Abstract
I human kreft, uttrykk for
la-7
familien er betydelig redusert, og dette er forbundet med kortere overlevelse ganger i pasienter. Men mekanismene som fører til
la-7
downregulation i kreft er fortsatt i stor grad uklart. Siden en endring i kopi-tallet er en av årsakene til genet deregulering i kreft, undersøkte vi kopitall forandringer av
la-7
familien i 2969 kreftprøver fra en høyoppløselig SNP rekke datasett. Vi fant at det var en reduksjon i kopiantallet av
la-7
gener i en kreft-type spesifikk måte. Viktigere, focal sletting av fire
la-7
familiemedlemmer ble funnet hos tre krefttyper: medulloblastoma (
la-7a-2 Hotell og
la-7e
), bryst kreft (
la-7a-2
), og eggstokkreft (
la-7a-3 Twitter /
la-7b
). For eksempel, den genomiske locus husing
la-7a-3 Twitter /
la-7b
ble slettet i 44% av prøvene fra ovarian kreftpasienter. Vi har også funnet en positiv sammenheng mellom kopiantallet av
la-7b Hotell og modne
la-7b
uttrykk i eggstokkreft. Til slutt viste vi at restaureringen av
la-7b
uttrykk dramatisk redusert eggstokktumorvekst
in vitro Hotell og
in vivo
. Våre resultater tyder på at kopiantall slettingen er en viktig mekanisme som fører til nedregulering av uttrykket av spesifikke
la-7
familiemedlemmer i medulloblastoma, bryst og eggstokkreft. Restaurering av
la-7
uttrykk i tumorceller kan gi en ny terapeutisk strategi for behandling av kreft
Citation. Wang Y, Hu X, Greshock J, Shen L, Yang X, Shao Z, et al. (2012) Genomisk DNA kopitall Endringer i
la-7
Familie i Human Kreft. PLoS ONE 7 (9): e44399. doi: 10,1371 /journal.pone.0044399
Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 27 februar 2012; Godkjent: 06.08.2012; Publisert: 06.09.2012
Copyright: © Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet, helt eller delvis, ved National Institutes of Health Grant R01-CA142776 (LZ), P50-CA83638-7951 Prosjekt 3 (LZ), Department of Defense Grant W81XWH-10-1-0082 (LZ), og ovarian Cancer Research Fund (LZ). ZS ble støttet av Kina Scholarship Council. JT ble støttet av National Institutes of Health Grant 5K12HD000849. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Ingen ekstra ekstern finansiering mottatt for denne studien
Konkurrerende interesser. LZ er en PLoS ONE Editorial styremedlem. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
karakterisering av heterochronic mutasjoner i
Caenorhabditis elegans
avslørt et evolusjonært konservert genetisk sti som orkestrerer både timingen av celledelinger og cellulære skjebner, som passer for utviklingsstadiet av organismen [1] – [5]. I denne veien, den mikroRNA (miRNA)
la-7
styrer utviklingen av timing hendelser, slik at cellesyklus exit og terminal differensiering skje på riktig tidspunkt [6], [7].
la-7
målgener
lin-28 plakater (en RNA-bindende protein) og
lin-41 plakater (en antatt ubiquitin ligase) blokk
brev 7
modning og samhandle med argonaute proteiner, henholdsvis. Disse heterochronic genene synes å danne bistabile brytere via doble-negative regulatoriske feedback loops [2] – [5]. Uttrykk for
LIN28 Hotell og
LIN41
er sterkt begrenset i udifferensierte stadier, for eksempel i embryonale stamceller, tidlige embryoer, og enkelte somatiske stilk /stamceller. Omvendt, deres regulatoriske miRNA,
la-7
, viser en gjensidig tidsmessig uttrykk mønster som øker dramatisk i løpet av differensiering og utvikling, og det blir i stor grad uttrykt i voksen vev [2] – [5]. Tretten medlemmer av
la-7
familie har blitt identifisert i det menneskelige genom [7], [8] som viser både forskjellige og overlappende funksjoner [8].
