Abstract
plasmacytoma variant trans 1 genet (
PVT1
) er en lncRNA som er utpekt som et onkogen på grunn av sitt bidrag til fenotypen av flere krefttyper. Selv om mekanismen som
PVT1
påvirker sykdomsprosesser har blitt studert i flere krefttyper, dens rolle i livmorhals tumorigenesis fortsatt ukjent. Dermed ble denne studien designet for å undersøke hvilken rolle
PVT1
i livmorhalskreft
in vitro Hotell og
in vivo
.
PVT1
uttrykk ble målt ved kvantitativ PCR (qPCR) i 121 invasiv livmorhalskreft (ICC) prøver, 30 normale livmorhalsen prøver, og livmorhalsen cellelinjer. Funksjonelle analyser ble utført ved anvendelse av både siRNA og LNA-mediert knockdown for å undersøke
PVT1 «
s effekt på livmorhalskreft celleformering, migrering og invasjon, apoptose, og cisplatin motstand. Våre resultater viser at
PVT1
uttrykk er betydelig økt i ICC vev versus normal livmorhals og at høyere uttrykk av
PVT1
korrelerer med dårligere total overlevelse. I livmorhalskreft cellelinjer,
PVT1
knockdown resulterte i betydelig redusert celleproliferasjon, migrasjon og invasjon, mens apoptose og cisplatin cytotoksisitet ble betydelig økt i disse cellene. Til slutt viser vi at
PVT1
uttrykk er utvidet som følge av hypoksi og immunrespons stimulering og at dette lncRNA forbinder med den multifunksjonelle og stress-responsive protein, Nucleolin. Kollektivt, resultatene gir sterke bevis for en onkogen rolle
PVT1
i livmorhalskreft og låne innsikten i mulige mekanismer som
PVT1
overekspresjon bidrar til å drive livmorhalskreftutvikling.
Citation : Iden M, Fye S, Li K, Chowdhury T, Ramchandran R, Rader JS (2016) The lncRNA
PVT1
Bidrar til livmorhalskreft Phenotype og kollegaer med dårlig Pasient prognose. PLoS ONE 11 (5): e0156274. doi: 10,1371 /journal.pone.0156274
Redaktør: Bibekanand Mallick, National Institute of Technology, Rourkela, INDIA
mottatt: 15 august 2015; Godkjent: 11 mai 2016; Publisert: May 27, 2016
Copyright: © 2016 Iden et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av kvinner Health Research Program ved Medical College of Wisconsin (https://obgyn.mcw.edu/research/whrp/). Finansiører hadde ingen rolle i noen del av forberedelsen av dette manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Long ikke-kodende RNA ( lncRNAs) gi viktige mål for kreftdiagnostikk og terapi på grunn av sin avgjørende rolle i mange cellulære prosesser som epigenetiske forandringer, genet forsterker og tumor suppressor aktivitet, og miRNA sequestering. LncRNAs er gjennomgripende i genomet, ofte vise celletype og timelig spesifikk regulering av genekspresjon, og kan påvirke mange cellulære prosesser via flere ulike mekanismer [1]. Plasmacytoma variant trans 1 (
PVT1
) er en svært konservert lncRNA ~ 50kb nedstrøms
MYC
som har vakt betydelig oppmerksomhet fra kreft-feltet på grunn av sin hyppige co-forsterkning med
MYC
i flere solide tumorer [2]. De første studiene som dokumenterer at
PVT1
kan bidra til kreftutvikling demonstrert hyppige trans i muse plasmacytomer [3,4] og menneskelige Burkitt lymfomer [5-7]. De onkogene effekter av
PVT1
har blitt ytterligere aktualisert av flere nyere studier som viser sin overekspresjon og forsterkning i flere krefttyper [8-17]. Enda viktigere,
PVT1
uttrykk har blitt betydelig korrelert med kliniske funksjoner som risiko, tilbakefall og overlevelse i ulike kreft [8,11-13,18].
