Abstract
fluorpyrimidiner 5-fluorouracil (5-FU) og FdUrd (5-fluordeoksyuridin; floxuridin) er ryggraden i kjemoterapiregimer for tykktarmskreft og andre svulster. Til tross for sin omfattende bruk, er det fortsatt uklart hvordan disse agentene drepe kreftceller. Her har vi analysert checkpoint og DNA-reparasjons trasé som påvirker kolon tumorrespons til 5-FU og FdUrd. Disse studiene viser at både FdUrd og 5-FU aktivere ATR og ATM sjekkpunkt signalveier, noe som indikerer at de forårsaker gentoksisk skade. Spesielt, men uttømming av ATM eller ATR ikke sensibiliserer tykktarmskreftceller til 5-FU, mens disse sjekkpunkt trasé fremme overlevelse av celler behandlet med FdUrd, noe som tyder på at FdUrd utviser cytotoksisitet ved å forstyrre DNA-replikasjon og /eller indusere DNA-skade, mens 5-FU ikke. Vi har også funnet ut at å deaktivere basen excision (BER) reparere veien ved å tappe XRCC1 eller APE1 lysfølsomt tykktarmskreftceller til FdUrd men ikke 5-FU. I samsvar med en rolle for BER vei, viser vi at lite molekyl poly (ADP-ribose) polymerase 1/2 (PARP-hemmere), AZD2281 og ABT-888, bemerkelsesverdig sensibilisert både mismatch reparasjon (MMR) -proficient og -deficient tykktarmskreft cellelinjer til FdUrd men ikke til 5-FU. Samlet utgjør disse studiene viser at rollene genotoxin-indusert sjekkpunkt signalering og DNA-reparasjon signifikant forskjellig for disse agentene og også foreslå en ny tilnærming til tykktarmskreft terapi der FdUrd er kombinert med et lite molekyl PARP hemmer.
Citation: Geng L, Huehls AM, Wagner JM, Huntoon CJ, Karnitz LM (2011) Checkpoint Signa, Base Eksisjon Reparasjon og PARP fremme overlevelse for tykktarmskreft celler behandlet med 5-fluordeoksyuridin men ikke 5-Fluorouracil. PLoS ONE 6 (12): e28862. doi: 10,1371 /journal.pone.0028862
Redaktør: Abbes Belkhiri, Vanderbilt University Medical Center, USA
mottatt: 02.08.2011; Godkjent: 16 november 2011; Publisert: 15.12.2011
Copyright: © 2011 Geng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grants R01-CA084321 (LK), P50-CA136393 (LK), GT32-M072474 (AH), en Mayo Clinic Eagles Pilotprosjekt Award, og Mayo Clinic. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
5-fluorouracil har aktivitet i flere kreftformer og er en av de mest foreskrevne legemidler mot kreft, men det mest vanlige bruken er i tykktarmskreft, hvor det er grunnlaget for alle moderne tykktarm kreft terapi. Etter opptak inn i cellene, gjennomgår 5-FU kompleks metabolske reaksjoner (figur 1A; rev i [1]..) For å fremstille 3 kjente cytotoksiske metabolitter: FUTP (5-fluoruridin trifosfat), FdUMP (5-deoksyuridin-monofosfat), og FdUTP ( 5-deoxyuridine trifosfat). Den FUTP påvirker RNA-metabolisme etter at den er inkorporering i cellulært RNA, hvor det forstyrrer snRNA, tRNA, rRNA og behandling, så vel som den ribonucleolytic aktiviteten av exosome og pseudouridylation av RNA [2] -. [8]
( A) Metabolisme av 5-FU og FdUrd. (B, C), HT29 (B) og HCT-8 (C) celler ble behandlet med 5-FU (80 uM, HT29-celler; 200 uM HCT-8 celler), FdUrd (40 uM for begge cellelinjer), eller 10 mM hydroksyurea (HU) i de angitte tidsrom. Celleekstrakter ble blottet for fosfor-Ser317-Chk1 (P-Chk1), fosfor-Thr68-Chk2 (P-Chk2), Chk1, eller Chk2. TS, tymidylatsyntase; TP, tymidinfosforylase; UP, uridin fosforylase; Storbritannia, uridin kinase; OPRT, orotate phosphoribosyltransferase; RR, ribonukleotidreduktase; FUR, 5-fluorouridin; FUMP, 5-fluorouridin monofosfat; FUDP, 5-fluorouridin difosfat; FUTP, 5-fluorouridin trifosfat; FdUMP, 5-fluordeoksyuridin monofosfat; FdUDP, 5-fluordeoksyuridin difosfat; FdUTP, 5-fluordeoksyuridin trifosfat.
