Abstract
Bakgrunn
Tissue eksudater inneholder lave nivåer av serum komplement proteiner, og deres regulerende effekt på prostatakreft progresjon er i stor grad ukjent. Vi undersøkte spesifikke serumkomplementkomponenter i å koordinere aktivering av tumor suppressors p53 og WWOX (også kalt FOR eller WOX1) og kinaser ERK, JNK1 og STAT3 i menneskelige prostata DU145 cellene.
metodikk /hovedfunnene
DU145-celler ble dyrket over natten i 1% normalt humant serum, eller i humant serum utarmet for en indikert komplementprotein. Under supplement C1q- eller C6-frie forhold, WOX1 og ERK var hovedsakelig til stede i cytoplasma uten fosforylering, mens fosforylert JNK1 var sterkt akkumulert i kjernen. Eksogene C1q raskt gjenopprettet WOX1 aktivering (med Tyr33 fosforylering) på mindre enn to timer. Uten serum supplement C9, ble p53 aktivert, og hyaluronan (HA) reversert effekt. Under C6-frie forhold, HA indusert aktivering av STAT3, en enhancer av metastaser. Spesielt, eksogene C1q betydelig indusert apoptose av WOX1-overekspresjon DU145 celler, men ikke bil-uttrykke celler. En dominant negativ og Y33R mutant av WOX1 blokkert apoptotisk effekt. C1q forbedre ikke p53-mediert apoptose. Ved total innvendig refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi ble det fastslått at C1q destabilisert tilslutning av WOX1-uttrykkende celler ved DU145 delvis Løsne og indusere dannelsen av gruppert mikrovilli for fokal adhesjon spesielt mellom cellene. Disse cellene deretter gjennomgikk krymping, membran blebbing og død. Bemerkelsesverdig, som bestemmes av farging, ble benign prostatahyperplasi og prostatakreft vist seg å ha en betydelig redusert uttrykk av vev C1q, sammenlignet med alderstilpassede normal prostata vev.
Konklusjon /Betydning
konkludere med at supplement C1q kan indusere apoptose av prostatakreftceller ved å aktivere WOX1 og destabiliserende celle adhesjon. Nedregulering av C1q forbedrer prostata hyperplasi og kreftdannelse på grunn av svikt i WOX1 aktivering
Citation. Hong Q, Sze C-I, Lin S-R, Lee M-H, han R-Y, Schultz L, et al. (2009) utfyller C1q Aktiverer Tumor lyddemper WWOX å indusere apoptose i prostata kreft celler. PLoS ONE 4 (6): e5755. doi: 10,1371 /journal.pone.0005755
Redaktør: Nils Cordes, Dresden teknologiske universitet, Tyskland
mottatt: 04.01.2009; Godkjent: 05.05.2009; Publisert: 01.06.2009
Copyright: © 2009 Hong et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forsknings var støttes delvis av Guthrie Foundation for Education and Research, National Science Council, Taiwan (NSC96-2320-B-006-014, 96-2628-B-006-041-My3 96-2628-B-006- 045-My3), National Health Research Institute, Taiwan (NHRIEX97-9704BI), National Cheng Kung universitet Landemerke prosjekter (C0167), og det amerikanske forsvarsdepartementet, USA (BC075692) til NS Chang. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Hyaluronsyre eller hyaluronan (HA) deltar i en bemerkelsesverdig rekke cellulære og fysiologiske hendelser, inkludert embryoutvikling, morphogenesis, differensiering, betennelse, såret helbredelse, immunrespons, og kreft progresjon og metastase [1] – [ ,,,0],4]. HA er involvert i initiering og progresjon av inflammasjon i både cellulære og ekstracellulære nivåer [5], [6]. På den cellulære nivåer av betennelse, rekrutterer HA nøytrofile, aktiverer makrofager og stimulerer dendrittiske cellen modning. Men i serum HA kan samhandle med komplement-proteiner. Naturlig forekommende polysulfated glykosaminoglykaner, slik som heparin, begrense serumkomplementaktivering via både klassiske og alternative reaksjonsveier i løpet av inflammasjon [7] – [10]. Styrken av glykosaminoglykaner i hemme komplementaktivering avhenger omfang og posisjoner polysulfation. Med mindre konformasjonelt forandrede, ikke-sulfaterte HA, selv ved høye konsentrasjoner (1-5 mg /ml), kan ikke begrense komplementaktivering [7], [11] – [13]. Induksjon av serum komplementaktivering har vært ansett som viktige strategier i å drepe kreftceller
in vivo product: [14], [15]. Kreftcelle-avledet inhibitorer for blokkering tidlige komplementkomponenter er kjent for å forbedre veksten av kreft [16]. Ekspresjon av den alternative reaksjonsvei inhibitor faktor H i lungekreftceller ser ut til å være kritisk for deres overlevelse [17]. Ikke desto mindre, den funksjonelle rollen til hver individuelle serumkomplementkomponent ved regulering av kreftcelleoverlevelse er stort sett ukjent.
