Abstract
Rollen mesothelial lag i peritoneal spredning av kreftceller er bare delvis avklart. Her forsøkte vi å bedre definere mesothelial bidrag til tumorcelle adhesjon ved bruk av en direkte adhesjon test anvendt på humane primære kulturer av mesothelial celler (HPMCs) avledet fra peritoneal vask av pasienter med gastrisk og kolorektal kreft. Gastric og kolon carcinoma celler ble sådd på ulike mesothelial monolag og kvantitativ fluorescens analyse ble utført for å analysere deres vekst og klebeegenskaper. Adhesjonen av kreftceller ble ikke påvirket av opprinnelsen til de HPMCs når avledet fra pasienter med forskjellige typer kreft, eller med godartet sykdom. I motsetning til dette, den høye nivåer av ekspresjon og ICAM1 ROS-produksjon, noe som karakteriserer disse senescent mesothelial celler, forsterket tumorcelle adhesjon. Disse resultater antyder at mesothelial adhesive egenskaper er avhengig av cellealdring, mens blir ikke påvirket av tumormiljøet. Bruken av peritoneal vasker som en kilde for å isolere HPMCs gir en praktisk og pålitelig verktøy for in vitro analyse av mesothelial forhold som påvirker peritoneal karsinomatose
Citation. Ranieri D, Raffa S, Parente A, Rossi Del Monte S, Ziparo V, Torrisi MR (2013) høy vedheft av kreftceller til mesothelial Monolag Avledet fra bukhuleutvasking av disseminert Gastrointestinale Kreft. PLoS ONE 8 (2): e57659. doi: 10,1371 /journal.pone.0057659
Redaktør: Giuseppe Viglietto, Universitetet Magna Graecia, Italia
mottatt: 9. oktober 2012; Godkjent: 24 januar 2013; Publisert: 25 februar 2013
Copyright: © 2013 Ranieri et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble delvis støttet med tilskudd fra MIUR og fra AIRC – Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (IG 10272), Italia. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
peritoneal spredning av mage og kolorektal kreft representerer en hyppig hendelse som skjer etter kurativ reseksjon [1] – [3]. Kritisk for peritoneal tilbakefall er vedheft av de frie spres kreftceller til mesothelial lag og mange forskjellige molekylære mekanismer som er direkte involvert i denne prosessen har blitt identifisert [4]. For peritoneal karsinomatose må kreftcellene kunne overleve i bukhulen, når løsrevet fra den primære svulsten, og må vise en proliferativ og invasiv atferd, når levd opp til mesothelium. Mens mange studier har vært rettet til analyse av ekspresjon og aktivering av molekyl trasé ansvarlig for de etterfølgende biologiske endringer av de forskjellige typer kreftceller [5] – [7], bare et begrenset antall rapporter har fokusert på bidrag mesothelial lag i adhesjon og peritoneal spredning av kreft [8] – [10].
for detaljert analyse av molekylære mekanismer som påvirker klebetrinnet, forskjellig in vitro eller ex-vivo-modeller er blitt utviklet [11] – [13] og primære kulturer av mesothelial celler er blitt oppnådd for å teste adhesjonen av kreftceller i nærvær av å fremme eller interfererende midler [8], [12]. De fleste av disse modellene utnytte enten etablerte cellelinjer eller primærkulturer av humane mesothelial celler isolert fra omentfaktorene fragmenter [10], [14] – [15]. Men det har vært foreslått at også de peritoneale LAVAGES, blir gullstandarden for å vurdere tilstedeværelse av peritoneal formidling av mage og tykktarmskreft [16] – [18], er et godt og mer praktisk kilde for mesothelial celler som skal formeres in vitro [19], selv om deres anvendelse i ko-kultur-modeller ikke er blitt utforsket.