I kontrast FdUMP og FdUTP forstyrre DNA metabolisme. Disse metabolitter blir produsert etter omdannelsen av 5-FU til FdUrd (5-fluordeoksyuridin, floxuridin), som også er et FDA-godkjent kjemoterapi middel for behandling av kreft i tykktarmen [9] og blir ofte ansett for å ha en lignende virkningsmekanisme som 5-FU. FdUrd er så fosforylert til FdUMP og videre fosforylert til FdUTP [1]. Den FdUMP hemmer tymidylatsyntase (TS), som hindrer konvertering av dump til dTMP, slutt forårsaker uttømming av dTTP, akkumulering av dUTP, og avbrudd av dNTP forholdstall. I motsetning til dette, FdUTP, så vel som den akkumulerte dUTP, blir inkorporert i DNA
I samsvar med deres evne til å forstyrre dNTP nivåer, både FdUrd og 5-FU aktivere ATR sjekkpunktet signalveien [10] -. [17 ], vil en bane som blir utløst når DNA replikasjon er sperret, og at også spiller viktige roller i å fremme overlevelse av celler som opplever replikasjon spenning som produseres av dNTP avbrudd og /eller DNA-lesjoner [18]. Når aktivert, phosphorylates ATR flere underlag, inkludert Chk1. De kollektive kinase aktiviteter ATR og Chk1 organisere S-fasen sjekkpunkt og regulere DNA-reparasjon for å fremme celle levedyktighet og utvinning [19]. I tillegg er 5-FU og FdUrd også forårsake dobbeltkjedet DNA pauser [20], [21], som i sin tur aktiverer ATM sjekkpunktet signalveien. ATM-reaksjonsveien også regulerer celleoverlevelse ved enten å indusere apoptose eller forhindring av cellesyklusprogresjon og aktivering av DNA-reparasjon, som begge fremmer overlevelse [22]. Spesielt, men er det fortsatt uklart om ATR og /eller minibank sjekkpunkt trasé spiller viktige roller i å bestemme overlevelse av menneskelige tykktarmskreftceller, celler som er målrettet med 5-FU og FdUrd hos pasienter når de behandles med disse midlene .
uracil og 5-FU som er innlemmet i genomet er også anerkjent av to DNA-reparasjon trasé som kan spille roller i overlevelse av celler behandlet med 5-FU og FdUrd. En reaksjonsvei er base excision reparasjon (BER) pathway [1], [23]. I denne veien, genomisk innlemmet uracil og 5-FU er først anerkjent av uracil glykosylaser, som Vesenet lesjonen, og etterlater en abasic nettstedet. Den abasic nettstedet er videre behandlet av en endonuklease (f.eks APE1), og skaper et enkelttrådet DNA pause som er anerkjent av poly (ADP-ribose) polymerase, som poly (ADPribosyl) Ates seg samt andre reparasjoner proteiner, rekruttere XRCC1 og andre proteiner som fullstendig reparasjon [24]. Undersøkelser av rollen til BER i celler behandlet med 5-FU eller FdUrd har nådd uensartede konklusjoner ved hjelp av en rekke modellsystemer. Gitt at disse studiene har vist at deaktivering av BER beskytter, sensitizes, eller har ingen effekt på cytotoksisiteten indusert av 5-FU og FdUrd i disse forskjellige systemene, inkludert mus [17], [23], [25] – [35], det er fortsatt uklart hva som eventuelt spiller rolle BER i overlevelse av tykktarm kreft celler eksponert for 5-FU eller FdUrd.
den andre impliserte reparere veien er mismatch reparasjon (MMR) system.
In vitro
studier har funnet at MMR vei kan fjerne 5-FU fra kunstig underlag som inneholder 5-FU: G mispairs. Spesielt, men studier i celler tyder på at MMR spiller bare en mindre rolle i eksisjon av 5-FU lesjoner i genomet [35]. Analyser av virkningene av MMR-reaksjonsveien på cellelevedyktigheten etter behandling med 5-FU og FdUrd har generelt indikert at celler med defekt MMR er mer resistente mot 5-FU og FdUrd [10], [36] – [38], et resultat konsistent med funn at MMR-defekte tykktarmskreftpasienter ikke dra nytte av 5-FU terapi [39].
