Abstract
mikrocystiner er potente fosfatase hemmere og cellulære giftstoffer. De krever aktiv transport av OATP1B1 og OATP1B3 transportører for opptak i menneskelige celler, og den høye uttrykk for disse transportører i leveren står for deres selektive levertoksisitet. En rekke humane tumorer er blitt vist å ha høye nivåer av ekspresjon av OATP1B3 men ikke OATP1B1, hovedtransportøren i leverceller. Vi antok at Mikrocystin varianter kan bli isolert som transporteres fortrinnsvis av OATP1B3 forhold til OATP1B1 å avansere som cytostatika med klinisk tålelig levertoksisitet. Mikrocystin varianter som er isolert og testet for cytotoksisitet i kreftceller stabilt transfektert med OATP1B1 og OATP1B3 transportører. Mikrocystin varianter med cytotoksiske OATP1B1 /OATP1B3 IC
50 forhold som varierte mellom 0,2 og 32 ble funnet, noe som representerer en 150-fold range i transporter selektivitet. Som -mikrocystin strukturen har en betydelig innvirkning på transporter selektivitet, er det potensielt mulig å utvikle analoger med enda mer uttalt OATP1B3 selektivitet og dermed muliggjøre deres utvikling som kreft narkotika
Citation. Niedermeyer THJ, Daglig A, Swiatecka-Hagenbruch M, Moskva JA (2014) Selektivitet og potens av mikrocystin kongenere mot OATP1B1 og OATP1B3 uttrykke kreftceller. PLoS ONE 9 (3): e91476. doi: 10,1371 /journal.pone.0091476
Redaktør: Matias A. Avila, Universitetet i Navarra School of Medicine og Senter for anvendt medisinsk forskning (CIMA), Spania
mottatt: 19. desember 2013; Godkjent: 13 februar 2014; Publisert: 10 mars 2014
Copyright: © 2014 Niedermeyer et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av DanceBlue, en student-run innsats som støtter klinisk arbeid og forskning i pediatrisk onkologi ved Universitetet i Kentucy, og delvis av det tyske føderale departementet for økonomi og teknologi (KF2766301SB0). Open Access publisering er støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft og Open Access Publishing Fund of Tübingen University. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Timo Niedermeyer og Monika Swiatecka-Hagenbruch er ansatte i Cyano Biotech GmbH. Det er ingen markedsført produkter å erklære. Cyano Biotech GmbH har gitt tillatelse til å publisere manuskriptet. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
mikrocystiner (MCS) er sykliske heptapeptider produsert av flere cyanobacterial slekter som
Microcystis
,
Oscillatoria
,
Planktothrix
,
Nostoc
, og
Anabaena
. De kan anses å være blant de beste studert cyanobakterietoksiner sekundære metabolitter [1] – [4]. Den felles strukturelt trekk ved mikrocystiner er en polyketide syntase-avledet aminosyre med forkortelsen «Adda», (2S, 3S, 8S, 9S) -3-amino-9-metoksy-2,6,8-trimetyl-10-phenyldeca- 4,6-diensyre, som også er en av de to obligatoriske lene til den potente protein serin /treonin-fosfataser (PP) og en PP2A-inhibering observert for de mikrocystiner [5] – [9]. Ikke bare er biosyntesen av disse forbindelser ved polyketide synthases og ikke-ribosomale peptid-syntetaser bemerkelsesverdig godt forstått [10] – [12], men også mer enn 90 individuelle medlemmer av denne kjemisk svært mangfoldig forbindelsen familie har blitt beskrevet i den vitenskapelige litteratur for å dato (fig. 1) [13] – [56]. Spesielt utsatt for variasjoner er L-aminosyrer befinner seg i posisjonene 2 og 4 i MC ryggraden. Beslektede forbindelser er nodularins, som finnes i
Nodularia
sp, som også inneholder Adda men er sykliske pentapeptider i stedet for heptapeptider (fig 1). [57] -.. [60]
Prevalens av rester innenfor mikrocystiner (til venstre) og nodularins (til høyre) er proporsjonal med skriftstørrelsen for den respektive rester. Data brukt til å generere dette tallet er deponert på https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.880756.