I likhet med andre vev blir utsatt for prostata eksudater fra blod, som inneholder lave nivåer av sirkulerende komplement-proteiner. Enten komplement proteiner kontrollere prostata cellevekst og hyperplasi med alder er ukjent. Her, ved anvendelse av sera med valgt delesjon av komplement-proteiner, undersøkte vi hvorvidt den enkelte komplementprotein regulerer aktiveringen av tumor-suppressorer og kinase-proteiner i humane prostata DU145-celler. Disse proteinene omfatter ekstracellulære-signal regulert kinase /mitogen-aktivert protein kinase (ERK eller MAPK) [18], WW domene-inneholdende oksidoreduktase (WWOX, FOR eller WOX1) [19] – [21], p53 [22], c -Jun
N
terminale kinase (JNK1), og signal svinger og aktivator av transkripsjon 3 (STAT3) [23] – [25]. Vi fastslått at uten serum supplement C1q eller C6, basal nivåer av aktivering eller kjernefysisk opphopning av ERK og WOX1 ble betydelig redusert, mens konstitutiv aktivering av JNK1 skjedde. WOX1 er en tumor suppressor og proapoptotiske protein [19] – [21; vurderinger]. Interessant, i fravær av serum komplement C9, forekom konstitutive p53-aktivering. Høy molekylstørrelse HA vesentlig indusert aktivering av STAT3 i DU145, bare når C1q var fraværende i serum. STAT3 fremmer prostatakreft invasjon [23] – [25]. Endelig C1q alene var i stand til å aktivere ektopisk WOX1 i å drepe prostata kreft celler. Vi diskuterte sannsynlig scenario for sirkulerende eller pericellulær HA og komplementproteiner i reguleringen kreft celle vekst og død via aktivering av p53, WOX1, JNK1, og STAT3.
Resultater
Komp C1q aktiverer tumor suppressor WWOX /WOX1 i menneskelig prostata DU145 cellene
Vi avgjort om C1q aktiverer endogen WOX1 for atom akkumulering. Betydelige bevis avslører at WOX1 er en tumor suppressor [19] – [21], [26]. Fosforylering av WOX1 på Tyr33 (p-WOX1) er avgjørende for dens apoptotisk aktivitet både
in vitro Hotell og
in vivo product: [27] – [31]. Ikke desto mindre, under den første hyperplasi og kreft trinn, er det en betydelig oppregulering av ekspresjon WOX1 og Tyr33 fosforylering i prostata, hud og bryst, og at uttrykket reduseres dramatisk i løpet av kreft og metastase
in vivo product: [21] , [29], [32]. Murine WOX1 /Wwox er kritisk for postnatal overlevelse, så langt knockout mus kunne overleve i bare en måned [20], [33]. Dessuten er dette protein viktig for normal beinmetabolisme [33]. Mekanismene når det gjelder kontroll for WOX1 å utøve prosurvival eller proapoptotiske funksjoner gjenstår å bli etablert.
Humant DU145-celler ble dyrket over natten i nærvær av varme-inaktivert føtalt bovint serum (10%), etterfulgt av sult i 1 hr uten serum. Disse cellene ble så behandlet med renset C1q i 1 time. Lokalisering av p-WOX1 ble bestemt ved immunofluorescens-mikroskopi. Disse cellene sultet hadde svært lave nivåer av cytoplasmisk p-WOX1 (Fig. 1A). Eksogent C1q hurtig fremkalt akkumulering av p-WOX1 i kjernen (fig. 1B). Til sammenligning, når de sultet cellene ble dyrket i 1% C1q-utarmet (ΔC1q) humant serum i 1 time, ble p-WOX1 hovedsakelig lokalisert i cytoplasma (fig. 1C). Tilberedning av ΔC1q serum med renset C1q raskt indusert p-WOX1 opphopning i kjerner (Fig. 1 D).