adhesjonsmolekyler spiller en viktig rolle i trinnet involverer festing av de frie kreftceller til det peritoneale overflaten [4] og cytokiner, slik som interleukin 1SS (IL1ß) og tumornekrosefaktor α (TNFa) utgitt i den inflammatoriske mikromiljøet, er kjent for å fremme deres ekspresjon [20], [21]. Blant de adhesjonsmolekyler som spiller en viktig rolle i spredning av de neoplastiske celler til mesothelial monolaget, flere studier peker til den spesifikke funksjon av den intercellulære adhesjonsmolekyl 1 (ICAM1) som er tilstede på mesothelial celler i å fremme prosessen [10], [21]; I tillegg er det blitt vist at opp-modulering av dets ekspresjon, som et resultat av oksidativt stress og begynnende alderdom av de peritoneale celler, fremmer adhesjonen av neoplastiske celler fra ovarie, mage og tykktarm kreft [22] – [24], demonstrere den generelle og avgjørende rolle ICAM1 i sprednings.
i forsøket på å bedre definere mesothelial bidrar til adhesjonen av kreftceller og, spesielt, den mulige rollen til mesothelial aktivering i en kreft miljø ligne in vitro så mye som mulig in vivo betingelser, har vi her brukt en direkte adhesjon test utført på humane primære kulturer av mesothelial celler (HPMCs) avledet fra peritoneal vask av pasienter med gastrisk og kolorektale tumorer eller fra pasienter med godartede sykdommer i rekkefølge for å etterligne in vitro så mye som mulig in vivo betingelser. Med sikte på å minimere mulige variasjoner som skyldes svulst motstykke, matchet vi forskjellige isolerte HPMCs, dyrket også på ulike nivåer av alderdom, med to godt kjente kreftcellelinjer. Våre resultater viser at klebe oppførselen til kreftceller ikke er påvirket av opprinnelsen til de HPMCs fra pasienter med forskjellige tumorer. Imidlertid våre observasjoner bekrefter rollen til peritoneal senescence, gjennom øket produksjon av reaktive oksygenforbindelser og av ICAM1 ekspresjon, for å fremme tumorcelle adhesjon [22] – [24], og tyder på at bruken av peritoneal vask som en kilde å isolere og forplante HPMCs enkelt kan brukes til å vurdere in vitro delstaten mesothelium hos kreftpasienter.
Materialer og metoder
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP
den menneskelige mesothelial Met- 5A-cellelinjen [25] ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles /F12 medium (DMEM /F12) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) pluss antibiotika og hydrokortison (0,1 ug /ml), insulin (2,5 ug /ml), transferrin (2,5 ug /ml) og selenium (2,5 ng /ml) (Sigma Chemicals Co., St. Louis, MD, USA). Det humane kolorektal adenokarsinom Caco2-cellelinje [18], [26] ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 10% FBS, pluss antibiotika (Sigma). Den menneskelige adenokarsinom i ventrikkel AGS cellelinje [18] ble dyrket i Hams F12 Medium (Sigma) supplert med 10% FBS pluss antibiotika (Sigma).
primærkulturer og co-kulturer
Primære kulturer of human peritoneal mesothelial celler (HPMCs) ble hentet fra intraoperativt peritoneal LAVAGES [18] av pasienter rammet av peritoneal karsinomatose fra kolorektal kreft (# 062) eller magekreft (# 219), samt for pasienter som lider av ikke-kreft sykdom (# 002), som gjennomgikk kirurgi ved en enhet av Surgery av Sant’Andrea Hospital. Donor clinicopathological egenskaper er beskrevet i tabell 1. Alle pasientene ble i stor utstrekning informert og gav skriftlig samtykke for undersøkelsen. Protokollen av studien ble godkjent av Etisk Board of Sant’Andrea Hospital, Roma.
For å unngå mulig aktivering av peritoneal celler ved kirurgisk prosessen, peritoneal LAVAGES ble oppnådd ved utgangstrinn av operasjonen. Fra hver pasient, ble 40 ml av peritoneal vask oppsamlet i EDTA (50 uM). Peritoneal vaskinger ble sentrifugert ved 1100 rpm i 5 minutter ved RT og pelletert. Prøvene ble resuspendert for magnetisk merking i 80 ul av MACS® separasjonsbuffer (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). For å fjerne epitelcelledifferensiering komponent fra peritoneal vask og følgelig å berike mesothelial del, Immunomagnetisk uttømming bruker anti-CD326 /EpCAM mikroperler (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Tyskland) ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet, MS separasjonskolonner (MACS®, Miltenyi Biotec) var blitt ekvilibrert med 0,5 ml MACS® atskillelse buffer og mikroperlene merkede cellene ble underkastet magnetfeltet trau i kolonnen passasje. De CD326 negative celler ble vasket bort fra kolonnen, og ble utsådd i DMEM /F12 som ovenfor.
