Abstract
Bakgrunn
vekst arrest spesifikke karakter 5 gen product: (
GAS5
) koder en lang kodende RNA (lncRNA) og verter en rekke små nukleolære RNA (snoRNAs) som nylig har blitt implisert i flere cellulære prosesser og kreft. Her undersøker vi forholdet mellom DNA-skader, p53, og
GAS5
snoRNAs å få ytterligere innsikt i hvilken rolle dette locus i celle overlevelse og Oncogenesis både
in vivo Hotell og
in vitro
.
Metoder
Vi brukte kvantitative teknikker for å analysere effekten av DNA-skade på
GAS5
snoRNA uttrykk og å vurdere forholdet mellom p53 og
GAS5
snoRNAs i kreftcellelinjer og i normal, pre-maligne og ondartet menneskelig kolorektal vev og brukes biologiske teknikker for å foreslå mulige roller for disse snoRNAs i DNA skade respons.
Resultater
GAS5
avledede snoRNA uttrykk ble indusert av DNA-skader i en p53-avhengig måte i tykktarmskreft cellelinjer og deres nivå ble ikke påvirket av dicer. Videre p53 nivåer sterkt korrelert med
GAS5
avledede snoRNA uttrykk i kolorektal vev.
Konklusjoner
I samlet, disse dataene tyder på at
GAS5
-avledede snoRNAs er under kontroll av p53, og at de har en viktig rolle i mediering av den p53 respons til DNA-skade, som kanskje ikke er relatert til deres funksjon i ribosomet. Vi foreslår at disse snoRNAs ikke blir behandlet av dicer å danne mindre snoRNA-avledet RNA med mikroRNA (miRNA) -lignende funksjoner, men deres nøyaktige rolle krever videre evaluering. Videre, siden GAS5 verts snoRNAs blir ofte brukt som endogene kontroller i qPCR quantifications vi vise at deres bruk som rengjøring gener i DNA-skader eksperimenter kan føre til unøyaktige resultater
Citation. Krell J, Frampton AE, Mirnezami R, Harding V, De Giorgio A, Roca Alonso L, et al. (2014)
Vekst Arrest-Specific Avskrift av 5
Associated snoRNA Levels er relatert til p53 uttrykk og DNA Damage i tykktarmskreft. PLoS ONE 9 (6): e98561. doi: 10,1371 /journal.pone.0098561
Redaktør: Raffaele A. Calogero, Universitetet i Torino, Italia
mottatt: 28 februar 2014; Godkjent: 05.05.2014; Publisert: 13 juni 2014
Copyright: © 2014 Krell et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne vil gjerne takke The Searle Memorial (2005) Charitable Trust, Michael og Lottie Hunter, Peter og Marilyn Cooper, Steve Mobbs og Pauline Thomas, og Denise og Edward Pincheson for deres generøse støtte. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
snoRNAs er en godt karakterisert klasse overalt uttrykt, ikke-kodende RNA (ncRNAs) som er 60-300 nukleotider i lengde [1]. Overveiende ligger i nucleolus de klassisk funksjon som guide RNA for post-transcriptional modning og endring av ribosomale RNA (rRNAs) og snRNAer involvert i spliceosome. snoRNA guide sekvenser hybridiserer spesifikt til deres rRNA targetsekvens, og, via assosiasjoner med proteiner, danner små nukleolære ribonucleoprotein komplekser (snoRNPs) og utfører spesifikke rRNA modifikasjoner [1]. Derfor snoRNAs er avgjørende for ribosomal funksjon og effektiv regulering av oversettelse og dermed ikke overraskende, er høyt konservert gjennom evolusjonen [2]. Det er to hovedklasser av snoRNAs, betegnet C /D eske snoRNAs og H /ACA eske snoRNAs, respektivt. De skiller seg i form av sin sekvens og struktur, deres bindingspartnere og arten av de post-transkripsjons modifikasjoner at de induserer [2], [3].