(A, B) DU145 cellene ble dyrket på dekkglass og dyrket over natten i 10% varme-inaktivert foster bovint serum. Cellene ble så sultet under serumfrie betingelser i 1 time, etterfulgt av behandling med eller uten renset C1q (1 pg /ml) i 1 time. Lokalisering av endogent Tyr33-fosforylert WOX1 (p-WOX1) ble bestemt ved immunofluorescens-mikroskopi. (C, D) I tillegg er de sultet cellene ble deretter dyrket i 1% C1q-utarmet humant serum (ΔC1q serum) i 1 time, i nærvær eller fravær av eksogent C1q (1 pg /ml). (E) Tilstedeværelse av p-WOX1 i kjernen er vist fra å telle ~ 100 celler i 3 forsøk (gjennomsnitt ± standardavvik).
Komp C1q aktiverer ektopisk WOX1 for å indusere apoptose av DU145 cellene
Vi avgjort om C1q aktiverer ektopisk WOX1 for å indusere apoptose. DU145 cellene ble transfektert med EGFP-WOX1 (merket med EGFP) eller EGFP alene ved elektroporering. Disse cellene ble dyrket over natten (i 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum), etterfulgt av behandling med renset C1q i 24 timer. C1q forbedret WOX1-indusert apoptose og veksthemming av DU145-celler på en doserelatert måte, som vist ved et øket cellepopulasjon ved SubG1 fase og en redusert befolkningen ved G0 /G1-fasen av cellesyklusen (fig. 2A og 2B og analytiker fig. S1). I kontroller, gjorde C1q ikke induserer apoptose i DU145 cellene overekspresjon EGFP vektor bare (fig. 2A og 2B).
(A) DU145 celler ble transfektert med EGFP-WOX1 (merket med EGFP) eller EGFP alene ved elektroporering , dyrket over natten, og deretter behandlet med renset C1q (1 pg /ml) i 24 timer. C1q forbedret WOX1-indusert apoptose av DU145-celler (se økning i SubG1 fase). I vektor kontroller, gjorde C1q ikke forbedre apoptose i DU145 cellene overekspresjon EGFP. (B) En representant datasett fra 3 eksperimenter er vist i søylediagram. Lignende resultater ble observert ved transfeksjon DU145-celler med forskjellige mengder av WOX1, etterfulgt av behandling med 1 ug /ml C1q over natten (se Tilsetnings fig. S1). WOX1: EGFP-WOX1. Vector: bare EGFP. Ingen ep: celler uten elektroporering. (C) Stabile transfektanter av BCC celler for å uttrykke EGFP eller EGFP-hWOX1 (human WOX1 /WWOX) ble etablert. Av time-lapse mikroskopi, C1q (1 pg /ml) indusert død av hWOX1-uttrykkende celler, men ikke EGFP-uttrykkende celler. Disse hWOX1-uttrykkende celler så ut til å gjennomgå apoptose typisk, som de viste celle krymping og membran blebbing i en tidsrelatert måte. En representant data vises fra 5 eksperimenter.
forbedring av apoptose av C1q var ikke på grunn av sin aktivering av komplement kaskade i fosterets bovint serum, såfremt serum ble varme inaktivert. Også under serumfrie betingelser, eksogene C1q forbedret ektopisk WOX1-mediert apoptose (data ikke vist). Disse observasjonene tyder på at WOX1 er en nedstrøms effektor av C1q-mediert apoptose, uten involvering av komplementaktivering.
Under lignende eksperimentelle forhold, viste vi at C1q økt apoptose i celler som overuttrykker WOX1. Disse inkluderte bryst MCF7 (Supplementary fig. S2), og neuroblastom SH-SY5Y (Supplementary fig. S3) og SK-N-SH-celler (data ikke vist). Igjen ble ingen effekt observert ved hjelp av celler bare overekspresjon EGFP.
Parallelt stabile transfektanter hud basalcellekarsinom (BCC) celler for å uttrykke EGFP eller menneskelig WWOX /WOX1 (hWOX1 merket med EGFP) ble etablert ved hjelp av G418 valg. Ved time-lapse mikroskopi, viste vi at BCC celler uttrykker EGFP var resistente mot C1q-mediert celledød, mens hWOX1-uttrykker cellene var følsomme for C1q (Fig. 2C). Disse hWOX1-uttrykkende celler syntes å vise typisk morfologi av apoptose, inkludert celle krymping og membran blebbing.
