Abstract
Vi har nylig rapportert at Riccardin D (RD) var i stand til å indusere apoptose ved å målrette Topo II. Her fant vi at RD indusert cellesyklus arrest i G2 /M fase i PC-3 celler, og forårsaket bemerkelsesverdig DNA-skade som gjenspeiles av induksjon av γH2AX brennpunkter, mikrokjerner, og DNA-fragmentering i Comet assay. Tid kinetisk og doseavhengige studier viste at ATM /Chk2 og ATR /Chk1 signalveier ble sekvensielt aktivert i respons til RD. Blokkering av ATM /ATR signalering førte til dempningen av RD-indusert γH2AX, og til delvis utvinning av celleproliferasjon. Videre RD eksponering førte til inaktivering av BRCA1, undertrykkelse av HR og NHEJ reparasjon aktivitet, og nedregulering av uttrykk og DNA-end bindende aktiviteter Ku70 /86. I samsvar med observasjoner, microarray data vises at RD utløste endringene i gener ansvarlig for celleproliferasjon, cellesyklus, DNA-skade og reparasjon, og apoptose. Administrasjon av RD til xenograft mus reduserte tumorvekst, og coordinately forårsaket endringer i uttrykket av gener involvert i DNA-skade og reparasjon, sammen med celle apoptose. Dermed dette funnet identifisert en ny mekanisme som RD påvirker DNA-reparasjon og fungerer som en DNA-skader agent i prostatakreft
Citation. Hu Z, Kong F, Si M, Tian K, Yu LX, Young CYF , et al. (2013) Riccardin D utøver sin anti-tumoraktivitet ved å indusere DNA Damage i PC-3 prostata kreft celler
In Vitro Hotell og
In Vivo
. PLoS ONE 8 (9): e74387. doi: 10,1371 /journal.pone.0074387
Redaktør: Stephanie Filleur, Texas Tech University Health Sciences Center, USA
mottatt: May 23, 2013; Godkjent: 31 juli 2013; Publisert: 17.09.2013
Copyright: © 2013 Hu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (30772594, 30973551, 30925038) og Foundation Natural Science i Shandong-provinsen (2009ZRB01346). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er en av de vanligste ondartede svulster hos menn og hormonelle uttak behandlingen fortsatt er effektiv for avansert PCa. Imidlertid har utviklingen av hormon ildfaste prostatakreft (hrpc) oppstår uunngåelig etter hormon deprivasjonsterapi [1,2]. Det er begrensede muligheter for en vellykket forvaltning av HRPC. Nylig, docetaxel, en plante alkaloid derivat, er blitt fremstår som en aktiv agent for å forbedre livskvalitet og overlevelse forhold hos pasienter med metastatisk prostatakreft [3,4]. Suksessen til docetaxel har ført til mange forsøkene på å isolere ulike naturlig forekommende kjemikalier og å undersøke virkningsmekanismer av bioaktive forbindelser for utvikling av chemopreventive og /eller terapeutiske midler for å behandle kreft inkludert hrpc [5].
en av de mest effektive kjemiske reagenser som brukes i kreft-kjemoterapi er DNA-skade induktorer, som kan forårsake en rekke DNA-lesjoner via flere mekanismer. For eksempel kan camptothecin og etoposid utløse enkelttrådsbrudd (SSBs) eller dobbel tråd DNA pauser (DSB sin) ved å fange topoisomerase-DNA kovalente komplekser, senere fører til celledød [6,7]. Således DNA-topo I og II, spesielt topo II, antas å være veletablert mål i cancerterapi.
Avhengig av typen av DNA-lesjoner, spesifikke cellesykluskontrollposter og cellulære kaskader aktiveres av DNA- skadelige stoffer. Som allment akseptert, ataksi telangiectasia mutert (ATM) og ataksi telangiectasia og Rad3 relaterte (ATR) signalveier spiller viktige roller som svar på DNA-skade. ATM svarer hovedsakelig til DSB sin, og initierer fosforylering av nedstrøms mål som Chk2, BRCA1 og NBS1 proteiner på stedet av DNA-skade [8]. Disse faktorene virker sammen til å indusere G1, S og G2-cellesyklus arrestert, DNA-reparasjon, og /eller aktivering av celledødsveier [9]. Mens ATR aktiveres i respons til replikering stress, og det utløser aktiveringen av Chk1, som i sin tur fører til fosforylering av Cdc25 og hindrer aktivering av CDK1 /Cyclin B og mitotisk oppføring [10]. Ved DSB sin, prosessen med DSB sin slutt begynte involverer mange proteiner og enzymer gjennom nonhomologous slutten begynte (NHEJ) og homolog rekombinasjon (HR) reparasjon mekanismer [11,12]. For eksempel, er det Ku70 /86 heterodimeren kritisk i NHEJ, siden det binder seg til de ødelagte DNA-endene og rekrutterer reparasjon relaterte proteiner, inkludert DNA-avhengig proteinkinase, XRCC4, og DNA-ligase IV [13]. Det har blitt vist at DNA-skade er implisert å fremkalle både ATM- og ATR-signalering [14]. Aktivering av disse to veier med mulige defekter i cellesyklus sjekkpunkter og DNA-reparasjonsrespons kan være relevant ved bestemmelse av styrken og effektiviteten av DNA-skade induktorer.