I eukaryote genomer, snoRNAs er hovedsakelig kodet i introner av protein-kodende vertsgener, men noen er under kontroll av promotorer uavhengige [4]. Hos mennesker, de fleste snoRNAs er intronic og co-transkribert med sine verts genet transkripsjoner, og deretter behandlet ut av det utskårede introner [5]. Imidlertid transkripsjonen av et mindretall skjer gjennom uavhengig RNA polymerase II eller III-aktivitet på en lignende måte som mange mirnas [5], [6]. Nært beslektede snoRNA familiemedlemmer er vanligvis kodet i ulike introner av samme vert genet, men noen verts genene koder mange urelaterte snoRNAs. Selv om noen snoRNA verts gener synes å være ikke-proteinkodings, er mange involvert i nukleolært funksjon og proteinsyntese, og som sådan er det ofte et element av ko-fungerende [5], [7]. Det faktum at i mennesker, er de fleste snoRNAs kodet i intronene protein-kodende og ikke-protein-kodende gener som ga opphav til den antagelse at disse vertsgener utelukkende virker som cellulære keepers via sin snoRNA-kodende sekvenser [8], [9 ]. Imidlertid har nyere studier utfordret dette konseptet og har innblandet snoRNAs og deres verts gener i kontroll av onkogenese og celle skjebne [10], [11]. Eksistensen av en rekke «orphan» snoRNAs uten kjente rRNA mål, og påvisning av deres tilstedeværelse i andre enn den nucleolus [12] subcellulære steder, støtter konseptet at denne gruppe av små ikke-kodende RNA kan regulere andre molekyler og har ytterligere cellefunksjoner [13]. Videre en rekke studier antyder en evolusjonær sammenheng mellom mirnas og snoRNAs [14] og andre rapporterer at modne snoRNAs kan gjennomgå ytterligere cellebehandling til å danne mindre snoRNA-avledet RNA (sdRNAs) med miRNA-lignende funksjoner [3], [14] – [17]. I tillegg har snoRNA ekspresjon er vist å være like variabel som miRNA ekspresjon i humane tumorprøver og normal miRNA polymerase kjedereaksjon (PCR) ekspresjonsdata til disse snoRNAs introdusert forspenningen i sammenheng mellom miRNA og utfall [18].
vekst arrest spesifikke karakter 5
genet (
GAS5
), som ligger i 1q25, er en ikke-proteinkodende flere snoRNA rekke genet består av 12 eksoner [19], [20] opprinnelig oppdaget i løpet av screening for potensielle tumorsuppressorgener uttrykt ved høye nivåer i vekst arrest. Hos mennesker, koder det ti intronic C /D-boksen snoRNAs og to modne lange ikke-kodende RNA (lncRNAs) isoformer som stammer fra alternative 5′-spleisedonorsteder i ekson 7 [20]. Den åpne leseramme kodet for innenfor
GAS5
eksoner er kort og er ikke tenkt å kode for et funksjonelt protein. Kartlegging av sin 5 * slutten viser at det besitter en oligopyrimidine kanalen karakteristikk av 5 * terminale oligopyrimidine (5 * TOP) klasse av gener som akkumuleres i løpet av cellesyklus arrest, men er raskt degradert av tull-mediert forfall i løpet av cellevekst. Klassifiseringen av
GAS5
som et 5 * TOP genet gir en forklaring på hvorfor det er en vekst arrest bestemt utskriften som mens skjøtes
GAS5
RNA er normalt forbundet med ribosomer og raskt brytes ned, under arrestert cellevekst akkumuleres det i mRNP partikler. Interessant, de eneste regionene i bevaring mellom mus og menneske
GAS5
gener er deres snoRNAs og 5 *-end sekvenser [20] tyder på at disse er de viktigste funksjonelle komponenter. Selv
GAS5
spiller en rolle i post-transkripsjonell modifikasjon av ribosomalt RNA gjennom sine snoRNAs, en rekke nyere studier har innblandet dette genet i andre viktige cellulære prosesser [10], [18], [21], [ ,,,0],22]. Den GAS5 lncRNA ble vist å interagere med det DNA-bindende domene av glukokortikoid-reseptoren der den fungerer som en riborepressor, som påvirker celleoverlevelse og metabolske aktiviteter i løpet av sult ved å modulere transkripsjonen aktivitet av denne reseptor [10]. Videre er den samme gruppen viste i prostata cellelinjer, som GAS5 mRNA sequesters androgen /androgen-reseptor-komplekset og hindrer dens binding til mål-DNA-sekvenser [10], som er egnet til å spille en viktig rolle i modulering av effektene av androgener i prostata . GAS5 transkripter har også vist seg å være viktige regulatorer av celle-overlevelse, og apoptose i humane T-celler og bryst og prostata cancer-cellelinjer [21] – [23], og deres overekspresjon sensitivisert pattedyrcancercellelinjene til induserer apoptose [21] . Videre er redusert ekspresjon av GAS5 og /eller dets snoRNAs er blitt demonstrert i hode og nakke squamous cell carcinoma [18], brystkreft [18], [21] og glioblastoma multiforme [24], mens overekspresjon av U44, U76 og U78 er vist i NSCLC [25]. Den avvikende
GAS5
uttrykk demonstrert i bryst og hode-hals-kreft ble assosiert med dårlig prognose [18].