N
terminale Tyr33-fosforylert WW domenet WOX1 er ansvarlig for C1q-indusert apoptose av DU145 cellene
Vi bestemt hvilke domene (r) i WOX1 deltar i C1q-mediert apoptose av DU145 cellene. Menneskelige og murine WWOX /FOR /WOX1 er sammensatt av to
N
terminale WW domener, en kjernefysisk lokalisering sekvens, og en
C
terminale kortkjedede alkohol dehydrogenase /reduktase (SDR) domene [19-21,34; vurderinger]. En dominant negativ-WOX1 (dn-WOX1) ble tidligere utformet, med endringer i
N
terminale første WW domene [27]. dn-WOX1 er kjent for å blokkere den apoptotiske funksjonen av p53 og forhindre fosforylering av endogent WOX1 ved Tyr33 [27]. Når DU145 cellene ble transient overexpressed med dn-WOX1 (EGFP tag), cellene motsto C1q-indusert apoptose (Fig. 3). I kontroller ble celler transfektert med en vektor EGFP bare, og cellene ikke gjennomgår apoptose i respons til C1q (data ikke vist eller se fig. 2). I positive kontroller, ble ikke-transfekterte celler behandlet med staurosporin å indusere apoptose (Fig. 3).
(A) DU145 cellene ble electroporated med ulike mengde dn-WOX1 (EGFP tag) eller EGFP alene, fulgt ved å dyrke i 24 timer. dn-WOX1-uttrykkende celler ble behandlet med C1q (1 pg /ml) over natten, ble og cellesyklusanalyse utført. EGFP-uttrykkende celler ble behandlet på samme måte (data ikke vist). I tillegg ble ikke-transfekterte kontrollceller behandlet med eller uten staurosporin (1 uM) over natten. (B, C) En representant datasett for både SubG1 og G0 /G1 faser vises (fra 3 forsøk).
Dermed er basert på de ovennevnte observasjoner,
N
terminale WW domene WOX1 er sannsynlig å være ansvarlig for C1q-indusert aktivering av WOX1 for å drepe kreftceller. DU145 cellene ble transfektert med
N
terminale WW domenet WOX1 (WOX1ww med en EGFP tag) eller EGFP bare ved elektroporering og dyrket i 24 timer. Ved time-lapse mikroskopi av levende celler, eksogene C1q indusert apoptose av celler som uttrykker WW domener (fig. 4A). Cell krymping og kjernekraft kondens inntraff ca 100-130 min ved eksponering av celler til C1q. Dette er et typisk arrangement av apoptose. Når DU145 cellene ble transfektert med WOX1ww og dn-WOX1 ble C1q-indusert apoptose minsket (Fig. 4B). Tyr33 fosforylering i WOX1 spiller en nøkkelrolle i apoptose både
in vitro Hotell og
in vivo product: [27] – [31]. Vi endret Tyr33 til Arg33 i første WW domene [27], [35], og fastslått at C1q ikke megle apoptose når cellene uttrykte denne mutant protein (fig. 4C). I vektorkontrollcellene, ble det ikke observert apoptose (Fig. 4D). C1q-mediert celledød ble ikke observert hos disse kontrollceller etter en lengre inkubasjon i mer enn 8-24 timer, som er lik de nevnte observasjoner (fig. 2).
(A) Lever DU145 cells- uttrykker
N
terminale WW domene (WOX1ww; EGFP tag) ble behandlet med C1q (1 mikrogram /ml), etterfulgt av opptak morfologiske endringer ved automatisk time-lapse mikroskopi (ett bilde per 10 min). Cell krymping og kjernekraft kondens inntraff ca 100-130 min ved eksponering av celler til C1q. (B) Når celler ble transfektert med WOX1ww og dn-WOX1 ble C1q-indusert apoptose betydelig redusert. (C) Endring av Tyr33 til Arg33 i WOX1 forårsaket ikke C1q-mediert celledød. (D) nr apoptose ble observert i celler som uttrykker EGFP bare ved eksponering for C1q. Sammenlignet med de ovenfor angitte forsøk, ble C1q-konsentrasjonen øket for time-lapse mikroskopi eksperimenter. Et representativt datasett er vist fra 5 eksperimenter. Omtrent 100 celler ble undersøkt på slutten av time-lapse mikroskopi. Et fusjonert bilde av cellen uttrykker grønn fluorescens og lyse felt bildet vises (før utfordring med C1q).