Vi har nylig rapportert at Riccardin D (RD), en makrosyklisk bisbibenzyl forbindelse fra det kinesiske liverwort anlegget
Dumortiera hirsute product: [15], var i stand til å indusere apoptose av humane leukemiceller ved å målrette topo II [16]. I denne studien fant vi at RD behandling førte til induksjon av DNA skade og hemming av respons produkter som er involvert i DNA-reparasjon.
Materialer og metoder
Cell kultur og behandlinger
Humant LNCaP, PC-3 og DU145-celler (American Type Culture Collection (ATCC)) ble dyrket i RPMI 1640 medium (HyClone) supplert med 10% føtalt bovint serum (HyClone). Cellene ble dyrket i 5% CO
2 ved 37 ° C inntil nå omtrent 50-70% konfluens og deretter behandles med kjemikalier. RD ble isolert og renset i våre laboratorier som tidligere beskrevet [15]. RD og Etoposid (VP-16) ble fremstilt i dimetyl sulfoksid (DMSO) og lagret i små alikvoter ved -20 ° C.
Immunoblotting
Etter behandling som angitt, ble cellelysater fremstilt ved hjelp RIPA buffer. Proteiner (80 ug) ble separert ved SDS-PAGE og elektroforetisk overført på polyvinyliden-fluorid-membraner (Millipore). Membranene ble probet over natten ved 4 ° C med de passende primære antistoffer: glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH), Cyclin E, poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), Bcl-2, Bax og nucleolin (Santa Cruz) , Ku70 og Ku86 (Active Modif), Cdc25B (BD Biosciences), cyclin A (Anbo Biotechnology), cyclin B1 (Novus Biologicals), Cdc25C, Ser
1981-fosforylert-ATM, Tyr
15-fosforylert-Cdc2 , Ser
428-fosforylert-ATR, Ser
296-fosforylert-Chk1, Thr
68-fosforylert-Chk2, Ser
1524-fosforylert-BRCA1, Ser
139-fosforylert histon H2AX (γH2AX), PP2AA, PP2AB, og PP2AC (Cell Signaling), PPP4C (Bethyl, Montgomery, TX, USA), IgG-TRITC (Abcam) etterfulgt av blokkering med 5% fettfri tørrmelk. Ved fjerning av primære antistoffer, ble membranene vasket med TBST og inkubert med IgG-pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert sekundære antistoffer, og deretter visualisert ved forsterket kjemiluminescens påvisningssystem (Millipore).
cellevekst og cellelevedyktigheten assay
celler ble sådd med 4000 celler /brønn i mikroplater (Roche), og utsatt for RD eller kjøretøy. Cell vekstkurver ble oppnådd med Real-Time Cell Analyzer SP Instrument (Roche). Celleindeks (CI) verdiene ble normalisert med hensyn til den CI verdien av tidspunktet ved hvilket den kjemiske tilsatt. For celleviabilitet analyse, ble PC-3-celler forbehandlet med 10 mmol /l koffein i 1 time og eksponert for RD eller vehikkel i 24 timer. Celleproliferasjon ble deretter undersøkt ved hjelp av 3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5-difenyl-2H-tetrazolium-bromid (MTT, Sigma) kolorimetrisk analyse.
cellesyklus og apoptose assay
etter behandling med RD i 24 timer, cellene ble fast og ble behandlet med propidiumjodid (PI) (Sigma) i 30 min i mørket. Cellesyklus ble analysert ved hjelp av en FACS (Becton Dickinson, USA). Apoptose ble studert ved bruk av en Annexin V-FITC /PI apoptose Detection Kit (BD Biosciences) ved strømningscytometri.
mikronukeleus assay
Celler ble sådd i 6-brønns plater og behandlet med RD, DMSO eller VP-16 (10 pmol /L) i 24 timer. Etter festing og permeabilizing ble cellene farget med DAPI (Sigma). Mikronuklei i celler ble scoret under en fase fl uorescence mikroskop (Nikon). Minst 1000 celler per prøve ble scoret for analyse.