Gitt flere virkningsmekanismer av 5-FU og FdUrd og det brede spekter av eksperimentelle systemer som brukes i disse studiene (inkludert studier på mus cellelinjer og i humane cellelinjer avledet fra svulster som vanligvis ikke behandles med 5-FU eller FdUrd), har vi satt i gang undersøkelser for å håndtere rollene til enkelte sjekkpunkt signalering og DNA-reparasjons trasé i humane celler avledet fra humane tumorer. I vår første analysen, fant vi at 5-FU og FdUrd har svært ulike virkningsmekanismer i eggstokkreft celler [17]. Deaktivering av ATR eller BER lysfølsomt disse cellene til FdUrd, men ikke 5-FU, noe som indikerer at FdUrd dreper celler ved å forårsake DNA-skade, og at 5-FU utøver sin cytotoksisitet av en annen mekanisme, muligens ved å forstyrre RNA metabolisme. Spesielt har vi også funnet at PARP-hemmere, som har vist enestående aktivitet mot ovarietumorer og andre svulster som har mutert
BRCA1 Hotell og
BRCA2 product: [40] – [43], bemerkelsesverdig sensibilisert eggstokkreft celler til FdUrd men ikke 5-FU [17]. Gitt at FdUrd er aktiv i eggstokkreft [44], [45], som mangler i
BRCA1 Hotell og
BRCA2 plakater (eller andre gener i homolog reparasjon sti) er vanlig i eggstokkreft [ ,,,0],46], og at PARP-inhibitorer vil sannsynligvis ha en rolle i behandlingen av eggstokk-kreft [24] disse resultatene antydet en ny terapeutisk strategi i eggstokkreft. Spesielt, men biologi eggstokkreft er svært forskjellig fra biologien til tykktarmskreft. De onkogener og tumorsuppressorgener ofte mutert i tykktarm kreft (
APC, p53, PI3K, KRAS
) skiller seg fra genene ofte mutert i eggstokkreft (
NF1, RB1, CDK12, CCNE1, HAKK
) [46], [47]. Videre DNA reparasjon veier som er forstyrret i tykktarm kreft celler er vesentlig forskjellig fra de forstyrret i eggstokkreft. For eksempel gener som kreves for mismatch reparasjon pathway (f.eks
MLH1 Hotell og
MSH2
) er ofte mutert eller epigenetiske forstummet i tykktarm kreft [39], [48], mens defekter i homolog rekombinasjon (f.eks
BRCA1 Hotell og
BRCA2
mutasjoner) forekommer i eggstokkreft [46], [47]. Til slutt, eggstokkene og colontumorer har svært ulike reaksjoner på 5-FU. Mens 5-FU har svært begrenset aktivitet i eggstokkreft [49], [50], er 5-FU hjørnesteinen for alle kjemoterapiregimer som brukes til å behandle tykktarm kreft på grunn av høy aktivitet i denne sykdommen [1]. Derfor, gitt disse biologiske forskjellene mellom eggstokkene og tykktarm kreft, og det faktum at 5-FU er universelt brukt i tykktarm kreft kjemoterapi-regimer, har vi nå bestemt hvordan 5-FU og FdUrd drepe tykktarmskreftceller til å få viktige innsikter ligger til grunn for biologi disse midler og forbedrer deres anvendelse i klinikken for behandling av denne sykdommen. For å nå dette målet, har vi startet en systematisk analyse av rollene genotoxin-aktivert sjekkpunkt signalering, BER vei, og MMR sti ved å tappe viktige signalmellomprodukter i disse banene ved hjelp av svært effektive sirnas. Disse funnene ikke bare ytterligere belyse vår forståelse av signal- og DNA-reparasjonsveier som er viktige i disse cellene, de også avsløre at kolon tumorceller blir sensibilisert for FdUrd av små molekyl PARP-inhibitorer som er i kliniske studier, og dermed tyder på en roman terapeutisk tilnærming som kombinerer FdUrd, et stoff som er godkjent for behandling av tykktarmskreft, med en PARP hemmer, en ny klasse av agenter med spennende kreft aktivitet.