C1q /WOX1-indusert apoptose ble ytterligere bekreftet ved internucleosomal DNA-fragmentering analyse ved hjelp av agarose gelelektroforese. Resultatene viste spaltede DNA stiger som induseres av C1q i WOX1-uttrykke DU145 og SH-SY5Y celler (Fig. 5 og analytiker Fig. S4). I egnede kontrollceller uttrykker EGFP eller ingenting, gjorde C1q ikke induserer DNA-fragmentering (fig. 5 og analytiker Fig. S4).
(A) DU145 cellene ble electroporated med cDNA uttrykk konstruksjoner av WOX1, dn-WOX1 ( DN), og /eller p53. 24 timer senere ble cellene eksponert for C1q i 8 timer. I hensiktsmessige kontroller, ble celler elektroporert med medium (Sham) eller uten elektroporering (forts). Ingen DNA-fragmentering ble vist i disse kontrollene. C1q økte DNA-fragmentering i celler som uttrykker WOX1, men ikke p53. C1q trykt p53 /WOX1-økt DNA-fragmentering. dn-WOX1 hemmet celledød forårsaket av p53. (B) Intensiteten av DNA-fragmentering ble kvantifisert ved Photoshop, og i gjennomsnitt resultater som er vist i søylediagrammet var fra to eksperimenter. Den «Sham» kontroll (uten C1q behandling) regnes som 0%.
C1q ikke øker p53-mediert apoptose
Vi har vist at tumor suppressor p53 fysisk samhandler med WOX1 kan og begge proteiner føre til apoptose i en synergistisk måte, [26], [27], [30]. Viktigere, stabiliserer WOX1 p53 og hindrer dens degradering [30]. Vi bestemte rollen p53 og WOX1 i C1q-regulert celledød. Når DU145-celler ble transient overuttrykt med p53, ble C1q ikke i betydelig grad øke graden av DNA-fragmentering (fig. 5A og 5B). I kombinasjon, både p53 og WOX1 økte DNA-fragmentering. Forbløffende nok C1q undertrykte DNA fragmentering i p53 /WOX1-uttrykke celler. Etter avtale med våre tidligere observasjoner [27], ble dn-WOX1 vist seg å hemme p53-mediert DNA-fragmentering (fig. 5A og 5B).
Ektopisk WOX1 induserer dannelsen av klynge microvilli i mellom DU145 celler og C1q forsterker klyngen dannelsen
Vi undersøkte celle morfologiske endringer forårsaket av ektopisk uttrykk med EGFP eller EGFP-WOX1 i DU145 cellene, samt effekten av C1q. Time-lapse mikroskopi viste at C1q indusert krymping og membran blebbing av WOX1-uttrykke DU145 og BCC celler under behandling for 2-4 timer eller lenger (fig. 2C og 4A). Når DU145-celler ble overuttrykt med EGFP og dyrket over natten, disse hvilende celler klebet flatt på dekkglassoverflaten, som bestemt ved total indre refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi (fig. 6A). TIRF bilde tiltak protein dynamiske hendelser på cellemembranen og cytoskeletal områder [36], [37]. Interessant, forbigående overuttrykt EGFP-WOX1 induserte punktformet formasjon på celleoverflaten, og disse punctates, som inneholder EGFP-WOX1, ble for det meste gruppert i mellom cellene (fig 6B, jf. Pilspisser). Ved en høyere forstørrelse er disse punctates var faktisk mikrovilli, som er nødvendig for fokal adhesjon (Fig. 6C). Spesielt er mange av disse WOX1-uttrykkende celler klebet til dekkglassoverflaten hovedsakelig av pericellulær mikrovilli, som deres ventral områder ble løsnet fra overflaten. Under behandling i 1 time, C1q økt betydelig dannelse av klynge mikrovilli i mellom celler (Fig 6B;. Se pil). Denne handlingen ser ut til å destabilisere celle adhesjon for påfølgende krymping, membran blebbing og eventuell død. I overensstemmelse med våre nylig rapport [38] kan WOX1 være assosiert med celleoverflaten hyaluronidase Hyal-2.