For adhesjonsegenskapene eksperimenter, Met-5A eller HPMCs ble dyrket til konfluens og etter 24 Caco2 eller AGS celler ble sådd på monolaget.
morfologisk analyse av HPMCs
for det HPMCs morfologisk analyse ble kultur prøvene observert på et Zeiss Axiovert 200 invertert mikroskop utstyrt med fasekontrast (DIC) optikk (Zeiss, Oberkochen , Tyskland). Kvantitativ analyse av multinucleated og multivacuolated-celler ble utført ved telling for hver cellekultur, en total på minst 250 celler observert i fem mikroskopiske områder tilfeldig tatt fra tre forskjellige eksperimenter. Alle resultater ble uttrykt som middelverdier ± SE. Betydning ble beregnet ved hjelp av Kruskal-Wallis test eller paret Student t-test.
P
verdier 0,05 ble betraktet som statistisk signifikant
immunfluorescens
For HPMCs karakterisering cellene ble dyrket på Dekk og festes med 4% paraformaldehyde fulgt av behandling med 0,1. M glysin i 20 minutter ved 25 ° C og med 0,1% Triton X100 i ytterligere 5 minutter ved 25 ° C for å tillate permeabiliseringen. Cellene ble deretter inkubert i 1 time ved 25 ° C med følgende primære antistoffer: anti-cytokeratins (gjenkjenne CK8 og CK19 blant annet CKs) (1:100 i PBS, klone MNF116, Dako, Glostrup, Danmark) monoklonalt antistoff; anti-vimentin (1:100 i PBS, klone V9, Dako) monoklonalt antistoff; anti-calretinin (1:100 i PBS, klone DAK Calret 1; Thermo Fisher Scientific Inc., Fremont, CA, USA) monoklonalt antistoff; anti-CEA (1:100 i PBS, Zymed, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) polyklonale antistoffer; anti-EpCAM (1:10 i PBS, Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Tyskland) monoklonalt antistoff direkte konjugert med PE; anti-ICAM1 (1:10 i PBS; Stemcell Technologies, Vancouver, BC, Canada) monoklonalt antistoff direkte konjugert med FITC
ukonjugerte primære antistoffer ble visualisert etter passende vasking med PBS, ved bruk av geit-anti-mus. FITC (1:50 i PBS, Cappel Forskning Produkter, Durham, North Carolina), geit anti-mus Texas Red (1:200 i PBS, Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, USA), geit anti-kanin FITC (1: 400 i PBS, Cappel Research). Å identifisere sykkel celler, ble farging utført med anti-Ki67 kanin polyklonale antistoffer (1:50 i PBS, Zymed Laboratories, San Francisco, CA). Kjerner ble farget med 4 «, 6-diamidino-to-phenylindole (DAPI) (1:10.000 i PBS, Sigma). Dekk ble endelig montert med 90% glycerol i PBS for observasjon. Fluorescens signaler ble visualisert med ApoTome System (Zeiss) forbundet med en Axiovert 200 invertert mikroskop (Zeiss) og bildeanalyse ble utført av Axiovision programvare (Zeiss) og KS300 bilde analysator programvare (Zeiss).