Nøytral kometmetoden
Celler ble behandlet med kjemikalier som angitt ovenfor. DNA DSB sin ble oppdaget ved hjelp av Trevigen Comet, analyse enkelt celle Gel elektroforese analyse (Trevigen). Komethaler ble fotografert av en fase-fluorescens mikroskop (Nikon) og kvantifisert ved Casp programvare. Et minimum av 100 celler ble scoret per behandling
Immuno fl uorescence farging av γH2AX og p-BRCA1
Celler dyrket på dekk ble fikset med iskald metanol /aceton. (1: 1) og inkuberes med 3% BSA i PBS med 0,1% Triton X-100. Etter inkubering med primære antistoffer og skylling med PBS, ble cellene immunfarget med sekundære antistoffer og motfarget med DAPI. Fluorescens bildene ble tatt med en konfokalmikroskopi (CarlZeiss).
microarray og real-time PCR-analyse
Total RNA ble ekstrahert fra celler som ble eksponert for kjemikalier ved hjelp av en RNAiso pluss kit (Takara Bio ). Microarray analyse ble utført ved Genetimes Technology, Inc. (Kina) på Affymetrix HG-U133 pluss 2 chip, og den opprinnelige dataene ble lagt til GEO (Series GSE37812). For kvantitativ PCR (qPCR) analyser, ble cDNA syntetisert ved hjelp ReverTra Ace qPCR RT Kit (Toyobo). qPCR ble utført med SYBR Grønn reaksjon mester mix på en Real-time PCR System (Eppendorf International). Transkripsjonelle nivåer av ønskede gener ble normalisert til nivået av GAPDH. Endringer i genuttrykk ble beregnet ved hjelp av ΔΔC
t-metoden. Sekvensene til primerne er vist i tabell 1.
forover primer (5 «- 3»)
revers primer (5′- 3′)
Cdc25BGGCTGAGGAACCTAAAGCCCTCGATCTCATCGTGACACAGTCdc25CAGGAACCCCAAAATGTTGCCTGCAGAAGTGGTAAGCTGAGTGcyclin ETCCAAGAGTTTGCTTACGTCACGCCAGGAGATGATTGTTACAGGcyclin AGATGGTAGTTTTGAGTCACCACACACGAGGATAGCTCTCATACTGTcyclin B1ATAAGGCGAAGATCAACATGGCTTTGTTACCAATGTCCCCAAGAGcdc2ACACAAAACTACAGGTCAAGTGGGGAATCCTGCATAAGCACATCCRPA1CTCGGGAATGGGTTCTACTGTCACTTGGACTGGTAAGGAGTGARPA2TGGTAGCCTTTAAGATCATGCCCCTGGATTGCTGATAGGTGCTCRPA3TGATGGAACCCCTTGATGAAGACATGTTGCACAATCCCTAAAGGAXRCC5GACGTGGGCTTTACCATGAGTTCAGTGCCATCTGTACCAAACXRCC6AGTCATATTACAAAACCGAGGGCCCTTGGAGGCATCAACCAAAAAMSH6AGCTTAAAGGATCACGCCATCAAGCACACAATAGGCTTTGCCGAPDHTGGTCACCAGGGCTGCTTAGCTTCCCGTTCTCAGCCTTTable 1. Q-PCR fremover og bakover primere.
CSV ned CSV
Co-immunoprecipitation
Prøver av proteiner (1,2 mg) fra kontroll og RD-behandlede celler ble forbehandlet med protein A /G Plus -Agarose (Santa Cruz) i nærvær av ikke-spesifikke IgG (Santa Cruz), deretter inkubert med primære antistoffer, og 20 ul agarosekuler med kontinuerlig blanding over natten ved 4 ° C. Kulene ble vasket og oppvarmet ved 75 ° C i 5 minutter i ladningsbuffer før immunoblottingforsøk analyser.
Analyse av DNA-bindende aktivitet ende av Ku70 /Ku86
Nuclear ekstrakter fra kontroll eller RD behandlede celler ble utarbeidet, og utsatt for påvisning av DNA end-bindende aktivitet av Ku70 og Ku86 bruker en Ku70 /Ku86 DNA Repair kit i henhold til produsentens instruksjoner (Active Motif).