Å være potente protein serin /treonin fosfatase hemmere, mikrocystiner og nodularins har en dyp effekt på cellesignalisering og cytoskjelettet vedlikehold, noe som fører til døden av berørte celler [61], [62]. Men den forholdsvis store og amfifile MCS er ute av stand til å krysse cellemembraner ved passiv diffusjon. I stedet er de avhengige aktivt opptak av celler. Tre medlemmer av den organiske anion transportører (OATP) familie er i stand til å formidle dette opptaket av MC, nemlig OATP1B1, 1B3 og 1A2 [63], [64]. OATP1B1 og OATP1B3 er de mest effektive Mikrocystin transportører, og som hos friske mennesker både transportører er utelukkende funnet å være uttrykt i levervev [64], [65], mikrocystiner og nodularins er kjent for å forårsake omfattende skader på leveren [66] – [68 ]. Dermed mikrocystiner ble beryktet som hepatotoxins forårsaker skade på mennesker og fe når disse forbindelser akkumulert i drikkevannskilder i løpet av alge vann blomst ganger [69], [70]. Hemmere av disse OATP transportører forbedre den hepatotoksisitet av mikrocystiner og nodularins [68], [71], [72]. I motsetning til OATP1B1, som er uttrykt i hepatocytter gjennom leveren lobe, er OATP1B3 lokalisering begrenset rundt den sentrale vene [64]
OATP er for tiden i diskusjonen som mål for cancerterapi [73] -. [76] . Mest interessant, OATP1B3, men ikke OATP1B1, er blitt funnet å være funksjonelt uttrykt i en rekke kreft vev, spesielt tumorer, men også brystsvulster, lungesvulster, pankreas og levertumorer [75], [77] – [79] . Som differensial toksisitet av naturlig -mikrocystin varianter på cellelinjer som uttrykker enten OATP1B1 eller OATP1B3 har blitt observert [78], [80], disse funnene reiste spørsmål om mikrocystiner kan være egnet som leder for legemiddelsubstanser mot disse krefttypene, og hvis det er mikrocystiner blant mer enn 90 kjente varianter som er selektivt transportert av OATP1B3 forhold til OATP1B1. Selektivitet som favoriserer OATP1B3 løpet OATP1B1 bør føre til en redusert leverclearance og økt opptak av MCs i OATP1B3-uttrykke svulster, og skaper en terapeutisk vindu av den respektive forbindelsen ved å redusere leverclearance hastighet og toksisitet. MCS er interessante som nye bly strukturer fordi de har en virkningsmåte ennå ikke er brukt, men for tiden diskutert for kreftterapi (fosfatase inhibering) [81] – [83], og i motsetning til de fleste for tiden tilgjengelige anticancer medikamenter, må de aktive transport inn i cellene og dermed spare alle vev ikke uttrykker de nevnte OATP.
Vi har isolert ulike mikrocystin kongenere fra cyanobakterier av slektene
Microcystis
,
Planktothrix
, og
Nodularia
å teste hypotesen om forskjellige transporter selektivitet kan være oppnåelige. Som verktøy for selektivitet testing, livmorhalskreft HeLa-celler og tykktarmskreft RKO celler stabilt transfektert med ekspresjonsvektorer for OATP1B1 og 1B3 har blitt brukt. I den foreliggende manuskriptet er resultatene av testingen av isolerte MC på disse cellelinjer er beskrevet. De fast IC
50 verdier samt de observerte selektivitet forskjellene tydelig viser at små strukturelle forskjeller i den testede MCs faktisk har en betydelig innvirkning på transporter selektivitet og cytotoksiske potens.
Diskusjon
Resultater og
aminosyre (AA) komposisjoner av de testede MCs er oppsummert i tabell 1
strukturene til mikrocystin kongenerne er fastsatt basert på tandem HRMS [51], [52], [84 ], støttet av
1H og COSY-NMR-spektroskopi. Alle MCS inneholder den karakteristiske Adda rest ved stilling 5 og D-Ala i posisjon 1 av molekylet. Bare én av de isolerte kongenere har en
O
metylert d-iso-Glu i stedet for d-iso-Glu i posisjon 6 (22). d-iso-β-MeAsp og d-iso-Asp i posisjon 3 er nesten likt fordelt, som er Mdha og DHB i posisjon 7. l aminosyrer i posisjon 2 omfatter Leu, Tyr, Arg, HTY, Hil (synkende rekkefølge av teller), i posisjon 4 Arg, Tyr, Trp, Phe, HTY, og har er funnet. I tillegg til 22 MC varianter, nodularin (23) som en syklisk Adda innehold pentapeptid samt okadainsyre (24) som et strukturelt ikke-relaterte MC PP-inhibitor har blitt testet.