Prosentandel EpCAM /Ki67 positive celler i co-kulturer av MET-5A og AGS eller Caco2 celler ble analysert teller totalt 500 celler tilfeldig observert i 5 mikroskopiske felt for hver ulike tidspunkter (1 t, 24, 48h) i løpet av tiden løpet av forsøket. Andel ICAM1-positive celler i HPMCs ble analysert telling for hver primærkultur totalt 300 celler, tilfeldig observert i 10 mikroskopiske felt fra tre forskjellige eksperimenter. Kvantitativ analyse av ICAM1 fluorescensintensitet ble utført ved analyse av 100 celler for hver prøve i fem forskjellige områder, tilfeldig tatt fra tre forskjellige eksperimenter. Alle resultater ble uttrykt som middelverdier ± SE. Betydning ble beregnet ved hjelp av Kruskal-Wallis test eller Student t-test;
p
verdier 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Heft analysen
Subkonfluente Caco2 eller AGS celler ble trypsinert og resuspendert i DMEM serumfritt og merket med 5 pl /ml Vybrant®DiI løsning (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ved inkubering i 30 minutter ved 37 ° C. De DII-merkede celler ble vasket tre ganger og resuspendert i DMEM /F12 som ovenfor. De merkede-celler ble sådd direkte på mesothelial monolaget (25 x 10
3 /cm
2 av monolayer) og inkubert i 1, 24 og 48 timer. Ved adhesjonstesten analyser med anti-ICAM1 blokkerende antistoff (Stemcell Technologies), ble inkubering utført i nærvær av forskjellige fortynninger (1:10, 1:5 og 1:2) av antistoffet. Et ubeslektet antistoff (anti-cytokeratins, klon MNF116; Dako) ble anvendt som negativ kontroll ved 1:02 fortynning. Ikke-adherente celler ble fjernet ved tallrike vaskinger med serumfritt medium, og adherente celler og HPMCs monolag ble fiksert med 4% para-formaldehyd, etterfulgt av behandling med 0,1 M glysin i 20 minutter ved 25 ° C og med 0,1% Triton X-100 for ytterligere 5 minutter ved 25 ° C for å tillate permeabiliseringen. Kjerner ble farget med DAPI. Kjerner ble farget med DAPI (4 «, 6-diamidino-2-phenylindol) (1:10.000 i PBS, Sigma). Kvantitativ analyse av DII-positive celler /mm
2 ble utført ved å telle antallet av positive celler i 10 forskjellige optiske felt av 2,24 mm
2, tilfeldig tatt fra tre forskjellige eksperimenter. Resultatene er uttrykt som middelverdier ± SE. P-verdier ble beregnet ved hjelp av Kruskal-Wallis test og signifikansnivå ble definert som p. 0,05
reaktive oksygenforbindelser deteksjon
For reaktive oksygenforbindelser (ROS) deteksjon, HPMCs celler ble inkubert med 2 «, 7»-dichlorofluorescein diacetat (DCFH-DA, Fluka) (5 uM) i 10 minutter ved 37 ° C, vasket grundig med PBS og umiddelbart observert under en Axioskop 2 mikroskop utstyrt med Pascal LSM 5 konfokal laser-skanning (Zeiss, Oberkochen , Tyskland) ved anvendelse av en argon-laser med en 488 nm eksitasjon band. Utslippslangpasning var en 505 filter: laser intensitet, pinhole innstillinger diameter og photomultiplier ble holdt konstant for hvert eksperiment [27]. For optimalisering av fremgangsmåten, HPMCs # 062 ved passasje 2 ble behandlet med pro-oksidant Kumen hydroperoksyd (Fluka Chemika, AG, Buchs, Sveits) i forskjellige doser (100 og 200 uM) i nærvær eller ikke av anti-oxidant vitamin E (15 ug /ml) før det avhengighet av DCFH-DA. Fluorescensintensiteten (FUI, fluorescensintensitet Units) ble målt med Zeiss KS300 bildeanalysator programvare (Zeiss) evaluering av minst 200 celler for hver tilstand i tre forskjellige mikroskopiske felt. Dataene som er presentert er uttrykt som middelverdier ± SE fra tre forskjellige eksperimenter. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av paret Student t test og betydning nivået har blitt definert som
p
0,05
Den generasjonen av basal intracellulær ROS ble også målt ved cytofluorimetric analysen.. De # 062 HPMCs, behandlet med DCFH-DA som ovenfor, ble trypsinert, pelletert, resuspendert i forvarmet medium og samlet med MACSQuant® Analyzer flowcytometer (Miltenyi Biotec GmbH). Eksitasjon og emisjonsbølgelengder var 488 og 525 nm henholdsvis (FL2 kanal). Den grønne fluorescens signal ble analysert ved MACSQuantify® programvare (Miltenyi Biotec GmbH) og visualisert på et tre tiår log skala. Den midlere fluorescensintensitet (MFI) ble beregnet ut fra tre uavhengige eksperimenter med evaluering på minst 20.000 hendelser for analyse og uttrykt som relativ fluorescens intensitet (gjennomsnitt ± SE). Statistisk analyse ble utført ved hjelp av paret Student t-test med signifikansnivå definert som