DNA end-bli-analyse
for å fastslå effekten av RD på DSB sin reparasjon, har vi utviklet en celle-fritt DNA end-bli-analysen som beskrevet av Shao C, et al. [17]. Plasmidet pUC19 ble spaltet med HincII, noe som resulterer i en butt-endet lineært molekyl. Det lineariserte DNA ble inkubert med kjerneekstrakt (2 ug) i 50 mmol /liter Tris-HCl (pH 7,6), 10 mmol /l MgCl
2, 1 mmol /l ditiotreitol, 1 mmol /liter ATP, og 25% (vekt /v) polyetylenglykol 8000 ved 14 ° C i 6 timer eller 24 timer. Nuclear ekstrakt av Raji celler kjøpt fra Active Motif fungert som en positiv kontroll. Den NHEJ ble bestemt ved PCR forsterkning av krysset mellom gjenforent ender med M13 primere. PCR produkter av ampicillin ble utført som en intern kontroll. Alle forsøk ble gjentatt tre ganger.
NHEJ og HR reparasjon analysen
Muligheten av DNA reparasjon i celler behandlet med RD ble evaluert med HR og NHEJ reportere at bes gitt av Dr. Gorbunova ( Institutt for biologi, Universitetet i Rochester) [25,26]. Reporteren kassett for å oppdage NHEJ eller HR ble kuttet med I-SCEI til å indusere DSB sin. Det lineariserte reporter kassett av NHEJ eller HR og DsRed ble co-transfektert inn i PC-3 celler etter å ha blitt behandlet med RD eller kjøretøy i 24 timer. Celler ble analysert på FACSCalibur maskin (Becton Dickinson, USA) ved anvendelse av en grønn-versus-rød fluorescerende plot. Data ble analysert med Cell quest software (BD Biosciences).
Vurdering av anti-tumor effekt av RD
in vivo
For å evaluere
in vivo
effekten av RD på PCA seks uker gamle BALB /c-nu mus (Vital River Laboratories, Beijing, Kina) ble brukt. Mus ble akklimatiseres i en uke etter ankomst. Tumorxenotransplantater ble etablert ved å injisere 5 × 10
6 PC-3 celler i høyre flankene av mus. Når tumorene var påvisbar, ble musene tilfeldig delt inn i behandlings- og kontrollgrupper. Initialt ble gitt ved tidspunktet for paret matching (dag 1). RD (30 mg /kg) eller placebo (ekvivalente mengder av løsningsmiddel) ble gitt hver annen dag etter i.p. injeksjon. Musene ble overvåket daglig følgende behandlinger, og svulster ble målt hver andre dag ved å bestemme to vinkelrette dimensjoner [lengde (L) og bredde (W)] med vernier calipers og beregnes med formelen V = L x W
2/2. Etter 20 dagers behandling ble alle musene avlivet ved lufteteranestesi og deres tumorer resekterte for tumormasse måling. Tumorvev ble fiksert i 4% paraformaldehyd og anvendt for TUNEL-analyse (Calbiochem), immunoblotting, og immunfluorescens. Alle dyreforsøk ble godkjent av etikkomiteen av Shandong University School of Medicine (Permit Number: 2010038) og gjennomført tilsvar
Statistisk analyse
Data er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik. av minst tre uavhengige eksperimenter. Den statistiske betydningen av gjennomsnittlig forskjell mellom kontroll og behandlede grupper ble bestemt av en paret t-test der
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
RD induserer cellesyklus og apoptose i PC-3 celler
Siden RD har vist seg å indusere apoptose i leukemiceller og lunge kreftceller [16,18], innledet vi vår studie for å finne ut om RD også utøves cytotoksisk effekt på PCA celler ved kontinuerlig overvåking av celleproliferasjon. Som vist i figur 1A, eksponering av PC-3-celler til RD forårsaket markert suppresjon av celleproliferasjon i en dose- og tidsavhengig måte.
A
, celle proliferasjon som svar på RD ble overvåket av celleindeks (CI) verdier ved hjelp xCELLigence System.
B
, Etter eksponering av PC-3 celler til rd for 24 timer, cellesyklus ble analysert ved fl ow cytometri.
C
, Immun analyse av cellesyklus regulatorer i celler behandlet med RD.
D
, mRNA nivåer av G2 /M-fase-relaterte sykkel regulatorer i RD-behandlede celler ble bestemt ved real-time PCR. Ekspresjons endringer av disse genene følgende RD behandling (10μmol /L) ble også inkludert.
E
, Andel apoptotiske celler ble analysert ved fl ow cytometri.