Til tross for vell av kunnskap om de onkogene egenskaper
PVT1
i flere kreftformer, svært lite er kjent om dens presise biologisk funksjon. Faktisk er den håndfull av studier tilveiebringe
PVT1
mekanistiske data over tyder på at det utøver sin effekt i et celletype og /eller sykdomsspesifikk måte. For eksempel
PVT1
funksjonen har blitt tilskrevet sin binding og stabilisering av Myc [19] og Nop2 [17] proteiner i bryst og leverkreft, henholdsvis. I magekreftceller,
PVT1
virker å undertrykke uttrykket av p15 og p16 via sin fysiske interaksjon med polycomb gruppe protein, EZH2 [20]. Også via EZH2 rekruttering og regulering av thyroid-stimulerende hormon reseptor,
PVT1
induserer spredning av skjoldbruskkjertelen kreftceller [21]. Til slutt, beregnings analyse av
PVT1
tyder på at det kan virke via binding og lagring av mir-200 familiemedlemmer i brystkreft vev [14]. På grunn av sin kompleksitet og bredde av resultater, disse studiene understreker viktigheten av sykdomsspesifikke undersøkelse av
PVT1
mekanismer.
Vår interesse i
PVT1
stammer fra vårt arbeid og andres demonstrere at det er en hyppig område av HPV integrering i livmorhalskreft, som videre antyder en viktig biologisk funksjon [22-24]. Derfor søkte vi å bedre definere rollen som
PVT1
i livmorhalskreftutvikling ved å undersøke
PVT1
uttrykk mønstre i livmorhalskreft svulster og cellelinjer og funksjonelle effekter av dette lncRNA på kreftrelaterte prosesser slik som spredning, cellemotilitet, apoptose, og chemoresistance. Til slutt, fordi mange lncRNAs stole på protein partnere for å gjennomføre sine effekter, ansatt vi RNA affinitet kromatografi og massespektrometri sekvensering for å belyse livmorhalskreft cellespesifikke
PVT1
bindende partnere.
Metoder
studien protokollen ble godkjent av Institutional Review board of Medical College of Wisconsin IRB (PRO00011466, molekylær karakterisering av livmorhalskreft).
Cell kultur
Siha (ATCC® HTB35 ™), HeLa (ATCC® 2CCl ™), og DoTc2 4510 (ATCC® CRL-7920 ™) menneskelige livmorhalskreft cellelinjer og HPV 16 E6 /E7-transformert, normale ectocervical celler (Ect1 /E6E7; ATCC® CRL-2614 ™ ) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Cervical kreft celler ble opprettholdt i enten Eagles Minimum Essential Medium (EMEM; Siha og HeLa) eller Dulbeccos modifiserte Eagles medium (MEM; DoTc2) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS; ATCC). Ect1 /E6E7-celler ble opprettholdt i keratinocytt-serumfritt medium (GIBCO) med 0,1 ng /ml human rekombinant EGF, 0,05 mg /ml bovint hypofyseekstrakt, og ytterligere kalsiumklorid 44,1 mg /l. Den ATCC godkjenner alle cellelinjer ved å undersøke sine kort tandem repeat (STR) DNA-profiler. Celler ble holdt ved 37 ° C i høy luftfuktighet med en atmosfære av 95% luft og 5% CO
2. Celler ble høstet ved bruk av trypsin-EDTA (0,25% trypsin, 0,53 mM EDTA; ATCC) og tellet ved bruk av trypanblått 0,4% løsning (AMRESCO, Solon, OH) og hemacytometer tellekammer. For noen eksperimenter, cisplatin (1 mM, Sigma, St. Louis, MO) ble rekonstituert i destillert vann og lagret ved -20 ° C inntil bruk. Celler ble utsatt for cisplatin i en konsentrasjon på 10 uM, 50 uM og 100 uM i vekstmedium i 4 timer i kulturmedier. Cisplatin-inneholdende kulturmedier ble fjernet og erstattet med friskt vekstmedier 4 timer senere og cellene inkubert ved 37 ° C over natten. For eksperimenter undersøke
PVT1
uttrykket etter hypoksi og immunrespons stimulering, Siha celler ble henholdsvis behandlet med kobolt-klorid (150 mikrometer, Sigma) eller interferon alfa (IFN-α, 10 mm, Sigma) i 48 timer før RNA-ekstraksjon (metodene nedenfor). Til slutt, andre Siha celler ble behandlet med cykloheksamid (10 mm, Sigma). For ulike tidspunkter før de blir utsatt for lysis for Myc Western blotting
transfections
Cells (2,0 x 10
5) celler ble sådd ut i en 6-brønners skål og tillatt å holde seg over natten. Cellene ble deretter tilført med to små interfererende RNA (siRNA) utformet mot
PVT1
kombinert i en ekvimolar ratio (20 eller 40 nM, FlexiTube Hs_PVT1_5 og Hs_PVT1_6, Qiagen, Valencia, CA) eller en negativ kontroll siRNA (AllStar negativ kontroll; Qiagen) konjugert med Alexa Fluor 488. transfections ble utført med DharmaFECT1 (GE Dharmacon, Lafayette, CO) per produsentens instruksjoner. Transfeksjonseffektiviteten ble overvåket via fluorescerende mikroskopi og bekreftet via kvantitativ PCR (qPCR) 48 timer etter transfeksjon. siRNA transfections ble utført i begge Siha og HeLa livmorhalscellelinjer og utnyttes i spredning, apoptose og celledød, og migrasjon og invasjon analyser.