p
. 0,05
Resultater
Optimalisering av in vitro test for evaluering av heft kreftceller til mesothelial monolagene
en av de første viktig steg i peritoneal metastatisk spredning av gastrointestinale svulster er vedheft av kreftceller til å mesothelial mono [4]. For å studere biologiske oppførsel av både kreft og mesothelial celler og å vurdere sine egenskaper vedheft, vi først valgt og tilpasset våre forhold en co-kultur system og en in vitro test for adhesjon (Fig. 1A), tidligere brukt for eggstokkreft [12]. Den humane mesothelial cellelinje Met-5A ble dyrket ved konfluens og humane gastriske adenokarsinomceller (AGS cellelinje) eller humane tykktarm carcinoma-celler (Caco2-cellelinje) ble sådd ut i ko-kultur med en tetthet på 25.000 celler /cm
2 av mesothelial monolag
A) Skjematisk tegning av ko-kultursystem og adhesjonstesten ble benyttet gjennom hele undersøkelsen. kreftceller sås på et mesothelial monolag å evaluere celleadhesjon. B) MET-5A mesothelial cellelinjen ble dyrket ved samløpet og AGS eller Caco2 celler ble sådd på mesothelial monolag i co-kultur (25.000 celler /cm
2). Etter 24 timer fra såing, ble ko-kulturen fast, permeabilisert og farget med et primært antistoff rettet mot vimentin, etterfulgt av en sekundær Ab merket med FITC fluorocrome (grønn) for å identifisere de mesothelial celler. Dobbel immunfluorescens med α-EpCAM PE antistoff (rød) ble utført for å gjenkjenne kreft epitelceller. Cellular kjerner ble farget med DAPI (blå). Den immunfluorescens analyse avslører de ulike celletyper i vår co-kultur modell. Signalet som tilsvarer vimentin i cellemonolaget er forenlig med det mellomliggende filamenter, som perinukleære cytoplasmatiske bunter, mens den EpCAM farging er forbundet med plasmamembranen til kreftceller. Begge AGS og Caco2 celler vises enten i små klynger eller isolert og strengt tilhenger til mesothelial cellene. Bar: 10 mikrometer. C) fasekontrastmikroskop brukes til å verifisere integriteten til mesothelium enkeltlag. Etter 48 timer fra seeding, de heft Caco2 cellene vise et mønster av stadig i kompakte øyer, mens AGS man følger cellene vise en mer flat form og en isolert mønster av vekst. Bar: 100 mikrometer. D) proliferasjonsanalyse utført ved immunofluorescens farging med et primært anti-Ki67-antistoff, som identifiserer sykkel celler, etterfulgt av en sekundær FITC-merket Ab (grønn). De tumorceller ble merket med anti-EpCAM PE Ab som ovenfor. Etter 48 timer fra såing, fordelingen av kreft celler positive for den Ki67 atom signal viser en forskjellig oppførsel av tumorvekst: forskjellig fra de isolerte AGS cellene, blir det Ki67
+ Caco2-celler som ligger ved periferien av øyene. Bar. 100 mikrometer
For å identifisere de ulike celletyper i vår co-kultur modell, brukte vi immunfluorescens (IF) mikroskopi. Etter 24 timer fra såing, for å gjenkjenne mesothelial cellene som utgjør Met-5A monolaget, farget vi de ko-kulturer med et primært antistoff rettet mot vimentin, en komponent av de mellomliggende filamenter av cytoskjelettet, etterfulgt av en sekundær Ab merket med FITC fluorocrome (grønn): signalet var forenlig med strukturen og lokalisering av vimentin, som vises som perinukleære cytoplasmatiske bunter av filamenter (figur 1B.). Kreftcellene ble merket med α-EpCAM PE-antistoff, som gjenkjenner en human epitelial adhesjonsmolekyl og direkte konjugert til fluorkrom PE (red): det tilsvarende signal var forbundet med plasmamembranen til cellene adherente til monolaget (Fig. 1B) . De cellulære kjerner ble farvet med DAPI (blå). Både AGS og Caco2-celler viste seg enten i små klynger eller isolert og strengt vedheftende til mesothelial celler (Fig. 1B).
