Abstract
PPAR er kjernereseptorer aktiveres av ligander. Aktiveringen av PPARy fører til en reduksjon av adhesjon og motilitet i noen cancermodeller. PPARy transkripsjonen aktivitet kan bli negativt reguleres av JNK-mediert fosforylering. Vi har postulert at bruk av agenter i stand til å hemme JNK-aktivitet kunne øke effektiviteten av PPARy ligander. Vi analyserte effekten av rosiglitazon (PPARy ligand) og AS601245 (en selektiv JNK-inhibitor) alene eller i assosiasjon med adhesjon og migrasjon av CaCo-2, HT29, og SW480 human kolonkreftceller og undersøkt gjennom microarray analyse, som er involvert i genene disse prosessene. Celle adhesjon og migrasjon ble sterkt hemmet av rosiglitazon og AS601245. Kombinert behandling med de to forbindelser førte til en større reduksjon av adhesjon og migrasjon kapasitet. Affymetrix analyse i CaCo-2 celler avdekket at enkelte gener som var sterkt modulert av den kombinerte behandlingen kunne være involvert i disse biologiske responser. Rosiglitazon, AS601245 og kombinert behandling nedregulert ekspresjon av fibrinogen kjedene i alle tre cellelinjer. Dessuten, rosiglitazon, alene eller i assosiasjon med AS601245, forårsaket en reduksjon av fibrinogen frigivelse. ARHGEF7 /β-PIX-genet var svært nedregulert ved kombinert behandling, og western blot analyse viste at β-PIX protein er ned-modulert i CaCo-2, HT29 og SW480 celler, også. Transfeksjon av celler med β-PIX genet fullstendig avskaffet hemmende virkning på cellemigrering, bestemt av rosiglitazon, AS601245 og kombinert behandling. Resultatene viste at β-PIX protein er involvert i hemming av cellemigrasjon og opprettholde det positive samspillet mellom PPARy ligander og betennelsesdempende midler hos mennesker
Citation. Cerbone A, Toaldo C, Minelli R, Ciamporcero E , Pizzimenti S, Pettazzoni P, et al. (2012) rosiglitazon og AS601245 Nedgang celle adhesjon og migrasjon gjennom Modulation av Specific Gene Expression i Human Colon kreftceller. PLoS ONE 7 (6): e40149. doi: 10,1371 /journal.pone.0040149
Redaktør: Frederic Andre, Aix-Marseille Universitet, Frankrike
mottatt: 22 februar 2012; Godkjent: 01.06.2012; Publisert: 28 juni 2012
Copyright: © 2012 Cerbone et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Regione Piemonte (https://www.ricerca-sanitaria-finalizzata.it/) og Università degli Studi di Torino (https://www.unito.it/unitoWAR/page/istituzionale/ricerca1/Ricerca_601) . Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. AC og GR er ansatt av Merck Serono Ivrea – RBM SpA Det er ingen patenter, produkter i utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
PPARy tilhører kjernefysisk reseptor super bestående av en gruppe på ca. 50 transkripsjonsfaktorer som er involvert i mange forskjellige biologiske prosesser og betraktes som viktige mål for utviklingen av nye medikamenter [1]. Den PPARy-aktivering av agonister regulerer lipid lagring i adypocytes [2], hemmer proliferasjon og induserer differensiering og apoptose i en rekke kreftceller [3]. Således har de PPARy ligander vært betraktet som potensielle medikamenter for ulike typer av kreft. Endogen PPARy ligander inkluderer umettede fettsyrer og flere prostanoider som for eksempel 15-desoksy-prostaglandin J2 (15d-PGJ2) og 15-hydroksy-eicosatetranoic syre (HETE), som er metabolitter av arakidonsyre [4]. Syntetiske ligander omfatter insulin-sensibiliserende thiazolindinedione (TZD) klasse (troglitazon, pioglitazon og rosiglitazon) som brukes til å behandle diabetes mellitus [5] – [6] og flere ikke-steroide antiinflammatoriske midler (NSAIDs), spesielt indometacin og ibuprofen, som er svake PPARy agonister ved høye mikromolare konsentrasjoner [7].