IC50-verdiene av alle isolerte MCs mot OATP1B1- og OATP1B3-uttrykke HeLa eller RKO cellelinjer er blitt bestemt. Resultatene er vist i tabell 2.
Interessant markerte forskjeller både potens og selektivitet for den enkelte MC kongenere kunne observeres.
Selektivitet
Mens substitusjons d-iso-β-MeAsp
3 for d-iso-Asp
3 (f.eks forbindelser 1/2 og 13/14) synes ikke å ha vesentlig innflytelse på verken styrke eller selektivitet, påvirkning av tilstedeværelsen av enten Mdha
7 eller (
E
) -Dhb
7 (f.eks 3/4, 5/6, 8/9 og 14/15) er tvetydig: Mens i saken 3/4 og 5/6 substitusjon av Mdha
7 for (
E
) -Dhb
7 føre til en markert økning i selektivitet for OATP1B3 løpet OATP1B1, denne effekten ble ikke observert for åtte /9 og 14/15. Som de seks minst OATP1B3 selektive forbindelser (1, 2, 3, 5, 7, 23) alle har Mdha
7 eller Mdhb
7 while (
E
) -Dhb
7 er funnet i tre av de 6 mest OATP1B3 selektive forbindelser (4, 10, 12, 15, 16, 18), er det sannsynlig at (
E
) -Dhb
7 har en innflytelse i selektivitet, men er ikke den eneste strukturelt trekk givende selektivitet.
Faktisk, spesielt aminosyrerestene i posisjonene 2 og 4 i MC kjernestrukturen synes å være viktig for både potens og selektivitet. Mens 80% av de mest OATP1B1 selektive forbindelser har Leu i stilling 2, er denne aminosyren fullstendig fraværende i de fleste OATP1B3 selektive forbindelser. Imidlertid er Leu også funnet i posisjon 2 av flere beslektede forbindelser som er svakt OATP1B3 selektive (6, 8, 9), for således Leu alene ikke gir en forbindelse OATP1B1 selektiv. Arg i posisjon 2 ser ut til å indusere OATP1B3 selektivitet, mens Arg i posisjon 4 ikke har noen innflytelse på selektiviteten. Dette er åpenbart med forbindelser 13 og 16, hvor utveksling av aminosyrene i posisjonene 2 og 4 har en stor innvirkning på selektiviteten. Arg i kombinasjon med de aromatiske aminosyrene Phe, Tyr, og HTY er fremtredende monomerer som finnes i OATP1B3 selektive forbindelser. Spesielt kombinasjoner av Arg
2 og Phe
4 (12) eller Arg
2 og Tyr
4 (16) ser ut til å gi OATP1B3 selektivitet. Men igjen, synes tilstedeværelsen av Arg i posisjon 2 ikke å være obligatorisk for OATP1B3 selektivitet (4).
Det er interessant at pentapeptidet nodularin (23) er den mest OATP1B1 selektive blant de Adda inneholdende forbindelsene som ble undersøkt.
Potens
Styrken av MC indusert celledød i testsystemet som brukes i denne studien har to fasetter. På den ene siden, toksisitet av MC kongenerer avhenger av omfanget av deres PP hemming [85]. På den annen side er potens avhengig av transport av kapasiteten av den respektive OATP-. Disse to virkninger er ikke blitt preget i den foreliggende undersøkelse. Mens noen tidligere studier tyder på at
in vitro Hotell og
in vivo
giftighet er relatert til enzymhemming heller enn transport [78], [85], andre rapporter viser sammenlign PP hemming av forskjellige Mikrocystin kongenere , noe som tyder på at forskjeller i transport bidra til
in vivo
toksisitet [80], [86].