Til tross for disse dataene, er lite kjent som til den nøyaktige rollen spesifikk GAS5 snoRNAs i stier der de har vært innblandet, og enda mindre er akseptert om mekanismene bak dem. Gitt den ovenfor beskrevne rollen til
GAS5
i reguleringen av apoptose og godt dokumentert rolle for p53 i den samme prosess, forsøkte vi å ytterligere undersøke forholdet mellom p53 og GAS5 snoRNAs for å få ytterligere innsikt i sitt potensial rolle i celle overlevelse og onkogenese i tykktarmskreft både
in vivo Hotell og
in vitro
. I tillegg demonstrerte vi at både U44 og U47 GAS5 avledet snoRNAs, som er blant de vanligste snoRNAs brukt som husholdningsgener for normalisering i forbindelse med Taqman miRNA uttrykk analyse og bør unngås i DNA-skade eksperimenter.
Materialer og Metoder
Etikk erklæringen
etisk godkjenning er innhentet fra Imperial College etiske vurdering bord. Studien ble utført i samsvar med Helsinkideklarasjonen og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter før å skaffe vevsprøver for formålet med studien.
Samling, håndtering og RNA ekstraksjon fra laser fanget mikro dissekert (LCM) tumorprøver
med godkjenning fra vår Institutional Review board, ble vevsprøver som representerer normal tarmvevet og colonic adenokarsinom oppnås umiddelbart etter operasjonen, skåret i blokker, og deretter formalin fiksert og innebygd i parafin. Skriftlig informert samtykke ble innhentet. Før mikrodisseksjon ble åtte 8-um seriesnitt snitt (-25 ° C) fra det samme vev blokken og plassert på objektglass (1 mm), det ble deretter deparaffinized farget med Hematoxylin og Eosin. De ble deretter microdissected bruke PALM Laser Microbeam system (P.A.L.M. Micro Technologies GmbH, Bernried, Tyskland). En samlet areal på 200.000 mikrometer
2 ble mikro dissekert fra hvert lysbilde. Figur 1 viser bilder av forskjellige trinn i mikrodisseksjon prosessen. RNA ble deretter ekstrahert fra mikro-dissekert prøver RNeasy MinElute RNA Isolation Kit (Qiagen, Courtaboeuf, Frankrike).
N = normal kolon, T = svulst, A = adenom. 1: Hematoxylin og eosin farging; 2: områder som skal microdissected er merket; 3: lysbilde følgende mikrodisseksjon merkede områder; 4:. Microdissected vev etter fløy på innsiden av lokkene eppedORF
Samling, håndtering og RNA ekstraksjon fra makro-dissekert kolorektal vev
Vi ønsket å undersøke om et forhold eksisterte mellom p53 aktivitet og ekspresjon av
GAS5
-snoRNAs i human kolorektal vev, og spesielt i kolorektale tumorprøver. Vi har samlet sammen prøver av Dypfryst tykktarms svulstvev og tilsvarende normal kolorektal vev fra 20 enkeltpasienter og målt MIR-34a og snoRNA nivåer og p53 uttrykk i disse prøvene. Eksemplarer av normal, adenomatøs og ondartet kolorektal vev ble innhentet fra personer som gjennomgår kolorektal kirurgi eller koloskopi mellom 2011 og 2013 på St Marys Hospital, London, UK. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver pasient. Prøvene ble umiddelbart macrodissected ved tidspunktet for kirurgi, plasseres direkte i RNA
Senere
stabilisering løsning (Qiagen, Hilden, Tyskland), lagret ved romtemperatur i 2-3 timer, og deretter frosset ved -80 ° C. H E farging ble anvendt for histologisk bekreftelse av kreft og for å bestemme den cellularitet av representative deler. En spesialist kolorektal patolog anmeldt lysbildene, og vev for RNA isolering ble bekreftet å inneholde ≥60% neoplastiske celler. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter, og etisk godkjenning ble gitt av sykehusets forskningsetisk komité. Fresh vev lagret i RNA
Senere plakater (Qiagen) ble knust i flytende nitrogen og den påfølgende pulver lysert i Trizol (Invitrogen, Paisley, UK) reagens og RNA isolering ble utført i henhold til produsentens instruksjoner.