rolle
la-7
i kreft ble først oppdaget av Johnson
et al.
da de fant at
la-7
familie negativt regulerer
la-60 /RAS
i
C. elegans
ved å binde seg til flere
la-7
komplementære områder i sin 3 «ikke-translatert område (3’UTR) [9]. Videre, etter å ha funnet ut at
la-7
uttrykk er lavere i lungesvulster enn normalt lungevev, mens
RAS
protein er vesentlig høyere i lungesvulster, foreslo de at
brev 7
er en tumor suppressor gen [9], som er konsistent med tidligere kliniske observasjoner i lungekreft [10]. Redusert ekspresjon av
la-7
har vært forbundet med forkortet postoperativ overlevelse hos pasienter med kreft [7], [11], [12], og tvunget uttrykk for
la-7
familiemedlemmer kan undertrykke kreftcellevekst både
in vitro Hotell og
in vivo product: [13] – [16]. Den inhiberende funksjon av
la-7
familie i kreft har blitt bekreftet av en rekke grupper og i ulike typer av tumorer [7], [11], [12]. Det er sannsynlig at
la-7
utfører disse funksjonene ved å målrette ulike gener. For eksempel
la-7
hemmer mange godt karakterisert onkogene proteiner, inkludert
KRAS product: [9], [17], [18],
HRAS product: [9] [17], [18],
HMGA2 product: [18] – [21],
c-myc product: [22], og
NF2 product: [23]. I tillegg
la-7
rettet mot flere cellesyklusen knyttet gener, inkludert
CDC25A product: [24],
CDK6 product: [24], og
CDK4
[25] samt
cyclin A product: [25],
D1 product: [25],
D2 product: [24], og
D3 product: [25 ]. Til slutt,
la-7
undertrykker ekspresjon av reprogrammerings-faktor
LIN28
som fungerer for å blokkere differensiering og vedlikeholde kreft stamcellepopulasjoner [26].
Siden det har blitt funnet det humane kreftformer viser en betydelig redusert ekspresjon av
la-7
familie, og at dette er forbundet med kortere overlevelsestider i disse pasientene [7], [11], [12], karakteriseringen av de mekanismene fører til
la-7
downregulation i kreft har viktig klinisk betydning. En årsak til genetisk deregulering i kreft er en endring i den somatiske kopitall av et gitt gen [27]. Det har også blitt rapportert at miRNA kopiantall kan bli endret i løpet av tumorigenesis [28], [29]. Dette førte oss til å undersøke hvorvidt kopi tallene i
la-7
familie ble endret på kreft.
Resultater
Enkelte medlemmer av
la-7
Familie ha slettinger i Kopier nummer i medulloblastoma, brystkreft, og eggstokkreft
for å bestemme antall kopier av
la-7
familiemedlemmer, analyserte vi en høy oppløsning SNP array (Affymetrix 250 K Sty array) datasettet, Tumorscape, skapt av Broad Institute of MIT og Harvard [27]. Fjorten typer kreft hos mennesker (totalt 2.969 vevsprøver) ble inkludert i vår studie (tabell 1). De segmenterte rådata av de ovenfor SNP-matriser ble hentet og analysert ved å følge en standard protokoll fra respektive Tumorscape databasen [27] og visualisert ved den Genomics Viser (IGV) (figur 1) [30]. De genomiske regioner hvor kopiantallet endringer oppstått betydelig oftere enn bakgrunnen hastigheten ble identifisert ved hjelp av GISTIC algoritme [31]. Følgende vilkår, som ble definert av Tumorscape databasen [27], ble brukt for å beskrive våre resultater. Frekvens indikerer brøkdel av kreft som viser forsterkning /sletting ved genomisk locus huse en gitt
