningsforholdene som vist i figur 3B. I tillegg IPA sammenligning av EBR virkning med andre kjente anticancermidler som forårsaker lignende effekter, indikerte at EBR kan virke som en ER stress-indus som tunicamycin og er i stand til å endre varmesjokkproteiner og CALR (figur 3C).
A) Rød, oppregulert proteiner; grønne, betydelig nedregulert proteiner; hvit, proteiner som er kjent for å være i nettverket, men ikke identifisert i vår undersøkelse. Fargedybden angir størrelsen av endringen i proteinet ekspresjonsnivåer. Figurene er en indikasjon på molekyl klasse (dvs. protein familien). B) IPA som viser banene kan involvere i EBR-induserte cellulære forandringer, C. tunicamycin, som et anticancermiddel som forårsaker en tilsvarende effekt. Linjer som kobler molekylene indikere molekylære relasjoner. De pilstiler indikere spesifikke molekylære relasjoner og retningen på samspillet. Gjengitt fra oppfinnsomhet Pathways Analyse under en CC BY-lisens, med tillatelse fra Qiagen Silicon Valley, original copyright 2000-2013.
Validering av protein identifikasjon og kvantifisering
Fordi protein interaksjon nettverk og sti analyse avslørte endring av UPR respons i prostata kreft celler eksponert for EBR, vi neste fastsatte uttrykket nivåer av andre UPR proteiner ved Western blotting. Vi bekreftet at endringene i prosenter av CALR i LNCaP cellene var i samsvar med de avledet fra SILAC studier (fig 4A, venstre panel). Som vist i figur 4, selv om EBR behandling downregulated ekspresjonsnivået av CALNX, ble den molekylære anstand BiP oppregulert. En overdreven opphopning av misfoldede proteiner i ER utløser dissosiasjon fra BiP fra ER membran ligger reseptorer som IRE1α, PERK og ATF6 som en betydelig ER stressrespons. Etter avtale med den endrede BiP uttrykk profil, ble IRE1α, PERK og ATF6 oppregulert etter EBR behandling i LNCaP celler (figur 4A, venstre panel). Vi har også bestemt uttrykket nivåer av andre ER stressrelaterte proteiner som CHOP, ATF4 og PDI i den totale proteinlysatene. Vi har observert at eksponeringen av LNCaP-celler til EBR øket ekspresjon av CHOP i begge cytoplasmiske og kjernefraksjoner (figur 4C). Interessant, PDI, en stress-protein rikelig i ER, ikke forhøyet i respons til EBR behandling. Overdreven og langvarig ER stress utløser apoptose. I overensstemmelse med dette funn EBR tidsavhengig aktivert kaspase-12, caspase-9 og caspase-3 og indusert spaltning av PARP (figur 4A, venstre panel). Lignende resultater ble observert i DU145 prostatakreftceller eksponert for EBR (figur 4A, høyre panel). Annexin-V /PI fargingsresultater bekrefter at EBR indusert apoptose i LNCaP-celler (figur 4B). Disse resultatene indikerer at EBR indusert apoptose via UPR akse i begge prostatakreftceller, uavhengig av den funksjonelle ekspresjon AR.
A) Totalt protein ble isolert etter EBR behandling, og uttrykket profiler av ER stress biomarkører, og kaspasene PARP-spaltning ble bestemt ved immunoblotting ved anvendelse av passende antistoffer. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. B) Omtrent 2 x 10
5 celler ble sådd inn i en seks-brønners plate og behandlet med EBR etter 12 og 24 timer. Annexin V-PI farging ble utført for å bestemme apoptotiske cellepopulasjoner. Fluorescens-signaler fra Annexin V-FITC og fra PI er rapportert på henholdsvis x-aksen og y-aksen. Tall som presenteres i de fire kvadrantene representerer prosentandelen av levedyktige (nederst til venstre), nekrotisk (øverst til venstre), tidlig apoptotisk (nederst til høyre) og sen apoptotisk (øverst til høyre) celler. C) Ved å følge 12-h EBR behandling, cytosoliske og kjerneproteiner ble isolert og separert på en 12% SDS-gel, overført til en PVDF-membran og blottet med et anti-CHOP antistoff. D) LNCaP-celler ble transfektert med reporter-konstruksjonen CHOP promoter (-649 /+ 136) pmCherry-1. Chop aktivering ble visualisert med fluorescens mikroskopi. Eksitasjon: 575 nm Emisjon: 601.