følsomheten av de forskjellige celletyper til PPARy ligander for det meste avhenger av PPARy ekspresjon og aktivitet. Høye nivåer av PPARy ekspresjon har blitt rapportert i adipose vev og tykktarm. Sistnevnte er den viktigste vev som uttrykker PPARy i epitelvev [1]. Til tross for denne observasjonen, er antallet studier som undersøker PPARy hos mennesker med tykktarmskreft begrenset. I prøver fra tykktarm kreftpasienter, immunhistokjemisk analyse viste en sammenheng mellom PPARy og cellesyklusrelaterte molekyler, men ingen sammenheng ble funnet mellom PPARy og pasient overlevelse [8]. Mer nylig, Ogino og medarbeidere demonstrerte, i pasienter med kolorektal kreft, at ekspresjon av PPARy er forbundet med en god prognose [9], i henhold til de foregående data som rapporteres av Jackson og medarbeidere [10], som viste at PPARy (mRNA og protein) uttrykk nivåer ble betydelig deprimert i kolorektal kreftceller sammenlignet med matchet ikke-ondartet vev. I dyrestudier ble en mangel i tarm PPARy assosiert med økt tumorigenicity i tynntarmen og tykktarmen av ApcMin /+ mus [11]. Tilsvarende, i musemodeller for koloncancer, PPARy-agonister hemmet tumorvekst eller colon carcinogenesis [12] – [14]. Disse data støtter hypotesen om at PPARy ligander kan inhibere colorektal tumorprogresjon og kan være en viktig terapeutisk mål.
A. Effekt av forskjellige doser av rosiglitazon (10, 50, 100, 200, 250 uM) på CaCo-2, HT29 og SW480 celleproliferasjon; B. Effekten av forskjellige doser av AS601245 (0,1, 1, 2,5, 5, 10 uM) på CaCo-2, HT29 og SW480 celleproliferasjon. Verdier blir detektert ved å måle luminescens utgitt av metabolsk aktive celler. Verdiene, uttrykt i RLU er midler S.D. av tre separate forsøk.
En av de viktigste aspektene i kreft progresjon, er oppkjøpet av invasiv atferd, en flertrinnsprosess som involverer kreftceller vedheft til Vassel endotelet og bevegelighet gjennom ekstracellulære matrise. Det har blitt demonstrert at PPARy-agonister påvirke disse parametrene ikke bare i kontrollen av celle inflammasjon [15], men også i flere typer kreftceller [16], [17].
Dess ligandbindende, PPARy genomisk aktivitet kan moduleres ved hjelp av forskjellige cellulære prosesser.
Faktisk mitogene hormoner, vekstfaktorer og pro-inflammatoriske signaler er alle kjent for å redusere muligheten for PPARy til å svare til ligand stimulering. Mekanismene som styrer denne nedregulering er komplekse og omfatter fosforylering [18], ubiquitinering [19], sumoylation [20] og cytoplasmatiske skyt [21]. En nøkkel ned-regulerende mekanisme omfatter fosforylering av forskjellige mitogen aktivert kinaser (MAPK), som er sentrale signalkomponenter i reguleringen av celleproliferasjon, differensiering overlevelse, stressrespons og apoptose [22]. Spesielt har det blitt rapportert at c-Jun-terminal kinase (JNK) fosforylerer PPARy og negativt regulerer transkripsjonen aktivitet [23]. På grunnlag av disse observasjonene vi postulert at bruk av agenter i stand til å hemme JNK-aktivitet kunne øke effektiviteten av PPARy ligander. AS601245 [1,3-benzotiazol-2-yl (2 – {[2- (3-pyridinyl) etyl] amino} -4-pyrimidinyl) acetonitril; JNK inhibitor V] er valgt som en potent og selektiv JNK inhibitor med anti-inflammatoriske egenskaper [24], og har blitt brukt i dette arbeidet for å vurdere sitt engasjement med anti-kreftfremkallende effekter som vises av rosiglitazon i tykktarm kreft celler. Spesielt undersøkte vi effekten av rosiglitazon og AS601245, alene eller sammen, på adhesjon og migrasjon av menneskelige tykktarmskreftceller, og undersøkte gener som er involvert i disse prosessene, gjennom microarray analyse (Affimetryx Genechip).