F
,
en
, analyse av mikrokjerner formasjoner i PC-3 celler behandlet med RD.
b
, hyppigheten av PC-3 celler som inneholder mikrokjerner behandlet med RD eller VP-16 for 24 timer. barer, SD. *, P 0,05, signifikant forskjell fra ubehandlet gruppe.
Etter 24 timer behandling med RD, ble cellesyklus betydelig arrestert i G2 /M fase med økende konsentrasjoner. Følgelig RD behandling resulterte i doseavhengig reduksjon i uttrykket av cyclin E, A og B, som er de molekylære markører korrelerte med G2 /M fase. Familien av Cdc25 fosfataser og den nedstrøms mål Cdc2 spiller en viktig rolle i S og G2-M progresjon. Vi har også observert en nedgang i de uttrykk for Cdc25B, Cdc25C, og fosfor-Cdc2
Tyr15 (inaktiv form) på en doseavhengig måte i behandlede celler (figur 1C). qPCR analyser viste at uttrykket av Cdc2 på karakterutskriften nivået ble markert redusert i RD-behandlede celler (figur 1D), noe som tyder på at RD trykkes uttrykk for Cdc2 på mRNA-nivå, noe som igjen førte til en redusert fosfor Cdc2. I mellomtiden, endringer i mRNA-ekspresjonen av cyklin E, A, B, Cdc25B, og Cdc25C av RD (figur 1D) var lik de observasjoner i figur 1C, noe som indikerer at mønsteret av cellulære responser var i overensstemmelse med RD-induserte endringen av cellesyklus i PC-3 celler. I tillegg til interferens med cellesyklusprogresjon, RD var i stand til merkbart å indusere apoptose i en doseavhengig måte (figur 1E).
Microarray analyse viste at gener relatert til skadet-DNA-binding, DNA-reparasjon, cellesyklus og apoptose ble vesentlig endret i RD-behandlede celler sammenlignet med kontrollen som oppsummert i tabell S1. Av disse genene, observerte vi at cyclin E, A, B, Cdc2, Cdc25B, og Cdc25C ble nedregulert dramatisk i RD-behandlede celler, i samsvar med resultatene i figur 1D.
RD utløser DNA-skader i PCA celler
Vi deretter bestemmes om eksponeringen mot RD ved konsentrasjoner som var tilstrekkelig til å indusere cellesyklus og apoptose resulterte i DNA-skade, fordi RD var i stand til å hemme Topo II i leukemiceller [16]. Som forventet, mikrokjernedannelse var tydelig i celler behandlet med 5 umol /L RD til 24 timer, og oppviste en doseavhengig økning (panel A i figur 1F), i likhet med VP-16, en veldokumentert DNA-skade middel. Antallet av mikrokjerner i celler eksponert for RD ble oppsummert i panel B i figur 1F. Derfor er disse resultatene antydet at RD indusert DNA-skader som var forbundet med promotering av cellesyklus og apoptose i PC-3 celler.
For å bekrefte evnen til RD utløse DNA skade i PCA celler, vi undersøkte endringer av DNA skader markører av western blotting. Som vist i figur 2A, RD forårsaket signifikant økning i fosforylering av histon H2AX
Ser139 (γH2AX), en kjent DNA-skade respons indikator på 2 timer og opprettholdt opp til 24 timer etter behandling i både androgen-avhengige (LNCaP) og androgen-uavhengig PCa (PC-3 og DU145) celler. I form av DNA skade respons proteiner, ble uttrykk for fosfor-BRCA1 av RD uttales på tidlige tidspunkter og falt ned i celler etter langvarig behandling (figur 2A), noe som tyder på at RD indusert DNA skade respons i PCA celler.
En
, Immun analyse av uttrykket nivåer av p-BRCA1 og γH2AX i LNCaP, PC-3 og DU145 cellene utsatt for RD, henholdsvis.
B
,
en
, nøytral kometen analysen ble utført for å bestemme DNA fragment i RD-behandlede celler.
b
, Fordeling av gjennomsnittlig komet lengde (100 celler per prøve) ble beregnet ved boksen og whisker plot. Medianer er angitt med kryss; interkvartile området (25-75%; IQRs) er angitt med åpne boksene. Værhårene er 1,5 ganger IQR distribusjon.
Videre nøytral kometen analysen ble utført for å teste om RD kan indusere DSB sin i PCA celler. Resultatene i figur 2B, viste at DNA-hale øyeblikk i respons til RD var påvisbar i celler så tidlig som i 2h behandling, og ble mer uttalt med langvarig behandling. Dermed dataene indikerte at RD betydelig forårsaket DSB sin i PCA celler.