For låst nukleinsyre (LNA) oligonukleotid transfections, celler (2,0 x 10
5) ble sådd ut i en seks-brønns fatet og den påfølgende dagen transfektert med 10 nM PVT1_10 eller PVT1_15 LNA (Exiqon, Woburn, MA) eller et egge kontroll LNA (negativ kontroll A, Exiqon) ved hjelp DharmaFECT 1 (GE Dharmacon) ved en konsentrasjon på 0,2 mL per 100 ul vekstmedium. Sekvensene til PVT1_10 LNA, PVT1_15 LNA og negativ kontroll A er henholdsvis 5′-AACACGTCTATACGC-3 «, 5′-AGATCACTGTAAATCC-3′ og 5»-GGCAGGATCTATGGCA-3 «,. Transfeksjon medium ble erstattet med friskt vekstmedier 24 timer etter transfeksjon og nedstrøms-tester som utføres i 48 timer senere. LNA-transfekterte Siha celler ble benyttet for å bekrefte effekten av siRNA transfeksjon på celleproliferasjon, for å bestemme effekten av
PVT1
knockdown på cisplatin respons, MYC degraderings eksperimenter, og effekter på nucleolin avhengige mRNA-ekspresjon.
RNA isolering, cDNA syntese, og kvantitativ PCR (qPCR)
RNA ble isolert ved hjelp av Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX) og cDNA syntetisert ved hjelp av High-Capacity RNA-til-cDNA Kit (Applied Biosystems, Foster City, California). For noen eksperimenter, lever dyrkede celler ble vasket med 1 x PBS og separeres i cytoplasmiske og kjernefysiske RNA partier ved bruk av ikke-ioniske detergenter følgende instruksjonene i settet PARIS (Life Technologies). RNA ble isolert fra hver porsjon og DNase behandlet ved hjelp av DNA-fri Kit (Life Technologies). Uttrykk for
PVT1
,
MYC Hotell og kontroll
RPS18
ble vurdert ved hjelp EvaGreen qPCR Mastermix (MidSci, St. Louis, MO) på en StepOnePlus Real-Time PCR System ( life Technologies). Den termiske sykluser Programmet omfattet en innledende enzymaktiveringstrinn ved 95 ° C i 10 minutter, fulgt av 40 sykluser bestående av en 10 sek denaturerende trinn ved 95 ° C, og et 1 minutt annealing /forlengelsestrinn ved 60 ° C for alle primere. Fluorescerende intensitet ble målt ved 62 ° C ved slutten av hver syklus. Forover og bakover primere for
PVT1
var 5′-CCGACTCTTCCTGGTGAAGC-3 «og 5′-GTATGGTCAGCTCAAGCCCA-3′, 5»-TACCCTCTCAACGACAGAG-3 «og 5’TCTTGACATTCTCCTCGGTG-3» for
MYC
, og 5′-CTTCAGTCGCTCCAGGTCTT-3 «for
RPS18 plakater (for data normalisering) .s for
PVT1
var 5′-CCGACTCTTCCTGGTGAAGC-3′ og 5′-GTATGGTCAGCTCAAGCCCA-3 « , 5»-TACCCTCTCAACGACAGAG-3 «og 5’TCTTGACATTCTCCTCGGTG-3» for
MYC
, og 5′-CTTCAGTCGCTCCAGGTCTT-3 «for
RPS18 plakater (for data normalisering).
uttrykk for miRNAs ble utført med TaqMan® mikroRNA analyser (Life Technologies) for HSA-MIR-1204 (002 872), HSA-MIR-1205 (002 778), HSA-MIR-1206 (002 878), HSA-MIR-1207 -3P (002 826), HSA-MIR-1207-5P (241060_mat), HSA-MIR-1208 (002 880), og RNU48 (001006, for data normalisering) i henhold til produsentens instruksjoner. Kort, RNA ble isolert ved hjelp av Mirvana miRNA Isolation Kit og cDNA syntetisert med TaqMan mikroRNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies) med gitt primere for hver miRNA. qPCR forsterkning ble deretter utført på en StepOnePlus Real-Time PCR System ved hjelp av produsentens parametere. Alle prøvene ble analysert i tre eksemplarer anvende 2- ΔΔCt metode for relativ genekspresjon, uttrykt som 2-ΔΔCt.