Effekt av forskjellige doser av rosiglitazon (0,01, 0,1, 1, 10, 50 uM), AS601245 (0,01, 0,1, 1, 10, 50 uM) og kombinert behandling med CaCo-2, HT-28 og SW480 på celleadhesjon til HUVECs. Cellene ble behandlet eller ikke med legemidler i 24 timer, høstet og inkubert i en time på HUVEC-monolag. Data er uttrykt som prosentandel av adhesjon inhibering versus ubehandlede kontrollceller. Kontrollverdien av adhesjon var ca 55 ± 6 celler pr mikroskop felt (n = 6) for alle cellelinjer. Verdiene er gjennomsnitt ± SD, av 3 adskilte eksperimenter. Avviksanalyse: *
p
0,05, **
p
0,01 vs kontroll; # P 0,05 vs rosiglitazon; ## P 0,01 vs rosiglitazon; §. 0,01 vs begge forbindelser
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Bruk av HUVEC ble godkjent av etikkomiteen av «Presidio Ospedaliero Martini «av Torino og utført i samsvar med Helsinkideklarasjonen. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter.
Cell Kultur og behandlinger
CaCo-2, SW480 og HT29 tykktarm kreft celler ble hentet fra europeiske Innsamling av cellekulturer (ECACC) og dyrket ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2-luft. ECACC gir full kvalitetskontroll og godkjenningsprosedyrer for cellelinjene. Disse cellelinjene er valgt ut fordi de representerer tre cellemodeller med ulike potensialer av invasivitet: høyere i HT29 celler, midt i Caco-2 celler og lavere i SW480 celler. Celler ble dyrket i D-MEM medium (Caco-2 og SW480-celler) eller McCoys medium (HT29-celler) supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS, HyClone, Italia), 2 mM glutamin, 1% ikke-essensielle aminosyrer løsning og 1% antibiotisk blanding (penicillin-streptomycin) (Sigma, Milano, Italia).
Inhibering av tumor migrasjon ved en Boyden kammer assay. CaCo-2, HT29 og SW480-celler ble sådd ut på den apikale side av Matrigel-belagte filtre i serumfritt medium supplert med legemidler ved forskjellige konsentrasjoner (0,1, 1, 10, 50 uM rosiglitazon, 0,1, 1, 10, 50 uM AS601245 ) og med foreningen av narkotika ved forskjellige konsentrasjoner i 24 timer. Kjemotiltrekkende som ble anvendt var 20% FCS supplementert medium, plassert i basolateral kammeret. Cellene migrerte til bunnen av filtrene ble farget med crystalviolet og telles (5 felt av hver triplikate filter) ved hjelp av et invertert mikroskop. Kontroll migrasjon var 45 ± 8 celler /mikroskop felt for CaCo-2 celler, 50 ± 5 celler /mikroskop felt for HT29 og 40 ± 3 celler /mikroskop felt for SW480. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (n = 5) av den prosentvise inhibering i forhold til migrering av celler eksponert for kjøretøy (1% DMSO). Avviksanalyse *
p
0,05, **
p
0,01 vs kontroll; en
p
0,05, aa
p
0,01 vs rosiglitazon; b
p
0,05, bb
p
. 0,01 vs AS601245
Behandlinger med rosiglitazon og AS601245 [1,3-Benzothiazol-2-yl – (2 – {[2- (3-pyridinyl) etyl] amino} -4-pyrimidinyl) acetonitril; JNK inhibitor V] (SPRI, Genève, Sveits) ble utført ved resuspending narkotika i DMSO. Konsentrasjonen av kjøretøyet i kulturen ikke overstige 1%. Videre kulturer, behandlet med 1% DMSO alene, ble utført for å utelukke bilens effekter.
HUVEC ble isolert som beskrevet andre steder [25] og dyrket på gelatin-belagte kultur retter i M199 medium supplert med 20% varme -inactivated FCS, 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 5 UI /ml heparin, 12 ug /ml bovint hjerneekstrakt og 200 mM glutamin. HUVEC ble benyttet ved II-V passasjer.
Cell Proliferation og levedyktighet
Celleproliferering ble evaluert av kit «CellTiter-Glo Lysende celleviabilitet Assay» (Promega, Milano, Italia). Denne analysen påviser luminescens utgitt av metabolsk aktive celler. Kvantifisering av luminescens ble uttrykt som RLU (relative lysen Unit). For spredning forsøk ble behandlinger utført ved tilsetning av de stoffer (ved forskjellige konsentrasjoner) til cellene sådd ut ved omtrent 4000 celler /brønn i en 96-brønns plate.