RD påvirker ATM /ATR-avhengige Chk1 /Chk2 trasé i PC-3 celler
For å finne ut om ATM /ATR-Chk1 /2 signalveier, som er godt identifisert som aktiveres etter DNA-skader, er involvert i RD-indusert DNA skade reaksjon, må vi først undersøkt endringer av faktorer som er viktige for formidling minibank /ATR veier. Kinetiske studier viste forhøyet fosforylering av ATM og Chk2 (Thr
68) ble indusert av RD så tidlig som 30 min, men dette fosforylering nivået kraftig redusert etterpå. Mens aktiveringen av ATR /Chk1 ble observert ved 2 h behandling og vedvarte opp til 24 timer som vist ved akkumulering av fosfor-ATR og fosfor-Chk1 (Ser
296) som reaksjon på RD (figur 3A). Det bør bemerkes at ATR /Chk1 var signifikant aktivert ved RD ved behandling 2h, hvor aktivering av ATM /Chk2 ble svekket. Skiftende aktivering av ATM til ATR antydet at andre typer av DNA-lesjoner som replikering interferens og store lesjoner kan også forekomme i tillegg til DSB sin. Negativ regulering av Cdc25 familiemedlemmer, nedstrøms for Chk1 /Chk2, er en viktig mekanisme er ansvarlig for blokkering av mitotisk oppføringen etter DNA-skade [19]. Som forventet, downregulated Cdc25B /C og en utpreget indusering av mitotisk Cdc25C ved 4h, som vedvarte etter behandling, ble observert i RD-behandlede celler sammenlignet med ubehandlede celler (figur 3A). En økning i spaltning av PARP ble også observert (figur 3A).
A
, endringer på DNA-skade proteiner i RD-behandlede celler ble analysert ved western blotting.
B
, Etter behandling med kjemikalier i 4 timer eller 12 timer, protein nivåer av DNA-skade proteinene ble oppdaget av western blotting.
C
, Immuno fl uorescence farging av γH2AX foci og p-BRCA1 foci i PC-3 celler.
D
,
en
, nøytral komet analysen av PC-3 celler behandlet med RD for 4 timer og 12 timer.
b
, Comet lengde ble analysert ved boksen og whisker plott metode (100 celler per prøve).
E
, foreninger av γH2AX, PP2AC, og PPP4C ble bestemt ved coimmunoprecipitation hjelp av anti-γH2AX, anti-PP2AC, anti-PPP4C, eller normal IgG.
F
, PC-3 celler ble forbehandlet med 10 mmol /L koffein i 1 t, og utsatt for RD for 4 timer og 12 timer,
en
, celleviabilitet målt ved MTT-analyse; barer, SD. *,
#, P 0,05, signifikant forskjell fra kontroll.
b
og endring av γH2AX ble oppdaget av western blotting.
DNA skade utløser en signalkaskade som fører til dannelsen av en reparasjon komplekse på pausene. Vi neste vurderes endringer av protein BRCA1, et kritisk molekyl i den første rekruttering av andre reparasjons proteiner /enzymer i pausene [20]. Aktivering av BRCA1 (fosforylering ved Ser
1524) av RD ble observert opp til 4h og falt etter behandling, som korrelerer godt med aktiveringen mønster av Chk2, noe som tyder Chk2 kan faktisk fosforylere BRCA1 i respons til skade (figur 3A). Basert på observasjoner over, fant vi at betydelige endringer har skjedd i 4t og 12h behandlinger, som begge kan være kritiske tidspunkter for RD-indusert DNA skade respons. Videre studier (figur 3B) viste at mønsteret av responsen som involverer γH2AX, fosfor-Chk1 /2 og fosfor-BRCA1 ved 4 h og 12 h var i overensstemmelse med observasjonene i figur 3A. Disse resultatene ble ytterligere understøttet av den observasjon i figur 3C. Som en kontroll, Vp-16 var i stand til å opprettholde forhøyede fosfor-Chk1 /2, fosfor-BRCA1, og γH2AX etter lengre eksponering sammenlignet med de i RD behandlinger (figur 3B og 3C), noe som tyder på at andre mekanismer bidro til responsene av RD og VP-16 behandlinger. I samsvar med endringer av DNA-skade respons proteiner, uttalt komet haler ble vist å presentere i celler eksponert for RD (panelene a og b i figur 3D). Av notatet, forhøyet γH2AX som kan fosforyleres av ATM /ATR kinaser [21,22] var tydelig på 4h og vedvarende opptil 48t følgende RD behandling, der den aktiverte-ATM /ATR av RD ble avskaffet (figur 3A). Vi analyserte også forandringer av proteinfosfatase 2A (PP2A) og proteinfosfatase 4 (PP4), som er implisert i dephosphorylating γH2AX [23,24]. Etter 24 timers behandling, forårsaket RD øket PP2AC (katalytisk subenhet av PP2A), og PPP4C (katalytiske underenheten til PP4) (figur 3E), noe som indikerer at H2AX forble fosforyleres i nærvær av forhøyede PP2AC og PPP4C. Co-immunoutfellingsstudier Resultatene viste at γH2AX var markant merkbar med gradvis redusert PP2AC eller PPP4C i komplekser immunoutfelt med anti-γH2AX, anti-PP2AC eller anti-PPP4C antistoffer (Figur 3E), noe som tyder på at svekket sammenslutninger av γH2AX /PP2AC /PPP4C av RD kan , i hvert fall delvis bidrar til betydelig oppsamling av γH2AX.