RNA fluorescerende in situ hybridisering (FISH) og immunocytochemistry
ViewRNA TYPE 6 probe sett ( Affymetrix, Santa Clara, CA) utformet mot
PVT1 plakater (NR_003367.2) ble brukt til å visualisere
PVT1
uttrykk
in vitro
. Forsøkene ble utført i henhold til produsentens protokollen ved hjelp av reagenser som er gitt i QuantiGene ViewRNA ISH Cell Assay Kit (Affymetrix). Kort fortalt ble Siha celler sådd ut på 12 mm sirkulære Dekk og vokst til 70-90% samløpet før de festes med 4% formaldehyd. Cellene ble deretter vasket med 1 x PBS og inkubert i 5 minutter i vaskemiddeloppløsning for permeabiliseringen. Cellene ble vasket en gang til og inkuberes med Working Protease løsning for 25 min. Prober ble fortynnet (1: 100) i forvarmet Probe sett fortynningsmiddel og inkubert med cellene i 3 timer ved 40 ° C. Cellene ble vasket, hybridisert med Working forforsterker Mix løsning i 30 min ved 40 ° C, vasket igjen, og hybridisert med Working forsterker Mix løsning i 30 min ved 40 ° C. Etter flere vask ble celler hybridisert med de merkede prober i 30 minutter ved 40 ° C. Etter denne inkubasjon ble Dekk vasket, farget med DAPI, og montert på glassplater. Celler ble fotografert med en Zeiss LSM510 konfokalmikroskop ligger i Barnas Research Institute Imaging Core ved Medical College of Wisconsin. Bilder ble behandlet i Adobe Photoshop CS5.1.
For co-farging av Nucleolin med
PVT1
RNA FISH, immunocytochemistry ble utført før farging med DAPI trinn over. Cellene ble vasket 3 ganger med PBS + 1% BSA og 0,1% Tween-20 og deretter blokkert ved romtemperatur i 2 timer i blokkeringsbuffer (PBS + 10% BSA, 0% normalt esel serum og 0,1% Tween-20). Objektglassene ble deretter inkubert ved 4 ° C over natten i blokkeringsbuffer inneholdende et polyklonalt antistoff rettet mot Nucleolin (1: 1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Celle ble igjen vasket 3 ganger og inkubert i 1 time ved romtemperatur i blokk oppløsning inneholdende et FITC-konjugert sekundært antistoff for visualisering av Nucleolin. Etter en siste vask, ble objektglassene er montert ved hjelp av Vectashield Antifade montering medium med DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) og avbildes som beskrevet ovenfor.
celleproliferasjonsanalyse
Celleproliferasjon ble målt ved anvendelse av Cell Proliferation ELISA BrdU (kolo) kit (Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ) i henhold til produsentens protokoll. I korthet, 48 timer etter transfeksjon, 1,0 x 10
4 celler ble sådd i en 96-brønners skål og tillatt å holde seg over natten. Celler ble deretter merket med BrdU i 2 timer, fiksert, og inkubert med anti-BrdU-POD. Ubundne peroksidase konjugater ble fjernet ved vasking. Substrat ble så tilsatt og absorbans verdier (370 nM-492 nM) ble målt 15 min senere.
PrestoBlue® celleviabilitet analysen ble også brukt i henhold til produsentens instruksjoner. Siha-celler ble transfektert med LNA som beskrevet ovenfor. Førti-åtte timer senere ble cellene sådd ut på en 96-brønners plate (1,0 x 10
4 celler /brønn) og utsatt for cisplatin (Sigma) ved et område av konsentrasjoner mellom 10-200 uM i 4 timer. Cisplatin dyrkningsmedier ble fjernet og erstattet med vekstmedier etter 4 timers eksponering og deretter inkubert ved 37 ° C over natten. Dagen etter fluorescens verdier ble målt etter inkubasjon av celler med PrestoBlue® reagens i 1 time ved 37 ° C.