Genekspresjon i Caco-2-celler som ble behandlet med 50 iM rosiglitazon, 0,1 mikrometer AS601245 og foreningen av disse to forbindelser (rosiglitazon + AS601245) ble oppdaget av microarray analyse 24 timer etter behandlingen. Venn-diagram viser antall gener modulert av behandlingene.
Heft analysen
HUVEC ble dyrket til konfluens i 24-brønners plater, vasket, og igjen på plass for en dag i M199-medium pluss 10% FCS. Kommersiell fluorescerende celle linker mini kit PKH67 (Sigma) ble brukt for membranmerking av tykktarmskreftceller. Fargingen Effektiviteten ble registrert fluorescerende mikroskopi. Colon kreft celler (Caco-2, SW480 og HT29 celler) behandlet eller ubehandlet (24 timer) med rosiglitazon eller AS601245 (50 til 0,01 mikrometer) eller begge stoffene, ble høstet og merket som beskrevet ovenfor, og belagt (1-3 × 10
5-celler /brønn) i et sluttvolum på 0,25 ml M199 medium med ubehandlet HUVEC og etterlates der i 1 time ved 37 ° C i 5% CO
2. Etter inkubasjon ble ikke-adherente celler fjernet ved vasking 3 ganger med 1 ml M199 medium. Sentrum av hver brønn ble analysert ved fluorescens bildeanalyse [26]. Heftende celler ble telt ved hjelp av Image Pro Plus-programvare for mikro-imaging (Media Cybernetics, versjon 5.0). Enkelt eksperimentelle punkter ble analysert i fire, og standardfeilen for de fire replikater var under 10% i alle tilfeller.
Fibrinogen utgivelse i Caco-2 celler eksponert for forskjellig konsentrasjon (1-10-50 mikrometer) av rosiglitazon, 0,1 mikrometer AS601245 eller begge stoffer (50 mikrometer rosiglitazon og 0,1 gM AS601245). Data er uttrykt som prosentandel av fibrinogen frigjøring i forhold til kontrollverdien, og er gjennomsnitt ± SD av 3 separate eksperimenter. Avviksanalyse: **
p
0,01 vs kontroll, # p 0,05 vs rosiglitazon
Matrigel Migration analysen
Chemotaxis analysen av kreft. -celler ble utført ved Boyden kammer metode under anvendelse av et filter på 8,2 mm diameter og 5,0 um porestørrelse (Neuro Probe, Inc .; BIOMAP snc, Milano Italia) belagt med 0,1 pl /ml Matrigel (BD Matrigel ™ matrise; BD Biosciences, Oxford , UK). I korthet medium inneholdende 20% FCS som en kjemoattraktant ble plassert i de lavere brønner. Til å begynne med, CaCo-2, HT29 og SW480-celler (ved sluttkonsentrasjon på 5 x 10
4 celler /ml) ble suspendert i de øvre brønner (omtrent 4000 celler /brønn for HT29 og 8000 celle /brønn for SW480 og CaCo- 2) i serumfritt medium supplert med legemidler ved forskjellige konsentrasjoner (fra 0,1 uM til 50 uM for begge stoffer) og med foreningen av medikamentene ved forskjellige konsentrasjoner. Migrasjon av kontroll ubehandlede celler, celle utsettes for kjøretøyet (1% DMSO) og av kontroll og behandlede celler eksponert for mitomycin C (50 ug /ml) (Sigma) ble også analysert. Kammeret ble inkubert ved 37 ° C under 5% CO
2 i 24 timer. Kjemotakse ble kvantifisert ved å telle de fargede cellene som migrerte til den undre side av filteret ved hjelp av et optisk mikroskop (forstørrelse x 100). De fargede celler ble tellet som det midlere antall av celler pr 5 tilfeldige felter for hver analyse. Resultatene er uttrykt som prosentandel av inhibisjon av behandlede celler versus migrasjon målt i celle eksponert for 1% DMSO. Disse forholdene ble opprettholdt for transfekterte celler, også.
Fibrinogen Slipp Bestemmelse
fibrinogen (FBG) utgivelsen i kultur media ble analysert ved hjelp av AssayMax humant fibrinogen (FBG) ELISE Kit fra Assaypro (St. Charles, MO, USA) i henhold til produsentens protokoll.