la-7
genet. Lave q-verdier (øvre terskel = 0,25) tyder på at presiseringer /slettinger på dette locus er betydelige og beriket av selektive presset
De segmenterte rådata fra SNP arrays (brystkreft, n = 293;. Eggstokkreft , n = 110, myeloproliferativ sykdom, n = 215) ble hentet fra Tumorscape databasen, analysert, deretter visualisert ved Integrative Genomics Viewer. Venstre panel: hele genomet bredt syn på kopiantallet profiler fra myeloproliferativ sykdom, brystkreft og eggstokkreft (genomisk steder er på venstre side; vevsprøver er over toppen). Red representerer forsterkning og blått representerer sletting. Høyre panel. Copy-nummer profiler av kromosom 22 i regionen av
la-7a-3 Twitter /
la-7b
klynge
som vist i figur 2,
la-7
familien er til stede som tretten medlemmer lokalisert på åtte loci i det humane genom [7], [11], [12]. Alle de åtte genomiske loci ble analysert i vår studie. De fleste av familiemedlemmer, for eksempel
la-7a-en
,
la-7F-1, etter og
la-7d
, klynge sammen. (
la-7
gener er navngitt ved å inkludere en bokstav for å betegne en distinkt modne sekvens, og et tall for å indikere at det samme modne sekvens er til stede ved tydelig genomiske loci.) I korte trekk, har vi funnet at fire
la-7
loci huse fem
la-7
medlemmer viste betydelige slettinger i kopiantall i en kreft-type spesifikk måte (figur 2). Focal sletting av disse
la-7
familiemedlemmer ble funnet hos tre krefttyper: medulloblastoma (
la-7a-2, etter frekvens 25%;
la-7e, etter frekvens 9%), brystkreft (
la-7a-2, etter frekvens 47%), og eggstokkreft (
la-7a-3 Twitter /
la-7b,
frekvens 44%). Dette tyder på at genomiske kopi fokal talldelesjoner av
la-7
kan spille en viktig rolle under tumorgenese i de ovennevnte krefttyper. I tillegg er to ikke-fokale slettinger (
la-7a-3 Twitter /
la-7b, etter frekvens 40%;
la-7
g, frekvens 36%) Det ble også funnet i brystkreft, og enkle ikke-brennslettinger ble funnet i melanom (
la-7a-2, etter frekvens 43%) og ikke-småcellet lungekreft (
la-7e,
frekvens 31%). Til slutt, bare en
la-7
familiemedlem,
la-7i
, ble funnet å bli forsterket (i ikke-småcellet lungekreft). Dette ble imidlertid dukket opp et kromosom arm-nivå, ikke-brenn forsterkning, noe som indikerer at det kan være en «passasjer» genetisk forandring. Til sammen våre data indikerer at en reduksjon i kopi rekke spesifikke
la-7
familiemedlem gener var hyppig i medulloblastoma, bryst og eggstokkreft.
Oppsummering av DNA kopiantall endringer av
la-7
familie i 14 typer kreft hos mennesker (n = 2969).
la-7
familie består av tretten medlemmer som ligger på åtte loci av det humane genom. Mange av dem, for eksempel
la-7a-en
,
la-7F-1 Hotell og
la-7d
, klynge sammen (A). Lave q-verdier (øvre terskel = 0,25) tyder på at presiseringer /slettinger på dette locus er betydelige og beriket av selektive presset. Mørk grønn representerer samlings sletting av
la-7
familien.