celle~~POS=TRUNC kultur~~POS=HEADCOMP og doxorubicin behandling
p53 villtype (WT) og knockout (KO) HCT116-celler og dicer WT og knockdown (KD) cellelinjer ble vennlig levert av Dr. Bert Volgestein [26], [ ,,,0],27]. Celler ble sådd ut i 150 mm skåler ved 50% konfluens og inkubert i henhold ved 37 ° C i en fuktet 5% CO2-inkubator. De ble deretter behandlet med doksorubicin ved en konsentrasjon på 0,2 ug /ml eller tilsvarende volum av bærer (ddh
20). Etter hver behandling tidspunkt, ble retter plassert på is, og mediet ble aspirert. Cellene ble vasket to ganger med kald PBS, skrapet og sentrifugert i 5 minutter ved 1300 rpm. Supernatanten ble fjernet, og cellepelleten ble bearbeidet for RNA ved hjelp av Trizol reagens (Invitrogen, Paisley, UK) og /eller proteinekstraksjon.
RNA kvantifisering og RT-qPCR-analyse
Kvantifisering av ekstrahert RNA ble utført ved hjelp av Nanodrop ND-1000 spektrofotometer (Thermo Scientific, USA) og dens kvalitet ble analysert ved hjelp av RNA 6000 Pico LabChip kit og 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) eller via ikke-denaturerende agarosegel elektroforese. Total RNA (10 ng) ble revers transkribert til cDNA ved hjelp av TaqMan mikroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) med en primer som er spesifikk for hver modne miRNA, snoRNA eller snRNA.
U6
og
U19 plakater (liten nukleolært RNA) ble anvendt som endogene kontroller for normalisering som tidligere beskrevet [28]. QRT-PCR ble utført ved hjelp av TaqMan mikroRNA assaykit (Applied Biosystems). Reaksjonsblandingen besto av 10 ul av TaqMan universell masterblanding 2x, 1 pl av TaqMan blanding 20x, 1 ng av cDNA i et endelig volum på 20 ul. Kvantitativ real-time PCR (qPCR) ble utført med en ABI Prism 7900HT sekvens deteksjonssystem (Applied Biosystems). Data ble analysert ved hjelp qBasePlus programvare (biogazelle). Nivåene som vises er hjelp av tre uavhengige cDNA kjøringer. Normalisering ble utført ved hjelp av delta-Ct-metoden.
SDS-polyakrylamid gelelektroforese og Western blot
Cellepelleter eller ferske prøvene frosne vev ble lysert i 30 til 60 ul av NP-40 lyseringsbuffer + proteaseinhibitorer cocktail løsning (Roche), og proteinet fasen ble oppsamlet etter sentrifugering. Proteinkonsentrasjonen ble beregnet ved hjelp av Bradford-reagens Kit (BioRad). Avlesninger ble målt ved 595 nm ved hjelp av en Beckman DU 530 Life Science UV /synlig spektrofotometer. Etter innsamling av data, ble konsentrasjonen av de ukjente prøvene bestemmes basert på standard absorbans verdi. Proteinprøver ble deretter utsatt for SDS-polyacrilamide gelelektroforese, overført til en Hybond C supernitrocellulosemembran (GE Healthcare) og deretter blottet for proteinet av interesse. Membranene ble vasket og forbedret Chemiluminescence (ECL) deteksjonssystem (GE Healthcare) ble anvendt for visualisering. Den utsendte fluorescens ble påvist ved hjelp av Hyper ECL (GE Healthcare) på SRX-101A x-ray-utvikler.