CaCo-2-celler ble dyrket i kolber og sådd ved konsentrasjonen av 4 x 10
6 /kolbe. -Celler, eksponert for rosiglitazon (50, 10 og 1 uM), AS601245 (0,1 pM) eller begge stoffer (50 uM rosiglitazon og 0,1 uM AS601245), ble høstet etter 24 timer fra begynnelsen av forsøket og sentrifugert. De oppsamlede supernatanter ble inkubert i en 96-brønners plate belagt med et polyklonalt antistoff som er spesifikt for humant FBG. FBG i prøver ble klemt av det immobiliserte polyklonale antistoff og biotinylert polyklonalt antistoff som er spesifikt for humant FBG, som ble gjenkjent av et streptavidin-peroksidase-konjugat. All ubundet materiale ble vasket bort og en peroksidase enzymsubstrat ble lagt. Fargeutviklingen ble stoppet, og intensiteten av fargen ble målt på en mikroplateavleser ved en bølgelengde på 450 nm.
RNA ekstraksjon og Array Hybridisering
CaCo-2-celler ble behandlet med bærer (1% DMSO) eller 50 uM rosiglitazon eller 0,1 uM AS601245 eller rosiglitazon pluss AS601245 i 24 timer, og total RNA fra biologiske 3 replikater av hver behandling ble isolert ved anvendelse av TRIzol reagens (Invitrogen, Milano, Italia). Prøvene ble behandlet med DNase for å unngå en hvilken som helst genomisk forurensning. Kvaliteten på den resulterende RNA ble bestemt ved hjelp av Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). RNA-innholdet ble normalisert ved hjelp av Thermo Scientific Nanodrop ™ ND-1000 spektrofotometer. RNA prøver av hver replikat ble analysert ved hjelp av Affymetrix Genechip Human Genome U133A pluss 2,0 chips (Affymetrix). RNA-amplifikasjon, dobbeltkjedet cDNA syntese og generering av biotin-merket cRNA ved in vitro transkripsjon (IVT) ble utført i henhold til produsentens protokoll ved hjelp av Affymetrix kits. Den endelige cDNA ble sjekket for kvalitet og kvantitet før fragmentering og chip hybridisering. Hver brikke ble deretter vasket og farget ved hjelp av en lufthåndtering stasjon 450 (Affymetrix). Fluorescens intensitet for hver brikke ble tatt med Affymetrix Genechip Scanner 3000 (Affymetrix). GCOS software versjon 1.2 (Affymetrix) ble anvendt for å definere sonden cellen og beregner intensitet for hver celle. CEL filer generert, som inneholder sammendrags intensiteter for hver sonde, ble analysert gjennom følgende bioinformatikk tilnærminger. Vi først vurdert den generelle kvaliteten på dataene ved hjelp av R /Bioconductor. Deretter lastet vi datasettet inn i Rosetta Resolver for data normalisering, generering av uttrykk verdier, og statistisk analyse. Ekspresjons-verdier av alle behandlingsgrupper ble oppnådd som forholdet sammenlignet med den negative kontroll (1% DMSO). Differensial analyser mellom par av gruppene ble utført med en-veis ANOVA etterfulgt av Benjamini-Hochberg multippel testing korreksjon (False Discovery Rate-FDR cut-off på 1%) og en Student-Newman-Keuls post hoc-analyse. Til slutt ble differensielt uttrykte gener analysert i Oppfinnsomhet Pathway Analysis programvare versjon 7.5 (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com).