Ikke overraskende, 22, med
O
metylert d-iso- Glu
6, er en av de minst potente forbindelser. Modifikasjoner av den frie karboksylsyre med Glu som sannsynligvis vil føre til et tap av effektivitet på grunn av tap av interaksjon med en positivt ladet arginin i det aktive sentrum av protein fosfataser [7] og Glu (OMe) som inneholder beslektede forbindelser er blitt funnet å hemme PP1 i mye mindre grad enn analoge Glu inneholder MCs [87] og har lavere
in vivo
toksisitet [26]. Interessant, også 10, 11 og 21 viste svakere toksisitet enn de fleste andre beslektede forbindelser. Mens 10 inhiberer PP2A omtrent tyve ganger svakere enn 1 [78], [80], [85], [86], dens toksisitet i foreliggende analyse er omtrent 500 ganger lavere. Dette indikerer at i tilfellet med 10 (og også dens analog 11), er det sannsynlig at toksisitet er ikke bare et spørsmål om PP inhibering effektivitet, men også for OATP- transporterende evne, som MC-RR er et dikation under fysiologiske betingelser og dermed mindre sannsynlighet for å bli transportert over cellemembranen ved anion-transportører. Generelt vil cytotoksisitet i vår analyse ikke korrelerer med proteinfosfatase inhibering potens, som beskrevet i litteraturen for forbindelsene 1, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 18, 19, 20, 23 [56], [ ,,,0],78], [80], [85], [86]. Våre data indikerer således at ulike transporteffektivitet har en høyere effekt på
in vivo
toksisitet enn ulik protein fosfatase hemning potens.
Interessant, mest potente MCS med IC
50 verdier i sub-nanomolare området (5, 6, 7, 8, 17, 18, 19), alle har kombinasjoner av enten Leu
2 og Tyr /Phe /Trp
4 eller Tyr /HTY
2 og Tyr /HTY
4. Arg er fraværende fra de mest potente kongenerne. De minst potente kongenere med IC
50 verdiene 100 nM (10, 11, 21, 22) alle har enten Tyr
2 og Arg /Har
4 eller Arg
2 og Arg
4. Tilstedeværelse av Arg generelt senker styrken, igjen støtter hypotesen om at den positivt ladede Arg-rester hemme transporteffektivitet i tillegg til å redusere PP2A-inhibering, og således lavere
in vivo
toksisitet.
Oppsummering og Konklusjoner
i vår screening av 23 naturlige MC varianter, vi har funnet flere MCs med en IC
50 i lav nanomolar spekter og transporter selektivitet som favoriserer OATP1B3 løpet OATP1B1 med en faktor på opptil tretti. Mens tilstedeværelsen av Arg generelt senker styrken av MC cytotoksisitet, synes dens tilstedeværelse i posisjon 2 av MC kjernestrukturen også å være viktig for OATP1B3 selektivitet, noe som tyder på at denne transporter kan være mer tolerante for den kationiske natur Arg under fysiologiske betingelser enn OATP1B1. Dessuten synes nærværet av de svakt sure aromatiske aminosyrer Tyr eller HTY i stilling 4, i tillegg til Arg i posisjon 2 gunstig for OATP1B3 selektivitet.
Videre studier er nødvendig for å skille hvorvidt de observerte forskjellene i styrke skyldes ulik PP hemming eller annen transport evnen til OATP. Men tidligere funn tyder på at
in vivo
toksisitet er i hovedsak avhengig av OATP transportkinetikk enn på forskjeller i PP hemming [80], [86].
Selv om utledede struktur aktivitetsforhold er tvetydige i deler, kan de strukturelle trekk som observeres for OATP1B3 selektivitet bli kondensert til den for tiden mest sannsynlig selektive generelle struktur cyklo (-D-Ala
en-l-Arg
2-d- (Me) Asp
3-l-aromatiske aminosyre
4-Adda
5-d-Glu
6 – (
E
) -Dhb
7). Denne generelle konstruksjon kan brukes som et utgangspunkt for å frembringe nye forbindelser f.eks av forløper foring eller biocombinatorial strategier
En utfordring ved bruk av MC som medikament fører fremdeles.: Selv med selektive MC varianter, levertoksisitet fortsatt kan være en signifikant utfordring, noe som gjør det nødvendig å generere MC varianter som kan være metabolsk detoksifiserte av friske leverceller og /eller effektivt effluxed i gallen, og dermed dra nytte av lever avgiftning og rydnings mekanismer som ikke ville bli funnet i tumorer.