Statistical Analysis
biostatistiske analysene ble utført ved hjelp av GraphPad Prism programvare. Statistiske sammenligninger ble utført ved hjelp av t-test eller Pearsons Korrelasjonskoeffisienter.
Resultater
Doxorubicin-indusert DNA skade øker
GAS5
-deriveded snoRNA uttrykk i en p53 avhengig måte i tykktarmskreftcellelinjer
Vi behandlet HCT116 p53
WT og HCT116 p53
KO-celler med doksorubicin for å indusere DNA-skade, og brukes RT-qPCR for å måle endringer indusert i ekspresjonsnivåer av diverse små RNA, spesielt
GAS5
avledede snoRNAs U44 og U47. Doxorubicin behandling i HCT116 p53
WT cellelinjer førte til en betydelig induksjon i uttrykket av
GAS5
avledede snoRNAs U44 (P 0,01) og U47 (P 0,01) sammenlignet med behandling med en kontroll kjøretøy, men det var ingen vesentlig endring i nivået av ikke-
GAS5
-associated snoRNA U19 (figur 2) eller snRNA U6 som ikke stammer fra den GAS5 locus når sammenlignet med GAPDH uttrykket (data ikke vist). Doxorubicin behandling ikke signifikant økning
GAS5
avledede snoRNA uttrykk i HCT116 p53
KO celler (figur 2), noe som tyder på at DNA-skader indusert uttrykk for
GAS5
avledede snoRNAs i et p53-avhengig måte. Doxorubicin behandling av HCT116 p53
WT-celler også signifikant økt ekspresjon av MIR-34a (P≤0.006), anvendt som en positiv kontroll, selv om størrelsen på folden endringen variert avhengig av hvilken små RNA ble valgt for å normalisere ekspresjonsnivåer til (figur 2 P 0,01) når
GAS5
avledede snoRNAs U44 og U47 ble brukt for normalisering (figur 3). Tilsvarende forskjeller ble sett når p21 ble anvendt som en positiv kontroll (data ikke vist). Analyse av p53 kromatin immunoutfelling sekvensering (chip seq) eksperimenter utført i HCT116-celler [29] indikerer nærværet av en betydelig topp på p53 interaksjon i to uavhengige forsøk med p53-aktivering indusert av Nutlin3 eller 5’fluorouracil (5FU)), ved samme stilling, omtrent 800 bp bort fra GAS5 transkripsjonstartsetet (TSS), noe som indikerer at p53 kontrollerer direkte GAS5 transkripsjon.
relative nivåer av (A) MIR-34a, (B) U19 snoRNA, (C) U44 snoRNA og (D) U47 snoRNA ble målt ved hjelp av RT-qPCR i p53
WT HCT116-cellelinjer og p53
KO HCT116-cellelinjer behandlet med enten doksorubicin (til en sluttkonsentrasjon 0,2 pg /ml) eller vehikkel i 24 timer. Nivåer var normalisert til U6 snRNA nivåer og data er presentert i forhold til kjøretøyet behandlede celler ± sem (hver av dem utført in triplo; Students t test: * P 0,01, ** P≤0.006).