i tillegg, koffein, en inhibitor for ATM /ATR signalering, nesten fullstendig opphevet evne RD til å fremme H2AX fosforylering under behandlingen, noe som ble ledsaget den betydelige reversering av RD-indusert celledød (figur 3F). Sammen dataene tydelig demonstrert at ATM /ATR-mediert kaskade trasé spilte en avgjørende rolle i respons til RD-indusert DNA-skade, som fører til fremme av celler til å angi dødelig mitose.
RD hemmer NHEJ og HR i PC-3 celler
for å fastslå effekten av RD på DSB sin reparasjon, har vi utviklet en celle-fritt DNA end-bli-analyse for å vurdere den relative bidraget av NHEJ i DNA slutt begynte [17]. Lineariserte plasmid pUC19-DNA ved hjelp av enzym HincII ble inkubert med atomproteinekstrakter, og ende-sammenføyning aktivitet ble reflektert av utseendet av lineære dimerer og multimerer som ble amplifisert ved hjelp av PCR med M13-primere som flankerer ende-sammenføyde forbindelses (figur 4A, 4B). Etter behandling med RD i 6 timer eller 24 timer, ble NHEJ aktivitet av kjerneekstrakt markert undertrykket som vist ved opptreden av en sterk monomer bånd og tilsvarende redusert multimerprober produkter, samtidig som dimer, trimer og tetramer bandene var tydelig i kontrollgruppen (Figur 4B ). Som en positiv kontroll ble NHEJ aktivitet også svekket av RD under inkubering av DNA-substratet med Raji-cellekjerneekstrakt (Active Motiv) under de samme betingelser (figur 4B). I tillegg inkubasjon av lineære DNA med blokkerende antistoffer rettet mot Ku70 og Ku86 i kjerneproteiner førte til redusert multimerprober band, lik den observasjon i RD behandling (figur 4B), som gir bevis for at Ku heterodimer Ku70 /Ku86 er to av de viktigste proteinene i RD-mediert DSB sin reparasjon.
En
, Skjematisk fremstilling av prinsippet om DNA End-bli-analysen.
B
, etter å ha blitt behandlet med RD, eller med blokkerende antistoffer Ku 70/86, den relative evne NHEJ ble bestemt.
C
,
en
, Skjematisk fremstilling av prinsippet om NHEJ analyser.
b
, Prinsippskisse på prinsippet om HR-analyser.
D
, Antallet GFP
+ og DsRed
+ celler ble bestemt ved flowcytometri, og typiske FACS spor vises til venstre. Forholdet mellom GFP
+ til DsRed
+ celler ble brukt som et mål på reparasjon effektivitet.
Vi gikk et skritt videre for å evaluere effekten av RD på NHEJ og HR bruker
in vivo
analyser som beskrevet av Dr. Gorbunova [25,26]. For påvisning av NHEJ aktivitet, vil reporteren GFP fremstilles når NHEJ er aktiv for å reparere DSB sin indusert av enzymkutting (figur 4C, a). For påvisning av HR, kan vellykkede genet konverterings hendelser rekonstituere aktiv GFP-genet ved å reparere enzym produsert DSB sin (figur 4C, b). Etter å ha blitt behandlet med RD i 24 timer, PC-3-celler ble ko-transfektert med enzymet I-SCEI-fordøyd reporter kassett av NHEJ eller HR, og DsRed plasmid for å normalisere transfeksjonseffektivitet. Reparasjon av I-SCEI-indusert pauser vil resultere i utseendet av GFP
+ celler [26]. Etter transfeksjon ble celler analysert ved flow-cytometri, og forholdet mellom GFP
+ og DsRed
+ -celler ble anvendt som et mål på HR eller NHEJ effektivitet. Som vist på figur 4D, GFP signal betydelig redusert i enten NHEJ eller HR reparasjonssystemer i celler behandlet med RD, noe som indikerer at DSB reparasjon ble svekket respons på RD. Sammen dataene viste at RD var i stand til å hemme NHEJ og HR, og undertrykt DSB sin reparasjon i PC-3 celler.