Kopier nummer Endring av
la-7b
er positivt korrelert med Eldre
brev 7b
Expression i eggstokkreft
for å avgjøre om kopi antall endringer av
la-7b
påvirke moden
la-7
uttrykk i kreft, undersøkte vi en eggstokkreft datasett fra Kreft Genome Atlas (TCGA) [32], fordi dette uavhengig genomiske datasettet inneholder matchet data om både genom-wide kopiantall (SNP array) og moden miRNA uttrykk (miRNA array) fra en stor samling av menneskelige eggstokkene vevsprøver. Nivå 3 data (segmentert SNP array-data og normaliserte miRNA rekkedata) ble hentet fra TCGA [32]. Totalt 537 svulster med data fra både SNP og miRNA arrays ble identifisert. I samsvar med data fra vår Tumorscape analyse, var det en delesjon i kopiantall på
la-7a-3 Twitter /
la-7b
locus i prøvene fra eggstokkene kreftpasienter (figur 3A ). Siden den modne
la-7
en sekvens kodes av tre
la-7
noen gener, som er plassert på tre forskjellige kromosom loci, kan vi ikke undersøke sammenhengen mellom kopiantall og uttrykk for
la-7a-3
. Derfor analyserte vi sammenhengen mellom strykninger på
la-7a-3 Twitter /
la-7b
locus og uttrykk for modne
la-7b
i dette datasettet. Som vist i figur 3 B og C, ekspresjon av modne
la-7b
var signifikant og positivt korrelert med
la-7b
kopiantall i eggstokkreft prøver (p 0,0001, R = 0,46, n = 537). Vi fant ikke en sammenheng mellom eventuelle andre
la-7
familiemedlemmer med
la-7b
kopiantall (figur 3D). Dette viser at en reduksjon i kopien antall
la-7b
fører til en reduksjon i uttrykket av modne
la-7b
i eggstokkreft.
Nivå 3 data (segmentert SNP array-data og normaliserte miRNA array-data) ble hentet fra TCGA. Totalt 537 svulster med både SNP og miRNA arrays data ble identifisert. A. Venstre panel: hele genomet bredt syn på kopitall profiler i eggstokkreft (genomisk steder er på venstre side; vevsprøver er over toppen). Red representerer forsterkning og blått representerer sletting. Høyre panel: Copy-nummer profiler fra kromosom 22 i regionen av
la-7a-3 Twitter /
la-7b
klynge. B. Heat kartet moden
la-7
familie uttrykk nivåer i matchet TCGA prøver. Prøvene er anordnet i samme rekkefølge som de SNP-data. C. Korrelasjoner mellom
la-7b
DNA kopiantall og modne
la-7b
uttrykk nivåer i eggstokkreft fra TCGA datasett. D. Korrelasjoner mellom
la-7b
DNA kopiantall og uttrykk nivåer av modne miRNA av andre
la-7
familiemedlemmer i eggstokkreft fra TCGA datasett.
Restaurering av
la-7b
Expression reduserer Ovarian tumorvekst
in vitro
Focal tap i kopiantall av
la-7
familie medlemmer i medulloblastom, bryst og eggstokk-kreft tyder på at
la-7
kan ha en viktig rolle i tumorgenese. Derfor gjenopprette sitt uttrykk kan undertrykke tumorvekst i disse kreftformene. For å teste denne hypotesen
in vitro, etter vi tilført to eggstokkreft cellelinjer, A2780 og 2008, med en
la-7b
ligne (en dobbel tråd RNA oligonukleotid). En dyrkede humane ovarie overflate epitelial (HOSE) cellelinje ble brukt som en kontroll, og cellevekst ble overvåket via et MTT-assay. På 72 timer etter transfeksjon, fant vi at
la-7b
ligne cellevekst betydelig redusert i kreftcellene (Figur 3 A og B). Det var ingen reduksjon i cellevekst sett i kontrollcellene (figur 4C). Dette tyder på at restaureringen av
la-7b
uttrykk i tumorceller kan ha stor terapeutisk potensiale for behandling av eggstokkreft.
la-7b
ligne og kontroll oligo (30 nM) ble transfektert inn i A2780 (A), 2008 (B) og slangen (C) celler ved lipofektamin. Celleveksten ble overvåket av en MTT-analyse.