relative nivåer av MIR-34a normalisert til (A) U6 snRNA, (B) U47 snoRNA, (C) U44 snoRNA og (D) U19 snoRNA ble målt ved RT-qPCR i p53
WT HCT116 cellelinjer og p53
KO HCT116-cellelinjer behandlet med enten doksorubicin (til en sluttkonsentrasjon 0,2 pg /ml) eller vehikkel i 24 timer. Data er gitt i forhold til bilens behandlede celler ± sem. (Hver av dem utført i tre eksemplarer, Student t-test: * P 0,01, ** P≤0.006)
GAS5
avledede snoRNA uttrykk varierer mellom normal og ondartet tykktarms frisk ikke-microdissected vev i en p53-avhengig måte
Vi fant betydelige forskjeller i uttrykket nivåer av
GAS5
avledede snoRNAs mellom paret prøver av fisk i normal tykk- vev og kolorektal tumor fra den samme pasient (P 0,01; figur 4). snoRNA nivåene var signifikant høyere i tumorer sammenlignet med den tilsvarende normal tykktarms vev i 85% av pasientprøver, men var signifikant lavere i 15%. Det var ingen signifikant forskjell i snRNA U6 nivåer mellom sammenkoblede normale og tumorprøver. Interessant, MIR-34a nivåer var også signifikant høyere i pasienttumorprøvene i forhold til deres tilsvarende normale kolorektal vevsprøver (P≤0.0006, figur 4). Vi deretter målt p53 uttrykk nivåer i paret normal kolorektal vev og kolorektale tumorprøver ved hjelp av Western blotting (figur 5A-C). p53 nivåene var signifikant høyere i tykktarmssvulster i forhold til de tilsvarende kolorektal vevsprøver normale (P 0,01; Figur 5D).
En Box plot sammenligne de relative uttrykk nivåer av MIR-34a, U44 snoRNA og U47 snoRNA mellom sammenkoblet kolorektal tumor (T) og normal tykktarms (N) ferske prøvene frosset vev. (Student t test * P 0,01, *** P≤0.0006)
(A B). Western blot rens viser p53 nivåer i de første 10 normal kolorektal (A) og tykktarmssvulst ( B) vevsprøver. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. (C) Kolonne diagram som viser brette endringer i p53-ekspresjonsnivåer er vist i Western blot (A og B) normalisert til GAPDH og beregnes ved hjelp av ImageJ programvare. (D) En boksplott sammenligne de relative uttrykk nivåer av p53 mellom alle 25 paret kolorektal tumor (T) og vevsprøver normal kolorektal (N) (Student t test * P 0,01).
Bruk de samme prøvene, beregnet vi Pearsons korrelasjonskoeffisienter, sammenligne p53 uttrykk nivåer med snoRNA U44 og U47 nivåer, for å finne ut om noen forhold eksisterte mellom
GAS5
avledede snoRNA nivåer og p53
in vivo
i mennesker. Vi fant en sterk positiv korrelasjon mellom p53 uttrykk nivåer og nivåer av både snoRNA U44 (Pearson korrelasjon = 0,64, R
2 lineær = 0,41; P = 0,02) og snoRNA U47 (Pearson korrelasjon = 0,69, R
2 lineær = 0,49; P = 0,01) i kolorektale tumorprøver (Figur 6A). Vi har også beregnet Pearsons korrelasjonskoeffisienter å sammenligne MIR-34a uttrykk nivåer med snoRNA U44 og U47 nivåer, for å finne ut om noen forhold eksisterte mellom nivåene av
GAS5
avledede snoRNAs og p53-regulert mirnas hos mennesker. Dette ble også utført for å tilveiebringe bevis til støtte for bruken av MIR-34a som en surrogatmarkør for p53 i denne sammenheng for ytterligere forsøk under anvendelse av RNA avledet fra microdissected FFPE vevsprøver som p53-nivåer var ikke målbar ved Western blotting. Interessant, fant vi en sterk positiv korrelasjon mellom MIR-34a uttrykk nivåer og nivåer av både snoRNA U44 (Pearson korrelasjon = 0,73, R
2 lineær = 0,53; P = 0,001) og snoRNA U47 (Pearson korrelasjon = 0,66; R
2 lineær = 0,43;. P = 0,02) i kolorektale tumorprøver (figur 6B)
Grafer som viser Pearson korrelasjon analyser av forholdet mellom (A) p53 nivåer eller (B) MIR-34a nivåer og den snoRNAs U44 og U47 i kolorektal kreft vevsprøver (A B).