(A) Når DU145-celler ble transfektert med EGFP og dyrket over natten, disse cellene klebet flatt på dekkglasset overflate, bestemt ved TIRF mikroskopi for måling av grønn fluorescens på cellemembranen og cytoskeletal områder (600 x forstørrelse). Epi: epifluorescence. (B) I motsetning til dette, transient overuttrykt EGFP-WOX1 induserte dannelsen av punctates, som vist i klynger, på celleoverflaten (se pilspisser; 600 x forstørrelse). C1q betydelig økt punktformet dannelse, spesielt på mellom celler (se pil). Økning i antall punctuates er ca 3-6 ganger. (C) gruppert punctates, som er rik på EGFP-WOX1 uttrykk, er faktisk microvilli på celleoverflaten (600 × forstørrelse ved mikroskopi og 3x digital forstørrelse).
C1q er uttrykt i arkiv prostata vevsprøver og er betydelig nedregulert i hyperplasi og kreft prostata vev
De ovennevnte observasjoner tyder på at serum-eller vev-derived supplement C1q kan indusere WOX1 aktivering
in vivo
, og dermed begrense kreft progresjon. Mens endringer av menneskelig
WWOX
genet forekommer hyppigst i prostata og bryst [20], [21], [34] undersøkte vi uttrykket av C1q i arkiv prostata vev fra post mortem pasienter. Ved immunfluorescens mikroskopi, fant vi ut at i forhold til alderstilpassede prostata vev, er C1q betydelig nedregulert i benign prostatahyperplasi (BPH) og prostatakreft (figur 7A og 7B,. 100 × forstørrelse). På et høyere forstørrelse, ble C1q vist å uttrykke i basal og epitelceller arkiv prostata vevsprøver, og C1q ble colocalized med p-WOX1 i disse cellene (Fig. 7C).
(A) Prostate vev, inkludert normal prostata, BPH og prostatakreft, ble farget med spesifikt antistoff mot C1q og deretter med sekundært fluorescerende antistoff. Kjerner ble farget med DAPI (100 × forstørrelse). (B) C1q er betydelig nedregulert i BPH og prostatakreft, sammenlignet med alderstilpassede prostata vev (
p
0,0001, n = 5; Student
t
test). Når non-immunserum ble anvendt som kilde for primær antistoff, ble ikke noe signal observert (data ikke vist). (C) C1q er uttrykt i basal og epitelceller arkiv normale prostatakjertler (400 x forstørrelse). Både C1q og p-WOX1 er colocalized i disse cellene. Kjerner ble farget med DAPI. Lignende resultater ble observert med arkiv kjertel celler fra BPH. Sammenlignet med de vanlige prostata vev, ble eksponeringstiden for å ta bildene for BPH økt. Scale bar, 100 mikrometer.
Serum utfylle C1q og C6 er avgjørende for å støtte basal fosforylering av ERK og WOX1 i DU145 cellene
Vi undersøkte om nedregulering av C1q
in vivo
kan redusere aktivering av kreftdempere
in vitro
, og dermed gi bedre overlevelse for prostata kreft celler. DU145-celler ble dyrket over natten under serumfrie betingelser, i nærvær av 1% normalt humant serum, eller 1% humant serum med uttømming av C1q, C6, C7, C8, C9 eller. Ved Western blotting, fant vi ut at både ΔC1q og ΔC6 sera ikke kunne støtte den konstituerende uttrykk for WOX2 (en isoform av WOX1) og p-ERK i DU145 celler (fig. 8A og 8B), noe som tyder på at serum C1q og C6 komponenter er avgjørende for ekspresjon av disse proteiner. Til sammenligning komponent C7, C8 og C9 har ikke støtter ekspresjon av WOX2 og p-ERK (fig. 8A og 8B). Ekspresjon av ERK, WOX1, MEK1, og p53 ble ikke signifikant påvirket av de ovennevnte dyrkningsbetingelser (figurene 8A og 8B;. Data ikke vist for MEK1).