Restaurering av
la-7b
Expression reduserer Ovarian tumorvekst
in vivo
for å evaluere
in vivo
terapeutiske potensialet i
la-7b
etterligne en orthotopic sent stadium eggstokkreft musemodell ble generert ved intraperitoneal injeksjon av 10 × 10
6 eggstokkreft ( A2780) celler i kvinnelig hårløse mus (figur 5A). Etter to uker ble musene tilfeldig inndelt i to grupper, som skal behandles med enten
la-7
etterligne eller styre oligonukleotid ved i.p. injeksjon. Musene ble behandlet hver tredje dag for en total av fire behandlinger (figur 5a), og den tumor nodene ble samlet i tre dager etter den siste behandlingen (figur 5B). Vi har funnet at vekten av tumor nodene ble signifikant redusert i de mus som var behandlet med den
la-7b
mimic sammenlignet med kontroller (figur 5 B og C). Vi overvåkes også endogen
la-7b
aktivitet ved hjelp av en konstitutivt uttrykt
la-7b
luciferase reporter som inneholdt sekvenser komplementære til
la-7
i 3’UTR [33 ], [34]. Vi har alltid funnet at behandling med
la-7b
ligne redusert luciferase aktiviteten betraktelig
in vivo
sammenlignet med kontrollgruppen (figur 5 D og E). Til slutt fant vi at behandling med
la-7b
ligne betydelig økt
la-7b
uttrykk nivåer i behandlingen sammenlignet med kontrollgruppen (7.03 ± 5.73 fold, p = 0,047) . I mellomtiden, mRNA uttrykk nivåer av kjente
la-7
målgener som
CCND1
,
CDC25A
,
HMGA2
,
IL6 Hotell og
LIN28B
ble signifikant redusert med
la-7b
ligne behandling. Til sammen viser dette at
in vivo
levering av en
la-7b
ligne kan funksjonelt gjenopprette
la-7
uttrykk og bemerkelsesverdig redusere tumorvekst i en pre- kliniske dyremodell for eggstokkreft.
Tidslinje for transplantasjon av kreftceller ved intraperitoneal injeksjon, behandling, bildebehandling, og innsamling av tumorprøver i orthotopic sent stadium eggstokkreft musemodell. B. Tumor noder tatt fra hver mus tre dager etter den siste behandling. C. Oppsummering av vektene av tumor noder fra hver mus. D. Endogen
la-7b
aktivitet i hver mus som overvåkes av en
la-7b
luciferase sensor. E. Oppsummering av luciferase intensitet under behandlingen.
Diskusjoner
la-7
familien er en av de første miRNA tumor suppressor familier vist seg å være involvert i menneskelig kreft. Uttrykk for medlemmer av
la-7
familien har blitt rapportert å være signifikant nedregulert i flere krefttyper, og dette redusert
la-7
uttrykket har blitt korrelert med dårligere kliniske resultater. To molekylære mekanismer har blitt foreslått som kan føre til global nedregulering av
la-7
uttrykk i kreft. Først kan viktige proteiner i miRNA biogenesis veien, for eksempel dicer og drosha, bli bemerkelsesverdig deregulert i kreft [35]. Dette kan resultere i en uselektiv, global nedregulering av mirnas, inklusive la-7 familien. I tillegg har det blitt vist at den RNA-bindende protein,
LIN28, etter som selektivt inhiberer noen miRNA familier, herunder
la-7
familie [36] – [41], er aktivert i en stor prosentdel av kreftpasienter [42] – [51]. Imidlertid kan de ovennevnte to mekanismer ikke forklare funn at i de fleste krefttyper, bare noen
la-7
familiemedlemmer er nedregulert. For eksempel uttrykk for
la-7
en,
la-7
c, og
la-7
g har blitt funnet å være selektivt nedregulert i brystkreft [ ,,,0],52], som tyder på at det finnes andre uavhengige mekanismer som påvirker ekspresjonen av hver enkelt
la-7
familiemedlem.
Nylige fremskritt i high-throughput-genomet karakterisering teknologier har vist at kreft genomer er meget disordered, med omfattende endringer i kromosomstruktur og gen kopiantall. Det har også blitt rapportert at kopitall av mirnas blir ofte endres i human kreft [28], [29]. For eksempel ble
mir-16-1 /mir-15a
klynge på kromosom 13q14 slettet i mer enn 50% av kronisk lymfatisk leukemi pasienter [53]. I tillegg forsterkning av
C13orf25 /mir-17~92
klynge på kromosom 13q31-32 er rapportert hos lymfom pasienter [54], [55]. I denne studien har vi vist at tre
la-7
loci, som havn fire
la-7
medlemmer (
la-7a-2
,
la-7a-3
,
la-7b
, og
la-7e
), har delesjoner i kopiantall i en kreft-type spesifikk måte i medulloblastom, brystkreft, og eggstokkreft. Viktigst, vi bekreftet sammenhengen mellom
la-7
kopiere antall endringer og modnes
la-7
uttrykk i eggstokkreft. Disse resultatene indikerer at slettingen i kopiantallet er en viktig mekanisme som fører til nedregulering av spesifikk
la-7
familiemedlemmer i minst disse tre typer av humane kreftformer. Imidlertid er denne mekanismen sannsynlig krefttypen bestemt, siden vi ikke fant signifikante kopi nummer endringer av
la-7
familie i andre krefttyper, for eksempel tykktarm og prostata kreft.