For bedømmelse av de klebende egenskaper hos kreftceller, anvendte vi fasekontrastmikroskopi, noe lov til å verifisere mesothelium mono og fjernet enhver tvil om muligheten for kreftceller fester seg til glasset eller plast støtte. Den morfologisk analyse etter 48 timer fra seeding viste at heft Caco2 cellene vises et mønster av stadig i kompakte øyer (Fig. 1C). I motsetning til dette ble de AGS adherert celler kjennetegnet ved en mer avflatet form og en mer isolerte vekstmønster (fig. 1C).
For bedre å forstå den biologiske oppførsel observert i fasekontrastmikroskop, og for å evaluere formeringshastigheten av heftende celler, brukte vi IF analyse med Ki67 markør som identifiserer sykkel celler. Etter 48 timer fra såing, ble ko-kulturene farget med et primært anti-Ki67-antistoff, etterfulgt av en sekundær FITC-merket Ab (grønn). De tumorceller ble merket med anti-EpCAM PE Ab som ovenfor. Mens den proliferative frekvensen av de to fester seg celletyper, evaluert som prosentandelen av cellene som var positive for den Ki67 atom signalet var sammenlignbare (21% ± 2 og 23% ± 2 for Caco2 og AGS-celler respektivt; Kruskal-Wallis test:
p
= NS), deres fordeling viste en forskjellig oppførsel av kreftceller (fig. 1D). Faktisk, i motsetning til AGS celler, Ki67
+ Caco2-celler ble plassert i periferien av øyene, som forventet fra deres spontane evnen til å differensiere in vitro [26].
For en kvantitativ evaluering av adhesjon av de to kreftcellelinjer til Met-5A enkeltlag, brukte vi de lipofile cellular tracer DII å merke kreftcellene før vedheft test [12]. Figur 2A viser de resultater som oppnås ved den samtidige anvendelse av DII og DAPI farging av ko-kulturer ved forskjellige tidspunkter (1H, 24h, 48h) fra såing. Bilder av 10 forskjellige optiske felt ble tilfeldig tatt som beskrevet i materialer og metoder. Numrene på DII
+ kreftceller pr mm
2 ble deretter beregnet og statistisk analysert som beskrevet i materialer og metoder. Resultatene i figur 2B viste at både Caco2 og AGS celler ble holde mesothelial monolaget i lik mengde på 1 time av co-kultur. Imidlertid adhesjon av Caco2-celler hadde en tendens til å doble etter 24 og 48 timer, mens AGS-celler, selv om litt men betydelig økning i antall, i løpet av tidsrommet, var mindre tallrike enn de Caco2-celler ved enten tidspunkter (
p
0,05). Fordi den proliferative hastighet av de to celletypene ved 48 timer, som beskrevet ovenfor, avslørte ikke forskjeller som kan forklare den høyere antall Caco2-celler fester seg til monolaget sammenlignet med AGS cellene, resultatene av den DII-basert test viste å reflektere reelle forskjellige klebeegenskaper.