GAS5
avledede snoRNA uttrykk varierer mellom normal, pre-maligne og ondartet microdissected FFPE kolorektal vev og nivåer korrelerer med MIR-34a uttrykk
det er mye debatt om nøyaktigheten av RNA og genuttrykkstudier som bruker ikke-microdissected tumorprøver, på grunn av mulige effekter som de cellulære komponenter i det omkringliggende stroma kan har på nivåene av den målte molekylet. Vi har derfor som mål å utføre ytterligere eksperimenter i microdissected vevsprøver for å støtte resultatene ovenfor. Vi samlet 60 uparede FFPE- tykktarms vevsprøver som består av 20 normal slimhinne, 20 adenom og 20 vevsprøver. Vi microdissected de nødvendige delene etter H E farging, utført RNA ekstraksjon og målte små RNA uttrykk nivåer av RT-qPCR (figur 1). Vi fant signifikant høyere nivåer av MIR-34a (P≤0.006), snoRNA U44 (P≤0.0005) og snoRNA U47 (P≤0.0005) i adenom prøvene sammenlignet med normal slimhinne prøver (Figur 7A). Videre er ekspresjon av alle 3 små RNA var signifikant høyere i tumorprøver i forhold til adenom eller normal slimhinne prøver (figur 7A). I tillegg p53-nivåene målt ved immunhistokjemi og gitt som en p53 score på 0-3, var høyere i tumorprøver (80% = score på 3, 20% = Resultatet 2) og adenom prøver (50% = score på 3, 30% score på 2, 20% score på 1) enn normalt vev (100% = score på 0).
A, RT-qPCR ble anvendt for å måle de relative ekspresjonsnivå av MIR-34a, snoRNA U44 og snoRNA U47 i microdissected menneskelige vevsprøver som tilsvarer normal kolorektal vev (N), kolorektal adenom (A) og kolorektal tumorer (T) (Student t test * P 0,05, ** P≤0.006, *** P≤0.0005) . B, A Pearsons korrelasjonsanalyse ble utført for å bestemme forholdet mellom MIR-34a nivåer og snoRNAs U44 og U47 i microdissected kolorektale FFPE svulst vevsprøver.
Ved hjelp av de samme prøvene, vi så beregnet Pearsons korrelasjon koeffisienter sammenligne MIR-34a uttrykk nivåer og snoRNA U44 og U47 nivåer for å finne ut om forholdet demonstrert i ikke-microdissected prøver mellom
GAS5
avledede snoRNA nivåer og p53 (MIR-34a som brukes her som en surrogatmarkør for p53) ble også sett i microdissected kolorektal tumorer. Vi fant en sterk positiv korrelasjon mellom MIR-34a uttrykk nivåer og nivåer av både snoRNA U44 (Pearson korrelasjon = 0,69, R
2 lineær = 0,47) og snoRNA U47 (Pearson korrelasjon = 0,67, R
2 lineær = 0,45) i kolorektale tumorprøver (figur 7B).
uttrykket av
GAS5
avledede snoRNAs er ikke berørt i kolorektal kreft cellelinjer hvor dicer har blitt slått ned og derfor ikke synes å bli behandlet av dicer
i lys av funnene som er beskrevet i tidligere studier som viste at snoRNAs kan omdannes ved dicer til sdRNAs med miRNA-lignende funksjoner det er mulig at miRNA-lignende molekyler som produseres fra GAS5 avledet snoRNAs er involvert i DNA-skade reaksjon [3]. For å undersøke mulige involvering av dicer i denne prosessen vi vurdert effekten av dicer knock-down på uttrykk for
GAS5
avledede snoRNAs følgende DNA-skader. For å oppnå dette har vi brukt RT-qPCR å sammenligne endringer i uttrykket av snoRNAs U44 og U47 følgende doxorubicin behandling i kolorektal kreft cellelinjer DLD1 og RKO i sin villtype (WT) form og i en form som dicer hadde vært stabilt slått ned (KD). Interessant, fant vi at selv om dicer knock-down førte til en statistisk signifikant reduksjon i MIR-34a nivåer (P≤0.006) i begge DLD1 og RKO cellelinjer, som forventet, var det ingen effekt på nivåene av snoRNA U44 eller snoRNA U47 (Figur 8), noe som tyder på at funksjonen til
GAS5
avledede snoRNAs i p53-regulert svar på DNA-skade ikke involverer deres konvertering til sdRNAs med miRNA-lignende funksjon.