viktigere, brenn reduksjoner i kopierings tallene i
la-7
familie antyder at sletting av
la-7
kan spille en viktig rolle under tumorigenesis, og foreslår at gjenoppretting uttrykk for disse
la-7
familiemedlemmer kan være en ny strategi for å behandle medulloblastom, brystkreft, eggstokk-kreft og. Nåværende raske fremskritt innen oligonukleotid /nanopartikkel terapi skape realistisk optimisme for etablering av miRNAs som en ny og potent terapeutisk mål og /eller kjemoresistent modulator i kreft. For å teste denne hypotesen, leverte vi en liten RNA etterligne for
la-7b
, den hyppigst slettet
la-7
familiemedlem i eggstokkreft pasienter, for å eggstokkreft celler
i vitro Hotell og
in vivo
. Vi fant at restaurering av
la-7b
uttrykk dramatisk hemmet tumorvekst. Etter avtale med våre observasjoner, restaurering av
la-7
uttrykk har også vist seg å redusere tumorvekst i prekliniske modeller for andre krefttyper, for eksempel lungekreft [13] – [16], der
la-7
familie er globalt redusert [9], [10]. Gitt at
la-7
samtidig hemmer flere onkogene veier som er involvert i de fleste trinn på tumorigenesis (for eksempel
RAS, MYC
, og
HMGA2)
, restaurering av
la-7
uttrykk i tumorceller gir en roman terapeutisk strategi for å behandle kreft. Interessant, fant vi at vår
la-7b
behandling hadde ingen betydelig innvirkning normal eggstokk overflaten epithelial cellevekst, noe som tyder på at behandling for å gjenopprette
la-7
uttrykk kan være mindre giftige enn tradisjonell cellegift. Dette funn kan skyldes det faktum at normale celler allerede uttrykker høyere nivåer av endogen
la-7
og derfor levering av tilleggs
la-7
ikke signifikant øke sin genet Slå aktivitet i normale celler. En annen forklaring kan være at den nedstrøms cellulær sammenheng er forskjellig i de tumorceller sammenlignet med normale celler. For eksempel har noen direkte mål av
la-7, etter for eksempel
LIN28, RAS, MYC Hotell og
HMGA2, etter ikke uttrykt eller aktivert i normale celler, men er «driver» gener som fremmer cellevekst i svulster
det har blitt vist av uavhengige laboratorier som undertrykkelsen på sine mål genuttrykk nivåer ved mirnas er relativt mild [56] -. [59], selv om hver miRNA kan spesielt og samtidig målrette hundrevis av mRNA transkripter [56], [59]. I tråd med dette vanlig oppførsel av miRNAs, viste vi at mRNA uttrykk nivåer av flere kjente
la-7
målgener som
CCND1
,
CDC25A
,
HMGA2
,
IL6 Hotell og
LIN28B
ble signifikant redusert med
la-7b
ligne behandling (alle p 0,05). Men undertrykkelse effekter på mRNA nivåer av
la-7b
er vanligvis beskjedne (fra 58,0% ± 0,03% til 78,9% ± 0,08%). Det kan gi viktige terapeutiske fordeler for
la-7b
erstatningsterapi sammenlignet med siRNA baserte strategier: Først bivirkninger av restaurering av
la-7b
hos pasienter med kreft kan være mild og begrenset. For det andre, kan flere onkogene gener /trasé som cellesyklusregulering, DNA-skade respons, kreft stamcelledifferensiering og betennelse være målrettet samtidig. I enig med denne hypotesen, ja vi ikke finne at
la-7b
replacement therapy betydelig påvirket på normal epitelial cellevekst i en terapeutisk dose (figur 4C). I tillegg mirnas inkludert