Realtime RT-PCR
For å bekrefte Affymetrix resultater valgte vi 5 gener som hadde vist en 2 ganger endring i uttrykket for videre studier av real time PCR i et eget eksperiment. To av disse (GANAB og MT2A) ble funnet å være økt i Affymetrix analyse, mens de andre to ble funnet å bli redusert (FGA og FGFR2). Til slutt ble en gen (ARHGEF7) funnet å være sterkt redusert i kombinasjonsbehandling, bare. Videre, analyserte vi ekspresjonen av de tre kjeder av fibrinogen i CaCo-2, HT29 og SW480-celler. Celler ble behandlet med 1% DMSO som kjøretøyet eller med 50 uM rosiglitazon, 0,1 uM AS601245, eller rosiglitazon pluss AS601245 i 24 timer; total RNA fra 3 biologiske replikater av hver behandling ble isolert ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen, Milano, Italia), ble så totalt RNA kvantifisert med en Nanodrop (Thermo Scientific) spektrofotometer for å måle RNA konsentrasjon og analysert på en Agilent 2100 Bioanalyser å overvåke RNA kvalitet og integritet. Total RNA ble revers transkribert til cDNA i en 20 mL reaksjon med TaqMan® High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit levert av Applied Biosystems. 500 ng av total-RNA ble anvendt som utgangsmateriale fra hver prøve. For hver Realtime PCR-reaksjonen ble reverstranskribert prøven brukes som en mal. For å teste analysen linearitet, et cDNA bassenget ble første seriefortynnet. Reaksjonene ble utført i nærvær av de kommersielle TaqMan® genekspresjon Analyser og en 1 x konsentrasjon av den TaqMan® Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). Target mRNA ble kvantifisert ved hjelp av en ABI 7900 HT Fast Realtime PCR system (Applied Biosystems). Primere ble kjøpt fra Applied Biosystems: GANAB (glucosidase, alpha, nøytral AB, Hs00929274_m1), MT2A (metallothionein 2A, Hs02379661_g1), FGA (fibrinogen alfakjeden, Hs00241027_
m1), FGB (fibrinogen betakjeden Hs00905942_
m1 ) FGG (fibrinogen gamma kjede Hs00241037_
m1) FGFR2 (fibroblast vekstfaktor-reseptor 2, Hs01552926_m1) og ARHGEF7 (Rho guanin nukleotid utveksling faktor (GEF) 7, Hs00388776_m1). De TaqMan prober ble merket med en 5 «reporter fargestoff (FAM, 6-karboksyfluorescein) og en 3» quencher fargestoff (TAMRA, 6-carboxytetramethylrhodamine). Realtime PCR-reaksjoner ble utført i triplikat i mikroampere optiske 384-brønners plater i et totalt volum på 10 ul /brønn. Data ble analysert av ABI Sequence Detection System (SDS) programvare ved hjelp av relativ kvantifisering. Brette endringer bestemmes av ΔΔCt fremgangsmåten som er beskrevet i Applied Biosystems User Bulletin No. 2. I korthet nivået for hver mål-mRNA ble normalisert til nivået av 18S ribosomalt RNA (husholdningsgenet) for å oppnå den ΔCt og deretter den ΔΔCt ble beregnet mot DMSO behandling.
Western blot-analyse av β-PIX ekspresjon i CaCo-2, HT29 og SW480-celler, behandlet i 24 timer med forskjellige konsentrasjoner av rosiglitazon (1, 10, 50 pM) , AS601245 (0,1, 1, 10) og kombinert behandling med 50 uM rosiglitazon og 0,1 uM AS601245. Lik protein lasting ble bekreftet ved eksponering av membranene til anti-β-aktin-antistoff. Kvantifisering av protein produkter (til høyre) ble utført ved densitometrisk skanning. Dataene er normalisert ved hjelp av β-aktin signal og er angitt som middelverdier ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. (A) Western blot-analyse av CaCo-2-celler og relative densitometriske verdier. (B) Western blot-analyse av HT29-celler og relative densitometriske verdier. (C) Western blot-analyse av SW480-celler og relative densitometriske verdier. Avviksanalyse:. * P 0,05, **
p
0,01 vs kontroll eller rosiglitazon behandlede celler
β-PIX Transfeksjon
β-PIX plasmide ble kjøpt av Qiagen (EIM0195303), dyrket i Escherichia coli Kompetente celler (Promega) etter standard prosedyrer og renset ansette EndoFree Plasmide Midi Kit (Qiagen). For forbigående transfeksjon eksperimenter, CaCo-2, HT29 og SW-480 celler ble dyrket i seks-brønner plate på 80% samløpet, 6 mikrogram renset plasmide konstruksjonene ble transfektert hjelp Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen), i henhold til produsentens anvisninger. p-PIX ekspresjon ble undersøkt 24 timer etter transfeksjon, ved western blot. For negativ kontroll, ble pQE-TriSystem-6 Vector (Qiagen) brukes. Minst tre uavhengige eksperimenter for hver tilstand ble utført.
Statistical Analysis
2-veis ANOVA ble utført i spredning, adhesjon, migrasjon, fibrinogen utslipp tester og densitometrisk analyse av vestlige blotter.