A) Met-5A mesothelial enkeltlag ble dyrket som beskrevet ovenfor. Caco2 og AGS-celler ble merket med DII tracer og deretter sådd på monolaget som ovenfor. Etter 1, 24 og 48 timer, ble co-kulturer vasket, fikset og permeabilized. Kjerner ble farget med DAPI. Bar: 200 mikrometer. B) Kvantitativ analyse av antallet av adherende DII
+ celler /mm
2 ble utført som beskrevet i materialer og metoder. Mens etter en time av seeding både Caco2 og AGS cellene holder seg til den monolaget i lik mengde, på 24 og 48 timer tidspunkter antall Caco2 celler er nesten doblet sammenlignet med AGS, noe som øker bare litt, men betydelig over tid . Resultatene er uttrykt som middelverdier ± IC 95%. Statistikk: Student t-test:
* p
0,01 vs AGS en time;
** p
0,001 vs Caco2 en time og AGS 24 timer; ***
p
0,01 vs AGS 1 time og
p
= NS vs AGS 24 timer; ****
p
. 0,001 vs Caco2 24 timer
Adhesjon av kreftceller til primære humane mesothelial enkeltlag avledet fra peritoneal vasker
For å vurdere mulig rolle i mesothelium i adhesjonen ferd med kreftceller i vår ko-kultursystem, vi brukte ovennevnte test med primære kulturer av mesothelial celler oppnådd fra peritoneal vask av pasienter påvirket av peritoneal karsinomatose fra kolorektal eller magekreft og ikke- carcinoma sykdom. Faktisk representerer peritoneal lavage en praktisk kilde til mesothelial celler [19], i stedet for å benytte omentum fragmenter.
For å karakterisere de menneskelige peritoneal mesothelial celler (HPMCs), oppnådd som beskrevet i materialer og metoder, brukte vi immunofluorescens-mikroskopi (fig. 3). For å anerkjenne de primære mesothelial celler fra andre celletyper som er tilstede i det peritoneale vaske, såsom fibroblaster og epiteliale kreftceller, farget vi kulturene med en kombinasjon av antistoffer rettet mot kjente mesothelial markører, slik som vimentin, cytokeratins (CK8 og CK19) og calretinin. For å være sikker på at cellene var av mesenchymale opprinnelse og ikke epitelial, vi brukte parallelt samme antistoffer på Caco2 celler. Resultatene viste at HPMCs var positive for begge vimentin og cytokeratin flekker, som fremkom som perinukleære cytoplasmatiske bunter av intermediære filamenter (fig. 3, venstre paneler). Som forventet, ble Caco2-celler negativt farget for vimentin og positivt merket for cytokeratins (fig. 3, høyre panel). For å utvetydig diskriminere HPMCs fra fibroblaster muligens til stede i våre kulturer, ble cellene merket med antistoffer mot calretinin, en intracellulær kalsiumbindende protein som tilhører troponin-C super uttrykt i mesothelial celler: signalet var i cytosoliske hot-spots (Fig. 3, panel til høyre). Igjen, epithelial Caco2 cellene var negative (Fig. 3, venstre panel). I motsetning til dette HPMCs var negative for den epiteliale markør EpCAM som ble uttrykt på plasmamembranen til Caco2-celler (Fig. 3, bunnpaneler, rødt signal) og for tumor markør carcinoembryonic antigen CEA, hvis signal var synlig enten i intracellulære flekker eller på celleoverflatene (Fig. 3, bunnpaneler, grønt signal).
Primære kulturer av humane peritoneale mesothelial celler (HPMCs) ble isolert fra peritoneal-vask, som beskrevet i materialer og metoder. Caco2 tykktarmskreftceller ble benyttet som en kontroll. Immunofluorescensanalyse ved hjelp av antistoffer rettet mot mesothelial (vimentin, CK8 og CK19 cytokeratins og calretinin) og epitelial (EpCAM og CEA) markører viser at HPMCs er positive for vimentin og cytokeratin flekker, som vises som perinukleære bunter av filamenter, så vel som for den varme -spotted calretinin signal, men er negativ for plasmamembranen EpCAM farging og for intracellulær og overflaten CEA signal. Caco2 cellene er positive for cytokeratins og dobbel positivt for EpCAM og CEA epiteliale markører synlige på celleoverflater (EpCAM, grønt signal) eller på plasmamembraner og i intracellulære flekker (CEA, rødt signal). Kjerner ble farget med DAPI. Bar: 20 mikrometer