celledød og apoptose analyser
Celledød ble analysert ved hjelp av celledød Detection ELISA Kit (Hoffmann-La Roche) som per produksjon retninger. I korthet, 48 timer etter transfeksjon, ble 0,5 x 10
5-celler høstet og lysert. Cellular nukleosomer ble bundet til den klargjorte ELISA-platen gjennom histone komponenter. Anti-DNA-peroksydase ble tilsatt, og ubundet peroxidase konjugater ble fjernet ved vask. Substratet ble deretter tilsatt, og absorbans-verdiene ble målt 15 minutter senere (405 nM-490 nM). Apoptose ble karakterisert ved å måle aktiv caspase-3 (ng /mg av totalt cellelysat) ved hjelp av Menneskelig Caspase-3 (aktiv) ELISA kit (Life Technologies, Grand Island, NY). Sytti-to timer etter transfeksjon, celler (1,0 x 10
6) ble lysert i Cell Extraction Buffer (Life Technologies) supplert med proteasehemmer Cocktail (Sigma) og fenylmetansulfonylfluorid (Sigma).
Cell migrasjon og invasjons analyser
Førtiåtte åtte~~POS=HEADCOMP timer etter transfeksjon ble media inneholdende serum ble fjernet og cellene ble vasket med 1 x PBS og deretter dyrket i 24 timer i serumfritt EMEM. Etter sulteperioden ble cellene høstet ved hjelp av HyQTase og belagt (1 x 10
5-celler) og på Corning Transwell Permeable Støtter (Corning, Tewksbury, MA). For migrasjonsanalyser, ble Transwell membraner utlignet i vekstmedier 24 timer før celle seeding. For invasjons analyser, ble Transwell membraner belagt med Matrigel-matrise (Corning, 1: 6 i EMEM) og tørket i 6 timer ved 37 ° C. Celler ble dyrket i nærvær og fravær av kjemoattraktant (EMEM + 20% FBS) og høstet 6 timer eller 48 timer senere for analyse av migrering og invasjon, respektivt. Non-migrant celler ble fjernet fra oversiden av Transwell membran med en bomullspinne, mens innvandrer cellene ble fiksert og farget med krystallfiolett (EMD Millipore, Billerica, MA) og visualisert /telles ved hjelp av lysmikroskopi.
Western blotting
Dypfryst cervical vev eller 3,6 x 10
6 celler ble vasket med 1x PBS og lysert i 10 min på is ved hjelp av Cell Extraction Buffer (Life Technologies) supplert med 1 mM PMSF (Sigma) og en proteaseinhibitor cocktail (Sigma). Ufordøyd celleavfall ble pelletert ved sentrifugering ved 10 000 rpm og gjenværende lysat ble kvantifisert ved anvendelse av Bradford-analyse (Sigma). Lysat (20 ug) ble kjørt ut på en Criterion Tris-HCl polyakrylamid-gel (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), overført til PVDF-membraner, blokkert med 1 x TBS + 10% fettfri tørrmelk ved romtemperatur i 1 time, og inkubert med primært antistoff (Myc eller Nucleolin, 1: 1000, Cell Signaling Technology) over natten ved 4 ° C. Den følgende dag, ble membranene vasket, inkubert i 1 time ved romtemperatur med HRP-konjugert geite-anti-kanin-IgG (1: 5000; Cell Signaling Technology), og utviklet ved bruk av ECL (Life Technologies). Chemiluminescence ble målt ved hjelp av molekylær Imager ChemiDoc XRS + (Bio-Rad Laboratories) og visualisert proteinbånd ble kvantifisert ved hjelp av Image Lab programvare (Bio-Rad Laboratories).