Relativ nivåer av U44 snoRNA (rød), U47 snoRNA (blå) og Mir-34a (lilla) ble målt ved RT-qPCR i DLD1 dicer
WT cellelinjer, DLD1 dicer
KD cellelinjer, RKO dicer
WT cellelinjer, RKO dicer
KD cellelinjer behandlet med enten doksorubicin (til en sluttkonsentrasjon 0,2 pg /ml) eller vehikkel i 24 timer. Data er presentert i forhold til kjøretøyet behandlet tilsvarende cellelinjer (stiplede linjer) ± SEM (hver av dem utført in triplo; Students t test: * P 0,01, ** P≤0.006).
diskusjon
Våre funn viste en sammenheng mellom p53 aktivitet og uttrykk for
GAS5
avledede snoRNAs i kolorektal kreft cellelinjer og menneskelige kolorektal vev. Videre foreslo de at transkripsjon av
GAS5
genet er direkte regulert av p53, selv om kromatin immunoutfellingsstudier ville være nødvendig for å bekrefte dette. Selv om ingen funksjonelle studier har blitt utført, disse funnene antydet en viktig rolle for
GAS5
avledede snoRNAs i p53-regulert cellulær respons på DNA-skade og i p53-assosiert signalveier i menneskelige kolorektal vev og tykktarmskreft .
Inntil Chang
et al. product: (2002) [30] først beskrev potensielle rolle snoRNAs i tumorigenesis, hadde det vært lite begrunnelse for systematisk evaluering av den rollen snoRNAs i denne eller hvilken som helst annen patologisk tilstand. Imidlertid data er at det registreres at koblingen en feilregulering i ekspresjonen av forskjellige snoRNAs til utvikling av en rekke ondartede sykdommer [11], [25], [31], [32]. Som
GAS5
gen vert ti intronic snoRNAs og en lncRNA og har vært implisert i onkogenese og regulering av celleoverlevelse og apoptose [21] – [23], og gitt godt dokumentert rolle for p53 i samme prosesser, rettet vi til å undersøke forholdet mellom p53 og GAS5 snoRNAs å få ytterligere innsikt i sin potensielle rolle i tumorigenesis. Vi fant at i kolorektal kreft cellelinjer,
GAS5
avledede snoRNAs ble indusert i en p53-avhengig måte følgende DOX stimulert DNA-skader, men at dette påvirker ikke ble tapt da dicer ble funksjonelt slått ned. Dette antydet at disse snoRNAs ikke ble behandlet i sdRNAs med miRNA-lignende funksjon, og at deres rolle i den DNA-skade responsen ikke krever at de skal bli ytterligere behandlet på denne måten. Dette indikerer at disse snoRNAs kan være involvert i koordineringen av p53-medierte respons gjennom deres rolle i regulering av ribosomet. snoRNAs er avgjørende for ribosomal funksjon og den effektive regulering av translasjon [2] og p53 er en viktig formidler av ribosom biogenese spesielt som respons på såkalt nukleolært spenning [33]. Videre har p53 vist å mediere den signaleringslenke mellom ribosom biogenese og cellesyklusen [34]. Det virker logisk derfor at
GAS5
avledede snoRNAs kan være direkte forårsaket av p53-mediert transkripsjon følgende DNA-skade for å «effektivisere» post-transcriptional modning og modifikasjon av rRNAs og for å sikre en mer effektiv oversettelse av gener som kreves for å koordinere en reaksjon på en slik spenning. Denne teorien klart krever videre eksperimentell evaluering ikke minst ved å bevise at det er en økning i lokalisering av disse snoRNAs til ribosomet i stedet for en alternativ cellulær avdeling etter DNA-skade. Det er mulig at disse snoRNAs opptre på en annen enn ribosomet sted, og at de kan ha sdRNA typen funksjon, men ikke krever dicer behandling for å muliggjøre dette. Hvorvidt disse DNA-skade indusert
GAS5
avledede snoRNAs bare fungere for å få plass til en økning i genet oversettelse ved ribosomet, eller hvorvidt de er faktisk behandlet for å sdRNAs og har ytterligere, uavhengig funksjon, kan deres virkning på genekspresjon bli vurdert gjennom over-uttrykk eksperimenter fulgt av genet profilering eksperimenter.