For en kvantitativ vurdering av muligheten for de to kreftcellelinjer (AGS og Caco2 celler) til å følge ulike HPMC monolag, brukte vi Dil tracer som ovenfor for å markere. kreftceller før adhesjonstesten. For analyse vi brukt tre primærkulturer av mesothelial celler, avledet fra peritoneal vasker av pasienter uten kreft sykdom (fig. 4A), med kolorektal kreft (Fig. 4B) eller med magekreft (fig. 4C) og vi var i stand til å sammenligne bidraget av forskjellige mesothelial monolag til adhesjonen av samme type kreftceller ved forskjellige tidspunkter (1H, 24h, 48h). Den kvantitative analysen av adhesjonen av DII
+ -celler til HPMC-monolag (fig. 4A-C) viste reduserte nivåer av adhesjon i tidsrom for begge tumorcellelinjer i forhold til adhesjonstesten ble utført på Met-5A (se fig. 2B). På disse primære dyrkede monolag, de Caco2 cellene var mer tilhenger enn AGS celler på enten 24 eller 48 timer, uavhengig om opprinnelsen til de peritoneal vasker. Imidlertid, mens adhesjonen av de Caco2-celler var sammenlignbare med alle mesothelial lag, uavhengig av deres kilde fra pasienter med neoplastisk eller godartet sykdom, de AGS cellene viser store forskjeller i deres oppførsel, og viser høyere adhesjon til HPMCs fra tykktarmskreftpasient (# 062) i forhold til de HPMCs fra enten magekreftpasient (# 219), eller fra ikke-karsinom sykdom (# 002). Således, mens adhesjonsegenskapene av mesothelial monolagene vises uavhengig av kreft miljø, er vår ko-kulturmodell i stand til å detektere forskjeller mellom HPMCs.
HPMCs isolert fra peritoneal vask av en ikke-kreftpasient ( A, # 002), fra det av et kolon kreftpasient (B, # 062) og fra det av en magekreftpasient (C, # 219), ble dyrket til sammenflytende enkeltlag som ovenfor. Caco2 og AGS-celler ble merket med DII, utsådd på HPMC lag, igjen for å følge etter forskjellige tidspunkter (1, 24 og 48 timer) og deretter vasket, faste og permeabiliserte. Kjerner ble farget med DAPI. Kvantitativ analyse av antallet adherente DII
+ celler /mm
2 ble utført som beskrevet i materialer og metoder. Uavhengig om opprinnelsen til peritoneal vasker, de Caco2 cellene viser høyere nivåer av vedheft hensyn til AGS på 24 og 48 timer. Imidlertid, mens adhesjonen av de Caco2-celler er lik for alle mesothelial lag, de AGS cellene vise betydelige forskjeller, som viser høyere adhesjon til laget # 062 i forhold til # 219 og # 002. Resultatene av den kvantitative analysen er uttrykt som middelverdier ± IC 95%. Kruskal-Wallis test: A)
* p
0,05 vs AGS en time; **
p
0,01 vs Caco2 en time,
p
0,01 vs AGS 24 timer; ***
p
0,05 vs AGS 1 time og
p
= NS vs AGS 24 timer; ****
p
0,01 vs Caco2 24 timer. B)
* p
0,01 vs AGS en time; **
p
0,01 vs Caco2 en time,
p
= NS vs AGS 24 timer; ***
p
0,01 vs AGS en time,
p
= NS AGS 24 timer; ****
p
0,01 vs Caco2 24 timer. C)
* p
0,01 vs AGS en time; **
p
0,01 vs Caco2 en time,
p
0,01 vs AGS 24 timer; ***
p
0,05 vs AGS en time,
p
= NS 24 AGS timer; ****
p
. 0,001 vs Caco2 24 timer
Rolle HPMC senescence i vedheft prosessen
For å analysere vår modell bidrag av mulige cellulære og molekylære mekanismer som kan spille en rolle i de forskjellige klebende egenskaper de HPMCs, fokuserte vi vår oppmerksomhet på mesothelial senescence. Faktisk, blant de fysiologiske egenskapene til mesothelial monolaget, blir det begynnende alderdom nivået av HPMCs antas å fremme adhesjonen av kreftceller [22] – [24]. Interessant, våre HPMCs, er avledet fra peritoneal-vask i stedet for fra omentum prøver, viste allerede ved den første in vitro passasje de kjente trekk ved begynnende alderdom, som viser et forstørret morfologi, flere kjerner og cytoplasmatisk vacuolization [14].