la-7
negativt regulerer target genekspresjon av to hovedmekanismer, dvs. mRNA spalting (transkripsjonsnivået) og /eller translasjonelle undertrykkelse (translasjonelle nivå), i en sekvens-spesifikk måte [7] , [8], [11], [12]. Dette kan være en annen forklaring på hvorfor vi bare funnet beskjedne undertrykkelse av målet genuttrykk i mRNA nivåer som ble oppdaget av real-time RT-PCR. Til slutt ble den dose for
la-7b
levering i den foreliggende undersøkelse bestemt ved en dose-avhengig eksperiment. Vi brukte minimal funksjonell respons dosering (30 nM) for våre sanntids RT-PCR eksperimenter. Når vi økt dosen av
la-7b
levering, fant vi effektene av
la-7b
replacement therapy på sine målgener ble bemerkelsesverdig økt.
Det har blitt godt demonstrert at den modne
la-7
uttrykk er en robust biomarkør å forutsi klinisk utfall hos pasienter med kreft. For eksempel, en systematisk gjennomgang av 43 publiserte studier viser at
la-7
er miRNA oftest og signifikant assosiert med kliniske resultater hos pasienter med kreft [60]. For å undersøke sammenhengen mellom
la-7b /la-7a3
klynge kopi nummer endringer (sletting vs ikke-sletting) og klinisk utfall av pasienter, totalt 491 sent stadium (stadium-III og -IV ) svulster med godt kommenterte overlevelse informasjonen ble undersøkt av Kaplan-Meier overlevelsesanalyse. Men vi fant ikke signifikant korrelasjon mellom
la-7b /la-7a3
klynge kopi nummer endringer og total overlevelse i dette prøvesett (p = 0,343). Dette resultat indikerte at DNA-kopi-antall endringer er ikke den eneste grunnen ved hjelp av hvilken modne
la-7
ekspresjon er redusert i kreft. I enig med denne observasjonen har vi og andre uavhengige grupper rapporterte at miRNA deregulering i menneskelig eggstokkreft ble ledet av flere mekanismer [29], [61], [62]. For det første har det vist seg at de fleste primære mirnas er transcripted fra Pol II promoter og reguleres av transkripsjonsfaktorer. Flere eksempler viser miRNA deregulering i eggstokkreft ved transkripsjonen deregulering har blitt rapportert. For det andre, nyere studier tyder på at epigenetiske forandringer spille en avgjørende rolle i dereguleringen miRNA uttrykket i menneskelige eggstokkreft. For det tredje, mutasjon kan også bidra til å nedregulering av modne miRNAs. Endelig kan de sentrale proteiner i miRNA biogenese sti være dysfunksjonell eller deregulert i kreft, og kan forsterke tumorigenesis. Derfor transkripsjonsdereguleringer, epigenetiske forandringer, mutasjoner, DNA kopiantall avvik og mangler i miRNA biogenesis maskiner kan hver bidra, enten alene, men mer sannsynlig sammen, til
la-7
familie deregulering i human kreft [29 ], [61], [62]. I denne studien, rapporterte vi at
la-7b /la-7a3
klynge slettet i mer enn 40% andel av eggstokkreft og brystkreft. Vi tror det er en av viktige mekanismer for å redusere
la-7
uttrykk i disse sykdommene, selv om andre mekanismer som transkripsjonsdereguleringer, epigenetiske forandringer, mutasjoner, og mangler i miRNA biogenesis maskiner for å bli ytterligere karakterisert i eggstokkene og brystkreft.