Materialer og Metoder
cyanobacterial Material
Flere
Microcystis aeruginosa Hotell og
Planktothrix rubescens
stammer samt en
Nodularia
belastningen har blitt brukt til å produsere de studerte mikrocystin kongen: 2 og 3,
Microcystis aeruginosa
CBT 265; 4 og 15,
Planktothrix rubescens
CBT 310; 5, 16 og 17,
Microcystis aeruginosa
CBT 850, 6, 9, 18, 19, og 20,
Planktothrix rubescens
CBT 862, 11,
Planktothrix rubescens
CBT 329, 12,
Microcystis aeruginosa
CBT 861, 14, 21 og 22,
Microcystis aeruginosa
CBT 480, 23,
Nodularia
sp. CBT 786. Stammene ble klassifisert på grunnlag av PCR-analyse og sekvensering av forskjellige markørgener, så vel som deres morfologi, og er blitt deponert i den Cyano Biotech (CBT) Culture Collection under deponeringsnumrene som er angitt ovenfor (cyano Biotech, Berlin, Tyskland). Stammene ble dyrket i BG11 medium [88] ved 20 ° C under kontinuerlig lys (60-80 umol m
-2 s
-1) i 20 l skala fotobioreaktorer og høstet semi-kontinuerlig over en periode på flere uker.
Isolering av mikrocystiner
cyanobakterier stammer ble screenet ved HPLC-DAD /IT-TOF-MS (Kinetex C
18, 2,6 mikrometer, 100 × 3 mm kolonne, Phenomenex, Torrance, USA) under anvendelse av en lineær rekognosering gradient av vandig CH
3CN (5 til 80% i løpet av 25 minutter ved 0,6 ml /min; 0,025% volum /volum TFA) for å bekrefte MC nærvær av deres karakteristiske UV-spekteret, så vel som karakteristisk tandem MS fragment ion på
m /z
375 [52], [89]. Valgte positive stammer har vært dyrket i BG11 medium [88] ved 20 ° C under kontinuerlig lys (60-80 mikromol m
-2 s
-1) i 20 L skala foto bioreaktorer. Etter innhøsting av biomasse og frysetørking, ble biomassene resuspendert i 50% MeOH (v /v), ble behandlet med en ultralydstav (Bandelin, Berlin, Tyskland) og ble ekstrahert på en ristemaskin i 30 min. Etter sentrifugering biomassene ble deretter ekstrahert ved bruk av 80% MeOH (v /v). Den 50% MeOH og 80% MeOH ekstrakter av de respektive biomasser ble kombinert og tørket
i vakuum
. De rå ekstrakter ble fraksjonert ved hjelp av vann-metanol trinngradienter på C
18 kassettene på en VersaFlash system (Supelco, Bellefonte, USA), og fraksjonene inneholdende MCS (overvåket ved HPLC) ble tørket
i vakuum
. Etter tilberedning, ble disse fraksjonene utsatt for semi-preparativ HPLC. For en detaljert beskrivelse av isolasjonsprosedyrer se File S1. Mikrocystiner RR, LW, og LF og okadasyre ble hentet fra Axxora, LLC (San Diego, California), og mikrocystiner LR og YR ble oppnådd fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
strukturoppklaring
strukturene til de isolerte MCS har blitt bestemt ved høy-oppløsning tandem massespektrometri [51], [52], [84], og bekreftet av en- og to-dimensjonale NMR-spektroskopi. Prøvene for NMR-spektroskopi ble oppløst i 600 ul d
6-DMSO. NMR-spektra ble registrert ved 600 MHz (
1 H frekvens) på en Bruker AV-III spektrometer bruker cryogenically kjøles 5 mm TCI-trippel resonans sonder utstyrt med en akseselv skjermet gradienter. DQF-COSY spektra [90] ble registrert med 2048 × 512 komplekse datapunkter ved hjelp av 8 skanninger. Spektra ble referert indirekte til tetrametylsilan via rest signaler om d
6-DMSO (2,5 ppm for
1 H). Tandem MS data er anskaffet ved hjelp av en HPLC koblet til en IT-TOF massespektrometer (Shimadzu Europe GmbH, Duisburg, Tyskland) med electrospray ionisering i positiv modus og ble evaluert ved å bruke leverandørens programvare LCMSSolution versjon 3.60.361 med Formel Predictor versjon 1.13. For beregning av summen formler, den monoisotopic massen gjennomsnitt av minst tre skanninger har blitt brukt. Forbindelsene ble separert på en Kinetex C