Materialer og metoder
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP og kultur
HT29, HCT-8, og HCT-116 celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection. HCT-116.ch2 og HCT-116.ch3 [51] celler var fra Scott Kaufmann (Mayo Clinic). Celler ble dyrket i RPMI-1640 medium (Mediatech) supplert med 10% føtalt bovint serum (Atlanta Biologicals) ved 37 ° C i 5% CO
2. For klonogene analyser ble mediet supplert med 100 U /ml penicillin og 100 mikrogram /ml streptomycin (Mediatech)
Materialer
reagenser var fra følgende leverandører:. 5-fluorouracil (APP Pharmaceuticals ), FdUrd (Bedford Laboratories), ABT-888 (Selleck Kjemikalier og ChemieTek), AZD2281 (ChemieTek), KU-55933 (Tocris Bioscience), gemcitabin (Eli Lilly), SuperSignal Pico West (Thermo Scientific). Alle andre materialer var fra Sigma-Aldrich
Antistoffer var som følger:. Fosfo-Ser317-Chk1 (R fosfor-Thr68-Chk2, ATR, pepperrot peroksidase-bundet kanin IgG, og pepperrot peroksidase bundet mus IgG (Cell Signaling); Chk1 (Santa Cruz Biotechnology); Chk2 og ATM (Epitomics); APE1 (Abcam); XRCC1 (Bethyl Laboratories); beta-aktin (Sigma-Aldrich); og HSP90, D. Toft (Mayo Clinic, Rochester, MN).
Cell transfections og små interfererende (SI) RNA
sirnas ble transfektert ved elektroporering som beskrevet [17]. De transfekterte celler ble dyrket i 48 timer før bruk. Sekvenser sirnas var: ATM-en, 5′-GCACCAGUCCAGUAUUGGC-3 «[52]; ATR-2, 5»-CCUCCGUGAUGUUGCUUGA-3 «[53]; XRCC1-2, 5»-CUCGACUCACUGUGCAGAA-3 «[54]; APE1, 5»-GGACAGAGCCAGAGGCCAA-3 «; MLH1, 5»-GGAAGAUUCUGAUGUGGAA-3 «; MSH2, 5»-GAUCCUAAUCUCAGUGAAU-3 «; og luciferase, 5»-CUUACGCUGAGUACUUCGA-3 «[55].
klonogene analyser, cellelyse, og celle bestråling
Cellesyklus analyser, klonogene analyser, cellelyse, immunoblotting og farging ble utført som beskrevet [56], [57]. For klonogene analyser ved hjelp av ikke-transfekterte celler, ble prosent overlevelse av alle individuelle og kombinasjonsbehandlinger normalisert til celler behandlet med bilen bare. For klonogene analyser ved anvendelse av celler transfektert med siRNA, ble prosent overlevelse ved hver medikamentkonsentrasjon normalisert til de bærer-behandlet kontrollgruppe for den gitte siRNA. Celler ble bestrålt med en RS-2000 Biologisk irradiator, Rad Source (Suwanee, GA) 4-6 timer etter plating.
Resultater
5-FU og FdUrd aktivere ATR og ATM sjekkpunkt signale trasé i tykktarm kreft celler
for å vurdere virkningene av 5-FU og FdUrd på ATM og ATR sjekkpunkt signalveier, sammenlignet vi evnene til disse midlene for å aktivere sjekkpunkt signalering i to tykktarmskreft cellelinjer: HT29, som har et funksjonelt MMR system, og HCT-8, som har en mutasjoner i
MSH6
og er MMR mangelfull [58]. Celler ble behandlet med konsentrasjoner av hvert middel som hemmer clonogenicity med 90% (IC
90) og, som en positiv kontroll, replikering inhibitor hydroksyurea. Aktivering av ATM og ATR trasé ble deretter vurdert av immunoblotting for fosforylert Chk1 og Chk2, to protein kinaser som er fosforylert og aktivert av ATR og ATM [59]. Disse studiene viste at 5-FU og FdUrd aktivert sterkt Chk1 og Chk2 i HT29 celler (Fig. 1B), med 5-FU forårsaker enda større grad av Chk1 fosforylering enn gjorde FdUrd. Tilsvarende, i HCT-8 celler, begge midler indusert fosforylering Chk1 (Fig. 1C); men i disse cellene 5-FU indusert mindre Chk1 enn gjorde FdUrd. Analyser av Chk2 fosforylering var ikke mulig på grunn av svært lave nivåer av Chk2 i HCT-8 celler (data ikke vist). Samlet utgjør disse resultatene viser at begge legemidlene føre gentoksisk skade som aktiverer sjekkpunktsignalveier i tykktarm kreft celler.