(A, B) DU145-celler ble dyrket natten under serumfritt (SF) forhold, eller i 1% normalt humant serum (NHS) eller NHS utarmet med C1q (ΔC1q), C6 (ΔC6), C7 (ΔC7), C8 (ΔC8), eller C9 (ΔC9). Betydelig reduksjon av isoform WOX2 uttrykk ble observert i DU145 cellene når de dyrkes i ΔC1q eller ΔC6 serum (versus SF kontroller;
p
0,001; Student
t
test), mens ΔC7, ΔC8, eller ΔC9 serum var mindre effektiv. Aktivering eller fosforylering av ERK (p-ERK) var avhengig av tilstedeværelsen av C1q eller C6 i serum (versus SF-kontroller;
p
0,001; Students
t
test). Et representativt sett av data fra 3 eksperimenter er vist. Baren Grafene viser gjennomsnittet av 3 eksperimenter. (C) De ovenfor angitte celler ble også dyrket på dekkglass under identiske betingelser serum. Ved immunfluorescens mikroskopi, serum uten C1q eller C6 kan ikke støtte den konstituerende uttrykk for WOX2 (
p
0,0001, som mot SF eller NHS, Student
t
test). Omtrent 200 celler ble kvantifisert individuelt i henhold til fluorescens mikroskopi, og graden av fluorescens ble subtrahert (eller normalisert) fra negative kontroller (celler farget med kun sekundært antistoff). Kjerner ble farget med DAPI. (D, E) De samme celler, som angitt i (A), ble farget med p-WOX1 antistoff og graden av protein-ekspresjon ble kvantifisert. (F) Igjen er identiske forsøk ble utført for Western blotting. Under C1q frie forhold (ΔC1q serum) ble basal aktivering av WOX1 betydelig redusert (-50% reduksjon;
p
0,001 fra versus SF og NHS, Student
t
test; n = 3).
For å bekrefte de nevnte observasjonene ble immunfluorescens mikroskopi utføres. Celler fra de ovenfor angitte forsøk ble dyrket på dekkglasset under identiske betingelser serum, deretter fiksert og farget med spesifikke fluorescens antistoff. Igjen, fant vi ut at i fravær av serum C1q og C6, ble WOX2 uttrykk signifikant nedregulert i DU145 cellene (Fig. 8C). I tillegg, når DU145-celler ble dyrket i serum uten C1q eller C6, nivåene av p-WOX1 ble signifikant redusert i DU145-celler, sammenlignet med andre dyrkningsbetingelser, som bestemt ved immunofluorescens-mikroskopi (fig. 8D og 8E). Disse observasjonene ble ytterligere bekreftet ved Western blotting, som avslørte nedregulering av p-WOX1 henhold C1q frie betingelser (Fig. 8F). Under disse betingelser, p-WOX1 var til stede hovedsakelig i cytoplasma av DU145-celler. Ingen apoptose ble observert i disse cellene under 24 timer i kultur, som bestemmes av morfologi kjerner farget med DAPI.
Komp C9 uttømming fremmer p53 atom akkumulering, og hyaluronan stimulerer atom eksport
WOX1 fysisk samhandler med p53 både
in vitro Hotell og
in vivo
, og kan indusere apoptose synergi [21], [26], [27], [30]. Selv om det eksogene C1q ikke kunne øke p53-mediert apoptose (Fig. 5), undersøkte vi effekten av serum komplement C1q og C6 i å forbedre de basale nivåene av p53 kjerne opphopning eller aktivering. Når DU145-celler ble dyrket i 1% normalt serum eller i serum uten C1q eller C6, ble akkumulering av p53 i kjernen redusert, sammenlignet med serumfrie betingelser (fig. 9A og 9C). Bemerkelsesverdig, uten serum C9, ble p53 akkumulert i kjernen (fig. 9B og 9C), noe som tyder på at serumkomplement C9 er i stand til å begrense p53-aktivering. Under C9-manglende forhold, eksogene høymolekylært HA indusert kjerne eksport av p53 til cytoplasma (fig. 9B og 9C). I kontrast, HA restaurert p53 atom akkumulering etter C6-frie forhold (Fig. 9A og 9C).
DU145 cellene ble dyrket over natten i hver indikert serum med uttømming av en bestemt supplement protein. p53 lokalisering i cellene ble bestemt ved immunofluorescens-mikroskopi. (A) I fravær av komplement C6 (ΔC6 serum), p53 var hovedsakelig tilstede i cytoplasma. Høy molekylstørrelse HA (50 ug /ml) indusert kjerne akkumulering av p53 under behandlingen i 1 time. (B) I fravær av serum C9 (ΔC9 serum), p53 var hovedsakelig lokalisert i kjernen, og HA (50 ug /ml) indusert kjerne eksport i 1 time. (C) For å bestemme nukleær lokalisering av p53, var ca. 200 celler tellet. Vist i søylediagrammet er et gjennomsnitt av resultatene danner to eksperimenter. (D) I negative kontroller ble cellene farget med Texas Red-konjugert sekundært antistoff bare. SF, serum gratis; NHS, normal human serum.