RNA affinitet kromatografi og massespektrometri sekvense
flere overlappende sense og antisense enkeltkjedede DNA-oligonukleotider (oligoer ssDNA; 100 nt lang) ble samlet mot de fullstendige sekvenser av eksonene 2 og 9 i
PVT1 plakater (NR_003367.3; Eurofins MWG Operon, Huntsville, AL) . Eksoner 2 og 9 ble valgt basert på deres økt tilbøyelighet for proteinbinding som bestemmes
i silico
. ssDNA ble hybridisert for å oppnå dobbelt-trådet DNA (dsDNA), som alle hadde en T7-promotersekvens på 5’end. T7 promoter-holdige dsDNA var
in vitro
-transcribed bruker MaxiScript T7 kit (Ambion) og resulterende RNA ble deretter 3′-biotinylert med Pierce Desthiobiotinylation kit (ThermoScientific). Desthiobiotinylated RNA ble inkubert med streptavidin-bundet magnetiske kuler fra Pierce Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kit (Thermo Scientific) som per produsentens protokoll. Etter vasking ble 200 ug av Siha hele cellelysatet tilsatt til RNA-bundet streptavidin magnetiske kuler og inkubert ved 4 ° C med forsiktig omrøring i 90 min. Etter 3 vasker med vaskebuffer (Thermo Scientific 20164) ble RNA bundet proteiner eluert i SDS prøvebuffer og løses ved SDS-PAGE på en 12% akrylamid gel. Etter sølv flekker, proteinbånd av interesse ble massespektrometri sekvensert ved Taplin massespektrometri Facility (Harvard Medical School, Boston, MA). Massespektrometri «treff» ble analysert for antall unike og totale peptider som oppnås og arealet under kurven. Hvert treff var
i silico
trypsin fordøyd og antall peptider oppnådd med
i silico
fordøyelsen ble sammenlignet med antall peptider oppnådd i de massespektrometri resultater. Bare de proteinene som hadde 20% eller flere av de trypsin-fordøyelig fragmentene tilstede ble ansett for å være virkelige treff. Western blotting (som beskrevet ovenfor) ved å følge RNA affinitetskromatografi ble videre anvendt for å validere de sanne treff.
RNA immunoutfelling
RNA immunoutfelling (RIP) analyser ble utført ved anvendelse av Magna RIP RNA-Binding Protein Immunoutfelling Kit (EMD Millipore) etter produsentens anvisninger. Total cellelysat fra 1,7 x 10
7 Siha celler ble brukt for immunoprecipitation med MYC og Nucleolin antistoffer (samme som for Western blotting). Som et ikke-spesifikk IgG-kontroll ble renset kanin IgG parallelt. Etter protein fordøyelse, ble RNA ekstrahert og DNase behandlet ved hjelp av DNA-fri Kit (Life Technologies). Nivåer av
PVT1
ble kvantifisert i inn- og immunopresipitert RNA.
dataanalyse og statistikk
Eksperimenter ble utført i tre paralleller og forskjeller mellom gjennomsnitts data ble analysert ved hjelp av Student
t
tester (tosidige). Resultatene er fremstilt grafisk som betyr ± standard feil av gjennomsnittet. Cisplatin dose-respons-kurver ble generert ved hjelp av en variabel skråning modell. Alle statistiske analyser og graf av data ble utført ved hjelp GraphPad Prism 6.0 (La Jolla, CA), med unntak av overlevelsesanalyse som ble utført ved hjelp SPSS11.0 programvare (Chicago, IL). Kaplan-Meier overlevelseskurver ble plottet og sammenlignet ved bruk av log-rank (Mantel-Cox) tester. P-verdier mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
PVT1
uttrykk er oppregulert i svulster fra livmorhalskreftpasienter og korrelert med dårligere overlevelse
PVT1
er en multi-ekson-genet med dets tilstøtende genomiske region som inneholder en klynge på 6 annoterte microRNAs (mirnas).
PVT1 Hotell og lokale miRNA uttrykk nivåer ble bestemt av qPCR for kreft og tilstøtende normalt vev fra livmorhalskreftpasienter.
PVT1
uttrykk var betydelig høyere i svulster fra livmorhalskreftpasienter mot tilstøtende normalt vev (n = 127 svulst; n = 30 ved normal; p 0,001; figur 1A). Uttrykk for miRNAs 1204 og 1206 (men ikke 1205, 1207-3p, 1207-5p, eller 1208, S1 A-S1D figur) var signifikant høyere i tumor mot normalt ved cervical vev (fig 1B og 1C). Av notatet, fordi
PVT1 Hotell og
MYC
ofte co-forsterket i kreft, vi i tillegg undersøkt uttrykk for
MYC
i livmorhalskreft og tilstøtende normalt vev. Selv om vi har observert en trend mot økt
MYC
i kreft i forhold til tilstøtende normalt, forskjellen i gjennomsnittlig uttrykk for
MYC
var ikke statistisk signifikant mellom disse to gruppene (S1E Fig).