For å sjekke at resultatet av EBR-indusert apoptose var knyttet til UPR, LNCaP celler ble transfektert med reporteren konstruere av CHOP promoter (-649 /+ 136 ) pmCherry-en plasmid. Som vist i figur 4D, EBR klart indusert CHOP aktivitet, og den resulterende puncta mønster i LNCaP-celler. For ytterligere å validere effekten av EBR på ER stressrelatert apoptose, hemmet vi mTOR av rapamycin behandling for å blokkere
de novo
mRNA og proteinsyntese. Inhibering av mRNA-syntese fører til opphopning av utfoldete /misfoldede proteiner i ER og derfor potensielt kan lindre ER stress-indusert celledød [12]. Vi observerte at samtidig behandling med rapamycin betydelig hindret EBR-indusert celle levedyktighet tap (Fig 5A) og apoptose (figur 5B, venstre panel) i LNCaP celler. I motsetning, 26S proteasominhibitor MG132 co-behandling ytterligere økt celleviabilitet tap (Fig 5A) og apoptose (figur 5B, panel til høyre). I henhold til de oppnådde data, foreslår vi at nærværet av MG132 forhindret EBR-induserte nedbrytning av misfoldede proteiner og forsterket apoptotisk respons i prostata LNCaP kreftceller. Sammen er disse resultatene støtter hypotesen om at EBR-indusert celledød mekanismen er mediert av UPR i prostatakreftceller.
A) Celleviabilitet tap ved samtidig behandling med rapamycin (10 nM) eller pre-behandling med MG132 (10 uM) i nærvær av EBR (25 uM) i 12 timer ble målt ved MTT-analyse. B) Effekten av rapamycin eller MG132 +/- EBR ble bestemt ved PARP-immunblotting. β-actin ble brukt som en lasting kontroll.
CALR er et viktig mål for EBR
For å begynne å forstå den molekylære mekanismen bak EBR-indusert UPR, vi forbigående transfekterte LNCaP celler med en GFP-merket pCMV-CALR plasmid (fig 6A). Samtidig vi utnyttet tunicamycin som en positiv kontroll for å aktivere ER stress i AR-sensitive LNCaP-celler. Selv CALR overekspresjon hindret EBR-avhengige tap av celleviabilitet, det gjorde ikke utøve samme effekt etter tunicamycin behandling (figur 6B). Selv tunicamycin aktivert ER stress veien ved oppregulering uttrykk for CALR, CALNX, BIP og CHOP, EBR behandling bare indusert oppregulering av CHOP men downregulated CALR og CALNX. CALR overekspresjon redusert den potensielle effekten av EBR på ER signale spillere, noe som indikerte at CALR er en kritisk mål av EBR i LNCaP celler. I tillegg foreslår vi at EBR skiller seg fra tunicamycin gjennom aktivering av ulike målene i ER stress maskiner (Fig 6C).
A) Effekten av 12-h EBR behandling etter pEGFP-CALR plasmid transfeksjon ble visualisert via GFP prikker i LNCaP celler. Tunicamycin behandling ble utført som en positiv kontroll. B) Virkningen av EBR i pEGFP-CALR plasmid-transfekterte LNCaP-celler etter 12-h EBR behandling ble bestemt ved MTT-assay. C) Effekten av EBR på ER stress og apoptose biomarkører i CALR-transfekterte LNCaP-celler ble bestemt ved immunblotting. Tunicamycin-behandlede cellelysater ble anvendt som en positiv kontroll; β-actin ble brukt som en lasting kontroll.
Neste, bestemt vi apoptotiske effektiviteten av EBR i både WT og CALR + LNCaP celler. Som vist i figur 6C, EBR aktivert kaspase-12, som kulminerte i PARP spalting i LNCaP WT-celler, men ikke i CALR + LNCaP-celler (figur 6C). Som CALR er en viktig regulator av intracellulær Ca
2 + bufferkapasitet, som også utløser apoptose, undersøkte vi Ca
2 + nivåer etter EBR behandling (figur 7). Vi observerte at EBR behandling øker frigjøring av Ca
2+ med 6 ganger i LNCaP celler.
Celler ble behandlet med EBR for 12 timer og farget med kalsium grønt. Fluorescensintensiteten ble bestemt med FACS flyt og fluorescens mikroskopi (eksitasjon 506 nm, emisjon: 531 nm).
Til slutt foreslo vi at EBR indusert apoptose i prostatakreftceller ved å forårsake ER stress relatert til CALR downregulation og Ca
2 + slipper inn i cytosol (fig 8).
Diskusjoner
EBR, en plantevekst regulator, har nylig blitt foreslått som kandidat kjemoterapeutisk stoff fordi