Resultater
rosiglitazon og AS601245 påvirke Cell Proliferation
Innledende forsøk viste at celleproliferasjon ble påvirket av rosiglitazon og ved AS601245 inntil 96 timer, i en konsentrasjonsavhengig måte i alle de tre linjer av tykktarmskreftceller som ble testet (fig. 1). Imidlertid medikamentdoser effektive ved inhibering av celleproliferasjon med 50% (IC50) var ganske høy. I CaCo-2 celler, IC50 var 150 ± 25 mikrometer for rosiglitazon og 2,5 ± 1 mikrometer for AS601245. Dosene i stand til å redusere celleproliferasjon med 20% (IC20) var: 50 M ± 12 for rosiglitazon og 0,1 mikrometer ± 0,1 for AS601245. IC50 og IC20 dosene var svært lik i alle tre cellelinjene som ble testet. De IC20 doser av rosiglitazon og AS601245, definert i Caco-2 celler, ble deretter brukt for microarray eksperimenter i denne cellelinjen.
celle adhesjon og migrasjon Etter rosiglitazon og AS601245 behandlinger
i adhesjonsassayet, utført etter 24 timer fra starten av behandlingen, tilsetning av 50 uM rosiglitazon alene resulterte i en reduksjon av celleadhesjon til HUVEC med omtrent 55% i CaCo-2-celler, og ved 58% og 59% i HT29 og henholdsvis SW480 celler, (fig. 2). Graden av inhibering ble gradvis redusert ved å behandle cellene med lavere doser av rosiglitazon. I et første sett av eksperimenter ble celleadhesjon kapasitet analysert i HCT116-celler, også. I denne cellelinje, ble celleadhesjon inhibert med 71% etter behandling med 50 uM rosiglitazon og med 59% etter behandling med 10 uM rosiglitazon (data ikke vist). Behandlingen med 50 uM AS60124 reduseres adhesjonen av omtrent 55, 72 og 60% i CaCo-2, HT29 og SW480-celler, respektivt. Den prosentvise inhibering ble gradvis redusert ved å behandle cellene med lavere doser av AS601245 og ved behandling med 0,1 uM AS601245 ikke i vesentlig grad påvirker denne parameteren. For å kontrollere om den kombinerte behandlingen av rosiglitazon og AS601245 kan ha en additiv effekt som hemmer celle heft, ble 0,1 mikrometer AS601245 forbundet med økende doser av rosiglitazon. I alle tre cellelinjene en kombinasjon av 0,1 um rosiglitazon med 0,1 uM AS601245 viste en additiv virkning i å redusere celleadhesjon. Den kombinerte behandlingen av 0,1 mikrometer AS601245 med høyere doser av rosiglitazon økt effekten av rosiglitazon alene nådde det høyeste nivået av hemming. Alle tre typer celler viste en lignende respons til behandlinger.
A. Western blot ekspresjon av CaCo-2, HT29 og SW480 celler av kontroll og transfektert med den tomme plasmide og med den plasmide bære β-PIX genet. B. Hemming av tumorcelle invasjon av en Boyden kammer analysen i cellene transfekterte med β-PIX bærer plasmide. Kontroll celler og transfekterte celler ble platet ut på forenden side av Matrigel-belagte filtre i serumfritt medium supplert med legemidler ved forskjellige konsentrasjoner (10, 50 uM rosiglitazon, 0,1, 1, 10, 50 uM AS601245) og med foreningen av forskjellig medikamentkonsentrasjoner i 24 timer. Kjemotiltrekkende som ble anvendt var 20% FCS supplementert medium, plassert i basolateral kammeret. Cellene migrerte til bunnen av filtrene ble farget med crystalviolet og telles (5 felt av hver triplikate filter) ved hjelp av et invertert mikroskop. Kontroll migreringen var 45 ± 8, 51 ± 8 og 33 ± 4 celler /mikroskop felt for CaCo-2, HT29, SW480-celler, henholdsvis, og 49 ± 5, 50 ± 6 og 30 ± 6 celler /mikroskop felt for CaCo-2- , HT29 og SW480 celler, henholdsvis etter transfeksjon med β-PIX bærer plasmide og tom plasmide. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (n = 5) av den prosentvise inhibering i forhold til kontroll migrasjon.