Serum supplement C1q og C6 utarming induserer konstituerende JNK1 aktivering
Vi har vist at JNK1 fysisk samhandler med WOX1, og at bindingen er økt ved stimulering av celler med UV-lys eller anisomycin (aktivator av JNK1)
in vitro product: [27]. Interessant, dopaminerge neurotoxin 1-metyl-4-fenyl-pyridinium (MPP
+) reduserer bindingen av WOX1 med JNK1 i rottehjerner [31]. JNK1 blokkerer apoptotisk funksjon WOX1
in vitro product: [27], mens funksjonell antagonisme
in vivo
er ukjent. JNK1 og isoformer er involvert i stress og apoptotiske respons, celle-proliferasjon, og mange typer av sykdommer [39]. Selv om de ovenfor angitte resultater viste at komplement C1q og C6 understøttet aktivering av WOX1 (fig. 8), er disse proteinene predikert til å blokkere JNK1 aktivering, og uttømming av C1q og C6 fra sera vil føre JNK1 aktivering. Under lignende eksperimentelle betingelser, da DU145-celler ble dyrket i ΔC1q eller ΔC6 serum, konstitutiv aktivering JNK1 inntraff, som bestemt ved både Western blotting (fig. 10A) og immunofluorescens-mikroskopi (fig. 10B).
(A) DU145 cellene ble dyrket under serumfritt (SF) forhold, eller i 1% NHS, ΔC1q eller ΔC6 serum for 16-24 timer. I fravær av C1q og C6, oppsto spontan JNK1 aktivering (versus SF kontroller;
p
0,001; Student
t
test), som bestemmes av Western blotting. Et representativt sett av data er vist fra 3 eksperimenter. (B) Lignende resultater ble observert av immunfluorescens mikroskopi, som viser betydelig JNK1 aktivering eller kjernekraft opphopning henhold serum C1q- og C6-frie forhold (versus SF;
p
0,001; Student
t
test, n = 3). ΔC9 serum hadde ingen effekt. Omtrent 200 celler ble telt fra hvert eksperiment. (C, D) Det var ingen STAT3 aktivering i DU145 cellene under alle de angitte serum forhold. Under C1q-frie forhold, HA (50 ug /ml) effektivt indusert STAT3 fosforylering i celler under behandlingen i 1 time. Omtrent 200 celler ble talt fra hvert forsøk (n = 3).
I fravær av C1q, HA induserer STAT3 fosforylering i DU145 cellene
STAT3 aktivering spiller en avgjørende rolle i prostata kreftcelle invasjon [23] – [25]. HA deltar også i kreft invasjon, noe som tyder på at HA aktiverer STAT3 for å fremme kreft metastasering. Tilsvarende ble DU145 cellene dyrket over natten under ulike serumfrie eller -present forhold. Disse cellene ble deretter utsatt for HA i 1 time. Ingen aktivering av STAT3 ble observert ved anvendelse av normal eller komplement-utarmet serum (fig. 10C og 10D). Spesielt, i fravær av C1q, HA indusert STAT3 aktivering i DU145-celler (fig. 10C og 10D), noe som tyder på at HA kan øke metastasering av C1q-manglende prostatakreftceller ved oppregulering STAT3 fosforylering og undertrykke aktivering av p53 og WOX1. Alle de ovennevnte forsøk ble utført ved anvendelse av medisinsk kvalitet HA fra Lifecore. Lignende resultater ble observert ved anvendelse av medisinsk kvalitet Healon (data ikke vist). Disse HA preparater er fri for protein forurensning.
Diskusjoner
Den menneskelige serum komplement kaskade er tradisjonelt ansett som en kraftig humoral immunsystemet som beskytter mot invaderende mikroorganismer. Ikke desto mindre, de funksjonelle egenskapene til hver enkelt komplementkomponent er stort sett ukjent. I denne studien har vi vist for første gang at C1q er uttrykt i prostata. Bemerkelsesverdig, er C1q uttrykk betydelig redusert i benign prostatahyperplasi og prostatakreft.