Materialer og metoder
SNP og miRNA microarray datainnhenting og analyse
segment~~POS=TRUNC rådata fra SNP mikromatriser (Affymetrix 250 K Sty array) lastet ned fra Tumorscape database (opprettet av Broad Institute of MIT og Harvard) [27] og analysert etter en standard protokoll levert av Tumorscape, deretter visualisert ved hjelp av Genomics Viewer (IGV) (figur 1) [30]. Fjorten typer kreft hos mennesker (totalt 2.969 vevsprøver) ble inkludert i vår studie (tabell 1). Nivået 3 data (segmentert SNP array-data og normaliserte miRNA rekkedata) var ned fra Kreft Genome Atlas (TCGA) datasett [32], og en total av 537 svulster med både SNP og miRNA array-data ble identifisert. De genomiske regioner hvor kopitall endringer oppstått betydelig oftere enn bakgrunnen hastigheten ble identifisert ved hjelp av Genomisk Identifisering av vesentlige mål i Cancer (GISTIC) algoritme [31]. Informasjonen for krefttyper prøvene fra Tumorscape databasen var tilgjengelig på portalen av Tumorscape (https://www.broadinstitute.org/tumorscape) [27]. Bryst og ovarietumorer klinisk informasjon var tilgjengelig fra de publiserte profiler (GSE7545 og GSE19399) [27], [63], [64]. Alle TCGA eggstokkreft eksemplarer er høyverdig serøs ovarietumorer, som ble samlet inn fra nydiagnostiserte pasienter med eggstokkreft serøs adenokarsinom som var under kirurgisk reseksjon og hadde fått noen tidligere behandling for sin sykdom, inkludert kjemoterapi eller strålebehandling. Alle saker måtte være av serøs histologi, men ble innhentet uavhengig av kirurgisk scenen eller histologisk grad. Tilfeller ble iscenesatt i henhold til 1988 FIGO iscenesettelse system. Detaljene klinisk informasjon av prøvene fra TCGA databasen var tilgjengelig på TCGA data portal (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/) [32].
Cellelinjer og Cell Kultur
eggstokkreft cellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC) og Seksjon for kreft behandling og diagnostisering (DCTD) Tumor /cellelinje Repository. Alle kreftcellelinjer ble dyrket i RPMI 1640-medium (Invitrogen) supplert med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen). Menneske eggstokkreft overflaten epitelceller (HOSE) celler ble sjenerøst gitt av Dr. Nelly Salzburg (University of British Columbia) [65]. SLANGE celler ble dyrket 01:01 i Media 199. MCDB 105 (Sigma), supplert med 15% FBS
la-7b
Mimic
in vitro
Transfeksjon
la-7b
ligne og kontroll oligonukleotider ble kjøpt fra Invitrogen. Celler ble platet i 24 timer før transfeksjon. Transfeksjon av miRNA oligonukleotider (30 nM)
in vitro
ble utført ved anvendelse av Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen).
MTT-analysen
MTT-analyser ble utført i 96-brønners plater ved hjelp en Cell Proliferation Kit (Roche) etter produsentens anvisninger. Fire til seks brønner ble analysert for hver prøve. Den resulterende farget løsning ble kvantifisert ved hjelp av en ELx800 absorbans mikroplateleser (BioTek) ved 570 nm med en referanse bølgelengde på 630 nm.
Generering av stabile cellelinjer
la-7 reporter vektor var transfektert inn A2780 celler ved anvendelse av FuGene6 Transfection Reagent (Roche). Mediet ble forandret 48 timer etter transfeksjon, og de stabile kloner ble utvalgt ved neomycin i 14 dager. De stabile kloner som uttrykker skuffelse 7 reporter ble ytterligere bekreftet ved en luciferase assay.
Generering av ortotopiske Eggstokkreft Xenotransplantat Modell
Seks til åtte uker gamle kvinnelige nakne mus ble hentet fra The Jackson Laboratory . Subkonfluente eggstokkreft celler (A2780) ble trypsinert og suspendert i fosfatbuffret saltløsning (PBS), deretter ble 10 x 10
6 celler i et totalvolum på 0,1 ml ble injisert i mus bukhulen.