(A)
PVT1
uttrykk var betydelig høyere i primære livmorhals tumorer (n = 127) sammenlignet med tilstøtende normalt cervical vev (n = 30, p 0,001). Expression of mirnas 1204 (B; p 0,05) og 1206 (C; p 0,001), men ikke andre lokale mirnas, var også betydelig høyere i cervical svulstvev (n = 38) sammenlignet med tilstøtende normalt vev (n = 18) . (D) Kaplan-Meier plott avslørte en sammenslutning av høyere svulst
PVT1
nivåer med vesentlig dårligere overlevelsestiden sammenlignet med lavere
PVT1
nivåer (p = 0,03).
de 127 livmorhalskreftpasienter ble delt inn i høy og lav
PVT1
-expressing grupper, med median
PVT1
uttrykk nivå, for å undersøke deres sammenheng med prognose. Ved hjelp av Kaplan-Meier overlevelsesanalyse og log-rank tester, fant vi at høy
PVT1
uttrykk var signifikant korrelert med kortere kumulativ overlevelse for livmorhalskreftpasienter (p = 0,03; fig 1D). Sammen utgjør disse data tyder på at, generelt,
PVT1
uttrykk er forhøyet i livmorhalskreftsvulster og at jo høyere uttrykk for
PVT1
, jo dårligere prognose.
PVT1
uttrykk i livmorhalskreftcellelinjer
til å begynne vår
in vitro
undersøkelse inn i rollen som
PVT1
i livmorhalskreftceller, fant vi ut
PVT1
uttrykk nivåer i forskjellige kommersielt tilgjengelige cervix-avledede cellelinjer via qPCR (figur 2A). Ut av 4 livmorhals linjer, HPV 16-positive Siha celler utstilt høyeste
PVT1
uttrykk, mens den laveste
PVT1
uttrykk ble observert i HPV 16 E6 /E7-transformerte celler avledet fra normal ectocervix (Ect1 /E6E7). Deretter forsøkte vi å identifisere spesifikke onkogene stressfaktorer som kan drive forbedrede
PVT1
uttrykk i livmorhalskreft. For dette formål, utsatte vi Siha celler (som brukes for resten av våre studier) til ulike transformative stimuli før måle effektene på
PVT1
uttrykk via qPCR. Interessant, fant vi at
PVT1
uttrykk i Siha celler ble betydelig økt i respons til 48 timers inkubasjon med INF-α eller hypoksi mimetisk, kobolt klorid (CoCl
2; Fig 2B). Andre stimuli, så som epidermal vekstfaktor (EGF), insulin-lignende vekstfaktor (IGF), forbol 12-myristat 13-acetat (proteinkinase C aktivator), og gamma-bestråling hadde ingen betydelig innvirkning
PVT1
uttrykket (data ikke vist). Til slutt undersøkte vi subcellulære lokalisering av
PVT1
bruker RNA FISH og fant uttrykk for
PVT1
i både cytoplasma og kjernen av Siha celler. Videre kontroll antisense-transfektert Siha (Fig 2C) viste lignende kjernekraft og cytoplasma
PVT1
flekker, som var fraværende i
PVT1
knockdown celler (Fig 2D). I sammendrag,
PVT1
blir uttrykt i forskjellige cellelinjer avledet fra humant livmorhalsen, kan utvides ved å immun og hypoksiske stimuli, og er lokalisert gjennom hele kjernen og cytoplasma som tyder på at dette lncRNA kan delta i forskjellige livmorhalskreft celleprosesser , muligens via mer enn en unik mekanisme.