ATR og ATM fremme overlevelse av tykktarm kreft celler behandlet med FdUrd men ikke 5-FU
ATM og ATR er de to apikale kinase regulatorer av genotoxin-indusert sjekkpunkt signalering. For å bestemme om enten ATM eller ATR aktivere trasé som påvirker overlevelse av celler behandlet med FdUrd eller 5-FU, vi forbigående utarmet ATM og ATR ved hjelp av sirnas, og deretter vurderes kapasiteten av celler behandlet med graderte konsentrasjoner av FdUrd eller 5-FU til sprer hjelp klonogene analyser. Overraskende, uttømming av ATM eller ATR ikke sensibiliserer enten cellelinje til 5-FU (fig. 2A og 2B), selv om dette middel aktivert disse banene (se Fig. 1B og 1C). En langt annet bilde dukket opp når cellene ble behandlet med FdUrd. Uttømming av ATR dramatisk sensibilisert HT29-celler til FdUrd (Fig. 2B) og til gemcitabin (fig. S1A), en nukleosid-analog som inhiberer ribonukleotid-reduktase og forstyrrer DNA-replikasjon når den inkorporeres i DNA [60]. I motsetning til dette, ATM tømming (fig. 2A) og ATM-inhibitor KU-55933 [61] (fig. S1C), som begge er sensibilisert overfor ioniserende stråling (fig. S1B og Fig S1D), hadde minimal effekt på FdUrd cytotoksisitet. Lignende resultater ble også sett i HCT-8, og HCT-116-celler, der ATR uttømming sensibilisert begge cellelinjer til FdUrd men ikke 5-FU (Fig. 3).
(A, B) HT29-celler, transfektert med kontroll (Luc), ATM (A), eller ATR (B) sirnas, ble platet som enkeltceller, som er utsatt for de angitte konsentrasjoner av 5-FU eller FdUrd i 24 timer, vasket, dyrket i 10 d, og farget med Coomassie Blå. Transfekterte celler ble også sekvensielt immunoblottet (innfellinger) for å påvise ATM, ATR, og HSP90 (som en lasting kontroll). *, Uspesifikk band.
(A, B) HCT-8 (A) eller HCT-116 (B) celler transfektert med kontroll (Luc) eller ATR sirnas ble belagt som enkeltceller, utsatt for de angitte konsentrasjoner av 5-FU eller FdUrd i 24 timer, vasket, dyrket i 10 d, og farget med Coomassie-blått. Transfekterte celler ble også sekvensielt immunoblottet for ATR og HSP90 (en laste kontroll). *, Uspesifikk band.
Forstyrrelse av BER ved å tappe XRCC1 sensitizes å FdUrd men ikke 5-FU
5-FU og FdUrd føre til opphopning av uracil og 5-fluorouracil i genomisk DNA [23], [62]. Studier ved anvendelse av renset uracil glykosylaser har vist at syntetiske substrater som bærer uracil og 5-fluorouracil substituenter er substrater for BER maskineri [35], [63] – [70]. Videre, en fersk rapport viste at i intakte celler, uracil glykosylaser fjerne 5-FU fra genomene til tykktarmskreftceller eksponert for FdUrd [35]; særlig, men i disse studiene, uttømming av de glykosylaser ikke påvirke følsomheten til FdUrd. Derfor, for å undersøke om deaktivering BER påvirket følsomheten av HT29 celler til FdUrd, brukte vi sirnas å utarme XRCC1 og APE1, to nedstrøms sentrale aktører i BER vei, og undersøkt deres følsomhet for FdUrd. Betydelig, uttømming av XRCC1 (fig. 4) og APE1 (fig. S2) sensibilisert celler til FdUrd. I motsetning til dette ble XRCC1 uttømming ikke sensibilisere disse cellene til 5-FU (fig. 4), noe som indikerer at BER ikke spiller en rolle i å fremme overlevelse av celler behandlet med 5-FU og videre som tyder på at 5-FU utøver sin cytotoksiske effekter uavhengig av DNA-replikasjon eller skade.
HT29-celler transfektert med kontroll (Luc) eller XRCC1 siRNA ble platet som enkeltceller, utsatt for de angitte konsentrasjoner av 5-FU eller FdUrd i 24 timer, vasket, dyrket i 10 d, og farget med Coomassie blå. Transfekterte celler ble også sekvensielt immunoblottet for XRCC1 og beta-aktin (en lasting kontroll).