Migrering ble undersøkt i CaCo-2, HT29, og SW480 cellelinjer. Antallet migrerte celler /mikroskop felt i ubehandlede kontrollceller var 45 ± 8 for CaCo-2-celler, 50 ± 3 for HT29-celler og 40 ± 3 for SW480 celler. Verdien av migrering av kontrollceller utsatt for kjøretøyet (1% DMSO) var 44 ± 6 for CaCo-2-celler, 51 ± 8 for HT29-celler og 40 ± 5 for SW480 celler. Dessuten, for å utelukke at resultatene som oppnås i behandlede celler kan avhenge av celleformering, analyserte vi cellemigrering i ubehandlede celler, og i celler behandlet i 24 timer med de høyeste konsentrasjonene av rosiglitazon eller AS601245 (50 uM) i nærvær av mitomycin C. Resultater innhentet viste at migrasjons verdier var lik i fravær eller i nærvær av mitomycin C (celler /mikroskop feltet var 45 ± 8 for kontroll Caco-2 celler og 44 ± 6 for CaCo-2 kontrollceller behandlet med mitomycin, 50 ± 3 for kontroll HT29-celler og 49 ± 5 for celler behandlet med mitomycin; 40 ± 3 for kontroll SW480-celler og 42 ± 8 for celler behandlet med mitomycin). Prosentandelene av inhibering i rosiglitazon behandlede celler var: 65% og 64% for CaCo-2-celler, 79% og 80% for HT29-celler og 60% og 63% for SW480, med og uten mitomycin, henholdsvis; de prosentandeler av inhibisjon av AS601245 behandlede celler var: 55% og 50% for CaCo-2-celler, 80% og 75% for HT29-celler og 92% og 87% for SW480 celler, med og uten mitomycin, henholdsvis)
.
På fig. 3 er rapportert migrasjons resultatene oppnådd i celler behandlet med rosiglitazon, AS601245 og begge substanser, uttrykt som prosent av inhibering med hensyn til migrasjon av celler eksponert til kjøretøyet bare (1% DMSO). Migreringen ble betydelig inhibert av 10 og 50 uM rosiglitazon og AS601245 i alle tre cellelinjer. Behandlingene med forskjellige kombinasjoner av konsentrasjonen ved 50 uM av begge forbindelser ga en additiv effekt som hemmer cellemigrering. Den kombinerte behandling med konsentrasjoner på 50 uM rosiglitazon eller AS601245 ikke produserer additive effekter (data ikke vist), sannsynligvis fordi disse konsentrasjonene, alene, ga en prosentvis inhibering i nærheten av platået.
Microarray Analysis of Gene Expression i CaCo-2 celler
for å analysere om celle svar på behandlinger med rosiglitazon, AS601245 eller med begge stoffene var en konsekvens av et bestemt gen vei modulering, utførte vi microarray analyse ved hjelp av Affimetryx Genechip plattformen. Siden inhibering av celleadhesjon og migrering av rosiglitazon og AS601245 var svært lik i alle tre cellelinjer av kreft i tykktarmen undersøkt, velger vi CaCo-2-cellelinje for å utføre denne analysen, 24 timer etter behandlingene. Dosene brukt i denne studien var de i stand til å indusere en IC20 hemming av CaCo-2 celleproliferasjon (50 mikrometer rosiglitazon og 0,1 mikrometer AS601245).
Antall gener betydelig modulert av rosiglitazon og etter AS601245 var svært høy . Den fullstendige listen over genene moduleres av rosiglitazon, AS601245 og av den kombinerte behandling er rapportert i saksdokumenter S1. Venn-diagrammet (Fig. 4) viser at rosiglitazon modulert 1260 gener, AS601245 modulert 3245 gener, og de kombinerte behandlinger modulert 1188 gener. Blant de genene påvirket av rosiglitazon alene eller AS601245 alene, 1118 var vanlig i begge de to gruppene. Den kombinerte behandling påvirkes 735 gener som var til stede i både den rosiglitazon og AS601245 grupper og 173 gener som ikke ble påvirket av enten rosiglitazon eller AS601245, alene. Tabell 1 angir de genene som påvirkes av rosiglitazon, ved AS601245, og ved den kombinerte behandling med rosiglitazon og AS601245, anordnet i forhold til de relative biologiske funksjoner og er oppført på basis av p-verdien. Fig. Fig.