RD nedregulerer DNA reparasjonsproteiner i PC-3 celler
Basert på observasjonene ovenfor, vi klar ytterligere rolle Ku70 /Ku86 som respons på RD-indusert DNA-skade. Etter inkubasjon av celler med RD for ulike tidsperioder, økt Ku86 og nådde 4h, deretter falt raskt opp til 48t, mens Ku70 forble uendret inntil 12 timer og falt etter at (figur 5A). vises DNA end-bindende aktivitet av Ku70 /Ku86 at, sammenlignet med ubehandlede celler, er bindings aktivitetene til både Ku70 /Ku86 i behandlede celler ble jevnt forbedrede opp til 4 timer og deretter redusert i løpet av resten av eksponeringsperioden (figur 5B), i overensstemmelse med resultatene i figur 5A. I tillegg har vi bekreftet den doseavhengige inhiberende virkning av RD på ekspresjon og bindingsaktivitet av Ku70 /Ku86 ved 4t og 12h behandlinger (figur 5C, 5D). Videre qPCR analyser viste at DNA-reparasjon forbundet
RPA1-3
,
XRCC5
,
XRCC6
, og
MSH6
ble nedregulert av RD (figur 5E ). Sammen utgjør disse observasjonene indikerer at RD svekket DNA-reparasjon som svar på DNA-skade.
A Hotell og
C
, Analyse av uttrykk for Ku70 og Ku86 i kjerneproteiner etter western blot analyse.
B Hotell og
D
, Analyse av DNA end-bindende aktivitet av Ku70 eller Ku86 i PC-3 celler eksponert for RD. *, P 0,05, signifikant forskjell fra kontroll.
E
, Heatmap for mRNA nivåer av DNA-reparasjonsgener i RD-behandlede celler som ble bestemt ved real-time RT-PCR. Red: over-uttrykk, grønn: under-uttrykk, svart: uendret uttrykk, grå: ingen registrering
RD utløser apoptose forbundet med induksjon av DNA-skader i PC-3 xenograft
for å finne ut om RD kan indusere tumor celle apoptose via induksjon av DNA-skader
in vivo
, som observert i dyrkede celler, menneske PC-3 xenografter ble utviklet i mannlige nakne mus. Administrasjon av RD hadde ingen signifikant effekt på enten første eller endelige kroppsvekt hos tumorbærende mus sammenlignet med placebogruppen (figur 6A). Etter 20d behandlinger, tumorer som oppstår fra kontrolldyrene resulterte i dreping av to dyr i løpet av forsøksperioden, mens svulster fra RD-behandlede mus hadde en signifikant mindre størrelse (figur 6B), noe som indikerer signifikant tumorvekst inhibering av RD. Reduksjon av tumormasse i RD-behandlede mus ble også observert (figur 6C). Endringer av molekylære markører assosiert med DNA-skade i behandlede mus viste at RD forårsaket DNA-skade respons via ATM /ATR-mediert signalering som dokumentert av betydelig opphopning av γH2AX, oppheving av fosfor-BRCA1 og Ku70 /Ku86 overflod (figur 6D og 6E ), i samsvar med resultatene i kulturceller. I mellomtiden, RD-mediert endringer i uttrykk for PP2A familiemedlemmer var lik observasjonene er vist i kultur celler. I tillegg, sammenlignet med placebo kontroll, oppheving av Bcl-2, akkumulering av Bax, og spaltning av PARP var tydelig i RD-behandlede mus (figur 6D). TUNEL analysen støttes også observasjoner som apoptotiske celler ble uttalt i RD-behandlede mus (figur 6F a og b). Dataene viste at RD utløst DNA-skade og nedskrevne reparasjon proteiner, som fører til celledød ved apoptose, noe som bidro til sin antitumor effekt
A
-.
C
, Effekt av RD på tumorvekst og kroppsvekten til nakne mus.