lite molekyl PARP-inhibitorer bevisst tykktarm kreft celler til FdUrd men ikke 5-FU
Gitt at XRCC1 og APE1 utarming sensitivisert tykktarmskreftceller til FdUrd, og at PARP spiller en nøkkelrolle i BER, begrunnet vi at PARP-hemmere kan bevissttykktarmskreftceller til FdUrd. Vi utsatte derfor HCT-8 og HT29-celler til graderte konsentrasjoner av FdUrd eller 5-FU sammen med 3 uM ABT-888 (veliparib [71]), en konsentrasjon som er rapportert tidligere for å sensibilisere flere tumorcellelinjer til en rekke kjemoterapeutika [17], [72]. Som vist på fig. 5, ABT-888 robust sensibilisert HCT-8 og HT29 celler til FdUrd, mens ABT-888 ikke endre antiproliferative effekter av 5-FU. For ytterligere å demonstrere at PARP-inhibitorer bevisstgjøre disse cellene til å FdUrd, vi også testet PARP hemmer AZD2281 (olaparib [73]), som har vist enestående aktivitet i kraftig behandlet pasienter med BRCA1- og BRCA2-mangel svulster [40] – [43] . I likhet med resultatene sett med ABT-888, AZD2281 robust sensibilisert begge cellelinjene til FdUrd (Fig. 5), ytterligere støtter ideen om at PARP hemming sensitizes tykktarmskreftceller til FdUrd.
HCT-8 eller HT29 celler ble belagt som enkeltceller, som er utsatt for de angitte konsentrasjoner av 5-FU eller FdUrd sammen med 3 uM ABT-888, 300 nM AZD2281, eller vehikkel i 24 timer. Etter vask, tre mikrometer ABT-888 eller 300 nM AZD2281 ble gjenskapende, og cellene ble dyrket i 10 d og farget med Coomassie blå.
Små molekyl PARP hemmer allergi til FdUrd er uavhengig av MMR status
Tidligere rapporter vist at celler med defekter i MMR er mer motstandsdyktig mot FdUrd [10], [36] – [38]. Tilsvarende pasienter behandlet med 5-FU ikke dra nytte av 5-FU-baserte chemotherapies [39], noe som tyder på at en intakt MMR sti fremmer drap med 5-FU. For å kombinere FdUrd med en PARP-inhibitor kan være en potensiell terapeutisk strategi, begrunnet vi at det ville være viktig for å bestemme om tumorceller med defekter i MMR, som forekommer i 15-20% av kolon-kreft [39], ble sensibilisert for FdUrd etter en PARP hemmer. For å vurdere hvordan MMR status påvirker følsomheten for tykktarmskreftceller til å FdUrd alene og kombinasjonen av FdUrd pluss AZD2281 vi brukte to modellsystemer. For det første modellsystemet, brukte vi sirnas å utarme MSH2 og MLH1. Begge sirnas var meget effektiv, noe som nesten fullstendig tap av MLH1 og MSH2 (Fig. 6A) og forstyrre MNNG (N-metyl-N»-nitro-N-nitrosoguanidin) -indusert G2 /M arrest (fig. S3), hvilken krever en funksjonell MMR vei [51]. Spesielt, HT29 celler utarmet av MLH1 eller MSH2 ble alvorlig sensibilisert for FdUrd av AZD2281, og var beskjedent motstandsdyktig mot FdUrd alene.
(A) HT29 celler transfektert med kontroll (Luc), ble MSH2, eller MLH1 sRNAs belagt som enkeltceller, som er utsatt for de angitte konsentrasjoner av 5-FU eller FdUrd i 24 timer, vasket, dyrket i 10 d, og farget med Coomassie-blått. Transfekterte celler ble også sekvensielt immunoblottet for MSH2 eller MLH1 og beta-aktin (en lasting kontroll). (B) HCT116.ch2 og HCT116.ch3 cellene ble utsatt for de angitte konsentrasjoner av FdUrd sammen med bærer eller 300 nM AZD2281 i 24 timer. Etter vasking, AZD2281 ble gjen tilsatt og cellene ble dyrket i 8 d å tillate kolonidannelse.
For andre modellsystemet, brukte vi den sammenkoblede kolon cellelinjer, HCT-116.ch2 og HCT-116.ch3 [51]. Disse cellelinjer ble avledet fra paren HCT-116-celler, som har biallelic inaktive
MLH1
mutasjoner som gjør dem MMR-manglende [74]. HCT-116.ch3 cellene inneholder et ekstra kromosom 3, som koder for et funksjonelt MLH1 som gjenoppretter MMR. HCT-116.ch2 celler, som brukes som en kontroll, inneholde en ytterligere kromosom 2 og som foreldrecellene er MMR-mangelfull. I samsvar med tidligere publiserte resultater, MMR mangelfulle HCT-116.ch2 celler ble beskjedent mer motstandsdyktig mot FdUrd enn var HCT-116.ch3 celler (Fig. 6B), som er MMR dyktig [75]. Spesielt, men AZD2281 robust sensibilisert begge cellelinjer til FdUrd. Samlet utgjør disse resultatene viser at tykktarmskreftceller med defekter i MMR veien kan også bli gjort oppmerksomme på FdUrd av et lite molekyl PARP hemmer.