18-kolonne (2,6 um, 100 x 3 mm, Phenomenex, Torrance, USA) ved anvendelse av en gradient fra 5 til 80% CH
3CN i vann over 25 min (0.1% maursyre tilsatt som modifier). Forløperioner tilsvarende [M + H]
+ ble isolert i ionefelle, fragmentert av kollisjon indusert dissosiasjon (CID) under anvendelse av argon som kollisjonsgass (kollisjonsenergi satt til 150%, kollisjonsgass til 100%, og q ( frekvens) til 45,0 kHz), og separert i TOF analysator. MS /MS-skanner ble gjennomsnitt og konvertert til mzXML format ved hjelp av leverandørens programvare og evaluert ved hjelp av programvaren mMass (kalkulert fragmentioner: M, a, b, c og z, modifikasjoner: -H
2o, NH
3, + CO, definert, kombinasjoner, matchende med en toleranse på 0,01 Da) [91]. Kommenterte tandem HRMS og
1 H-NMR-spektra av alle isolerte forbindelser kan bli funnet i File S2.
Cellelinjer og cytotoksisitetsassayer
Primær hepatocytter er ikke egnet for å studere -mikrocystin toksisitet og transport , som OATP transportører er nedregulert i løpet av timer på å plassere celler i kultur [92]. Således HeLa og RKO cellelinjer ble oppnådd fra ATCC og transfektert med ekspresjonsvektorer for OATP1B1 og OATP1B3. Individuelle kloner ble isolert ved en begrensende fortynning, og isolerte kloner som viser høye nivåer av ekspresjon ved hjelp av PCR ble videre karakterisert som tidligere beskrevet [72], [93]. Individuelle HeLa og RKO kloner ble valgt for videre studier ved demonstrasjon av økt opptak [
3H] -BQ123, et substrat for både transportører. Videre er OATP1B3 kloner vist økt opptak av [
3H] -CCK-8, et spesifikt substrat for OATP1B3, men ikke OATP1B1, mens OATP1B1 kloner ikke viser opptak av [
3H] -CCK-8. I tillegg ble RKO og HeLa-celler som er stabilt transfektert med en tom ekspresjonsvektor anvendt som kontroller. For cytotoksisitetsanalyser ble cellene sådd ut i triplikat i 96-brønners mikrotiterplater i et medium inneholdende 5% føtalt bovint serum med en tetthet på 1000 celler /brønn. Etter 24 timer, ble medium inneholdende MC strukturelle varianter tilsatt til cellene. Etter ytterligere 3 dager ble celleoverlevelse bestemt med en sulforhodamin-baserte analysen som vi har tidligere beskrevet [93] – [95]. Som doseresponskurver for å forårsake apoptose mikrocystiner er bratt og gå ned til 0 i løpet av 72 timer, er det sulforhodamin analysen indikerer celledød [72], [93]. IC
50 ble beregnet fra doseresponskurven som konsentrasjonen av medikament som ga en 50% reduksjon i den midlere absorbans i forhold til de ubehandlede brønner og rapporteres som et gjennomsnitt av minst tre uavhengige bestemmelser utført in triplo ved bruk av Prism software .
Hjelpemiddel Informasjon
fil S1.
Detaljer om isolering av Mikrocystin kongenere
doi:. 10,1371 /journal.pone.0091476.s001 product: (PDF)
fil S2.
kommenterte tandem HRMS og
1 H-NMR-spektra av alle isolerte forbindelser. Raw NMR og MS-data av disse forbindelsene er gratis tilgjengelig via Internett på https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.880755.
doi:10.1371/journal.pone.0091476.s002
(PDF)
Acknowledgments
TN og MSH takke Cyano Biotech GmbH for støtte og tillatelse til å publisere dette manuskriptet. Vi takker R. Lethaus-Weiß for hennes hjelp i å dyrke cyanobakterier stammer og utpakking av biomasse, og P. Schmieder og B. Schlegel (FMP Berlin-Buch) for opptak av NMR-spektra.