(A)
PVT1
uttrykk i kommersielt tilgjengelige livmorhalscellelinjer. Laveste
PVT1
uttrykk ble observert i HPV 16 E6 /E7-transformerte celler avledet fra normal ectocervix (E6 /E7-Ecto), mens Siha livmorhalskreftceller vises den høyeste
PVT1
uttrykk i forhold til 2 andre livmorhalskreft-avledet linjer (HeLa og DoTc2). (B) Uttrykk for
PVT1
i Siha celler ble ytterligere økt på 48t behandling med INF-α (10 mm) eller hypoksi mimetisk kobolt klorid (CoCl
2; 150 mm). Representative bilder av RNA FISH eksperimenter i Siha celler transfektert med enten kontroll (C) eller
PVT1 product: (D) LNAs. Kontroll LNA-transfekterte celler utstilt punctate signaler for
PVT1 plakater (rød) i både kjernen (farget med DAPI i blått) og cytoplasma. Både kjernekraft og cytoplasma
PVT1
farging var fraværende i
PVT1
LNA-transfekterte celler. Fase bilde (nederst til venstre panel) viser celle morfologi. Scale bar (hvit) = 10 mikrometer. * P 0,05, ** p 0,01
PVT1
lyddemping avtar livmorhalskreftcelle spredning, migrasjon og invasjon
Deretter Siha celler transfektert med
PVT1
-targeted siRNA (siPVT1) ble benyttet for å undersøke effekten av denne lncRNA på livmorhalskreft celleproliferasjon og bevegelighet. Transfeksjon med
PVT1
for målretting sirnas resulterte i, i gjennomsnitt 70% knockdown av
PVT1
sammenlignet med kontroll-transfekterte celler (figur 3A). Videre var det ingen signifikant forskjell i lokal miRNA (1204-1208) eller
MYC
mRNA uttrykk i siPVT1 versus eggekontroll-transfekterte celler (siCONT; S2 fig). siPVT1-transfekterte Siha-celler viste en betydelig nedgang i BrdU-inkorporering, er et mål på replikerende celler, ved 72 timer etter transfeksjon i forhold til siCONT, noe som tyder på at
PVT1
spiller en rolle i å drive celleproliferering (figur 3B). Disse effektene av
PVT1
knockdown på Siha spredning ble også bekreftet ved transfeksjon med
PVT1
-targeted LNA. Til slutt, i forhold til siCONT celler, viste siPVT1 celler en betydelig reduksjon i migrasjon (figur 3C) og invasjon (figur 3D) potensial. Av notatet, disse effektene av
PVT1
knockdown blir etterlignet i et annet livmorhalskreft cellelinje, HeLa (S3 figur), noe som gir ytterligere støtte for en rolle i denne lncRNA i livmorhalskreftutvikling.
(A ) Transfeksjon fra Siha livmorhalskreftceller med sirnas målretting
PVT1 plakater (siPVT1) resulterte i en tilnærmet 70% knockdown i
PVT1
lncRNA uttrykk i forhold til celler transfektert med en egge kontroll siRNA (siCONT) . (B) Siha celler transfektert med siPVT1 oppviste en signifikant reduksjon i proliferasjon sammenlignet med siCONT celler. Transfekterte Siha celler ble også testet for endringer i (C) migrasjon og (D) invasjon 6 timer eller 48 timer etter innføring av kjemoattraktant (FBS), respektivt. siPVT1 celler viste en signifikant reduksjon i både celle-migrering og invasjon i forhold til siCONT celler. Kvantitative resultater fremstilles grafisk på venstrekanten, mens representative bilder er på rett. *** P 0,001, **** p 0,0001
PVT1
lyddemping øker apoptose og respons på cisplatin i livmorhalskreftceller
Til dags dato, siRNA-mediert knockdown strategier målretting
PVT1
har vist sin rolle i cisplatin følsomhet i ondartet pleural mesothelioma [25] og mage kreftceller [26]. Men anti-apoptotiske signatur indusert av
PVT1
i andre kreftcelletyper [8,18,20,26] kan tyde på at dens bidrag til cisplatin motstand er mer vidtrekkende. Dermed ble vår neste eksperimenter designet for å undersøke hvilken rolle
PVT1
i apoptose og cisplatin følsomhet i livmorhalskreftceller. Utvide de tidligere nevnte funnene, viser våre resultater at
PVT1
knockdown i Siha celler betydelig økte nivåer av cytoplasmatiske histon-assosierte DNA-fragmenter (figur 4A) og aktiv caspase-3 (fig 4B), noe som tyder på at
PVT1
kan også bidra til livmorhalskreft via hemming av celledød og apoptose. Videre
PVT1
knockdown ved enten siRNA (Fig 4C) eller LNA oligonukleotider (fig 4D) fører til økt respons av Siha celler til cisplatin. Samlet cellen fenotypiske (tap av
PVT1
) funksjonell data tyder på at
PVT1
er nødvendig for spredning, vedlikehold og cisplatin motstand av livmorhalskreftceller.
siPVT1 celler utstilt en signifikant økning i celle-død (A) og apoptose (B) sammenlignet med siCONT celler. (C) Spredning av siPVT1 Siha celler ble betydelig redusert som følge av gjentatte doser av cisplatin. (D) Dose-responskurve for kontroll og
PVT1
LNA-transfekterte Siha celler etter fire timers behandling med cisplatin.