Diskusjoner
5-FU er blant de mest brukte anticancer kjemoterapi agenter, er og det (eller 5-FU prodrug kapecitabin) ryggraden i alle kjemoterapi regimer som brukes til å behandle kreft i tykktarmen [1], den tredje største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i USA [76]. Til tross for sin utbredte anvendelse ved behandling av kreft i tykktarmen, er det fortsatt uklart hvordan dette middel dreper kolon tumorceller. Tilsvarende FdUrd, som ofte er ansett for å ha en lignende virkningsmekanisme for 5-FU, blir også brukt til å behandle tumorer som har spredning til leveren. For å få innsikt i hvordan disse midlene påvirker tykktarmskreftceller vi først gjennomført omfattende analyser av rollene til ATM og ATR sjekkpunkt signalveier i tykktarm kreft celler eksponert for 5-FU og FdUrd, og deretter analysert rolle BER vei, en reparasjon sti som fjerner uracil og uracil analoger som er innlemmet i genomet. Vi har tidligere sammenlignet mekanismer som 5-FU og FdUrd drepe eggstokkreft celler. Spesielt, men 5-FU har svært begrenset klinisk aktivitet mot kreft i eggstokkene [49], [50], og den DNA-reparasjonsveier som er avbrutt i eggstokkreft forskjellige fra de som er avbrutt i tykktarmskreft. Spesielt eggstokkreft ofte stille «BRCAness» på grunn av feil i
BRCA1
eller
BRCA2
eller andre ufullstendig angitte endringer som forstyrrer homolog rekombinasjon DNA reparasjon vei [46]. I motsetning til dette, i coloncancere mismatch reparasjon reaksjonsveien blir ofte mutert eller dempet [39], [48], og MMR-reaksjonsveien er blitt rapportert å påvirke celledreping etter 5-FU og FdUrd [36] – [38], [77 ], [78]. Derfor, i denne rapporten, har vi utført head-to-head sammenligning av disse midlene i MMR-dyktige og -deficient tykktarm kreft celler som har blitt utarmet av viktige sjekkpunkt signal- og BER pathway mellomprodukter. Viktigere, har disse mekanistiske studier avdekket ny innsikt i hvordan disse agentene drepe tykktarmskreftceller og oppdaget et potensielt terapeutisk strategi mot tykktarmskreft.
Først våre studier viste ATR-men ikke ATM-sjekkpunkt signalveien spiller en avgjørende rolle lette overlevelse av celler behandlet med FdUrd. Selv om tidligere studier dokumentert at FdUrd aktiverer ATM- og ATR-avhengige sjekkpunkter [10], [13], [79], gjorde disse studiene ikke sammenligne effektene av ATM og ATR nedbryting på overlevelse av kreftceller eksponert for både agenter. Her har vi adressert dette spørsmålet. Overraskende, har vi funnet at selv om FdUrd har blitt rapportert å forårsake dobbelt DNA pauser [20], [21], har ATM bare en mindre rolle i FdUrd-indusert drapet. I kontrast, ATR uttømming alvorlig lysfølsomt til FdUrd, viser at ATR spiller en avgjørende rolle i å stabilisere fastlåste replikering gafler og hindre deres kollaps, og dermed fremme celle overlevelse når cellene behandles med replikering hemmere slik som nukleosid analog gemcitabin [60]. Derfor er de foreliggende studier tyder på at den avbryter DNA-replikasjon som forekommer når TS er sperret og påfølgende avbrudd av dNTP nivåer er sannsynligvis en viktig mekanisme ved hvilken FdUrd forårsaker cytotoksisitet.
For det andre, de foreliggende resultatene bidra til å avklare rolle BER i tykktarm kreft celler eksponert for 5-FU og FdUrd. Tidligere studier har undersøkt rollen til BER reaksjonsveien har funnet uensartede resultater, med øket, redusert, eller uforandret følsomhet for 5-FU eller FdUrd i en rekke eksperimentelle systemer [17], [23], [25] – [35]. I motsetning til de foreliggende resultater viser at XRCC1 uttømming sensitizes til FdUrd men ikke 5-FU. Dette funnet, sammen med våre publiserte studier som viser at en intakt BER sti beskytter eggstokkreft celler behandlet med FdUrd [17], viser at FdUrd påfører lesjoner som er cytotoksiske til noen menneskelige kreftceller. I samsvar med disse funnene, to kraftige og svært spesifikke lite molekyl hemmere av PARP også sensibilisert for FdUrd. Disse resultatene er i likhet med det som ble observert i eggstokkreft celler [17]. Men gitt at eggstokkreft celler viser ofte BRCAness (på grunn av feil i homolog rekombinasjon) [46], [80], en fenotype som gjør cellene utsøkt sensitive til PARP-inhibitorer [81], forble det et ubesvart spørsmål om PARP-inhibitorer ville også bevisst å FdUrd i tykktarm kreft celler, som ikke har defekter i homolog rekombinasjon. Det bør imidlertid bemerkes, at selv om våre funn XRCC1 sterkt støtte en beskyttende rolle for BER, kan virkningene av de PARP-inhibitorer være mer komplisert. PARP spiller ikke bare en viktig rolle i BER men deltar også i andre DNA-reparasjonsbaner og cellesignalveier, øke muligheten for at den enorme allergi sett med PARP-inhibitorer kan stamme fra virkning på BER samt andre cellulære veier.
for det tredje, de nåværende studier viser at tappe apikale regulatorer av sjekkpunkt signale (ATR og ATM) eller deaktivere taste BER pathway medlemmer (med XRCC1 og APE1 sirnas eller PARP-hemmere) ikke bevisst til 5-FU. Slike resultater antyder sterkt at 5-FU er å utøve sine cytotoksiske effekter uavhengig av dens virkninger på DNA replikasjon eller integritet. Spesielt er dette resultatet i samsvar med en rekke studier som viser at 5-FU medierer celledreping ved inkorporering inn i RNA og interferere med RNA metabolismen [82] – [89]. I motsetning til dette funnet at deaktivering av ATR og BER veier sterkt sensitizes til FdUrd, indikerer at dette middel dreper colon-tumorceller i første rekke ved å påvirke DNA-metabolisme, noe som viser at 5-FU og FdUrd har svært ulike virkningsmekanismer.
til slutt, og viktigst av alt, disse studiene, som ble iverksatt for å identifisere checkpoint og DNA-reparasjonsveiene som regulerer kolon kreft svar på FdUrd og 5-FU, viste at BER var en kritisk reparasjon banen når disse cellene ble utsatt for FdUrd ( men ikke 5-FU). Basert på disse funnene, og det faktum at PARP-inhibitorer forstyrre BER, så oppdaget vi at små molekyl PARP-inhibitorer robust sensibilisert MMR-mangelfulle og -proficient tykktarmskreftceller til FdUrd (men ikke 5-FU). Disse funnene kan være av særlig betydning i svulster med defekter i MMR, som står for 15-20% av alle tykktarm kreft [39]. Tidligere studier har funnet at MMR-mangelcellelinjer er mindre følsomme for 5-FU og FdUrd. I samsvar med dette resultatet, har kliniske studier vist at 5-FU har begrenset aktivitet mot MMR-mangel tykktarm kreft sammenlignet med MMR-dyktige svulster [39]. Gitt at 1) FdUrd er godkjent for behandling av kreft i tykktarmen; og 2) det er begrenset behandlingsalternativer for disse svulstene fordi svulster med defekter i MMR blir ofte ansett for å være ikke svarer til 5-FU-baserte terapier, våre funn at PARP-inhibitorer robust bevisst MMR-manglende celler til FdUrd øker muligheten for at behandlinger som kombinere FdUrd med en PARP hemmer kan ha aktivitet mot disse svulstene. På samme måte, fordi PARP-inhibitorer også sensitiv mismatch dyktige tumorer til FdUrd, dette stoffet kombinasjonen kan også være anvendbare ved behandling av disse tumorer. Videre preklinisk og klinisk utvikling av denne kombinasjonen er berettiget.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Effekter av ATR og minibank forstyrrelser på følsomhet for gemcitabin og ioniserende stråling. (A) ATR utarming sensitizes til gemcitabin. HT29-celler transfektert med kontroll (Luc) eller ATR sirnas fra eksperimentet vist i fig. 2B ble belagt som enkeltceller, utsatt for de angitte konsentrasjoner for gemcitabin 24 timer, vasket og dyrket i 10 d å tillate kolonidannelse. (B) ATM nedbryting bevisst for ioniserende stråling (IR). HT29-celler transfektert med kontroll (Luc) eller ATM sirnas fra eksperimentet vist i fig. 2A ble belagt som enkeltceller, utsatt for de angitte doser av ioniserende stråling, og dyrket i 10 d å tillate kolonidannelse.
