Abstract
Formål
mikro ustabilitet (MSI) brukes til å screene kolorektal kreft (CRC) for Lynch syndrom , og for å forutsi utfallet og respons på behandling. Den nåværende teknikk for å måle MSI krever DNA fra normale og neoplastiske vev, og ikke klarer å identifisere svulster med spesifikke DNA mismatch reparasjon (MMR) defekter. Vi testet et panel på fem kvasi-monomorfe mononukleotid gjenta markører forsterket i en enkel multiplex PCR-reaksjon (Pentaplex PCR) for å påvise MSI.
Experimental Design
Vi undersøkte en kohort av 213 CRC pasienter, består av 114 MMR-mangel og 99 MMR-dyktige svulster. Immunhistokjemisk (IHC) analyse evaluert uttrykk for MLH1, MSH2, PMS2 og MSH6. MSI status ble definert av forskjeller i kvasi-monomorfe variasjonsområde (QMVR) fra en pool av normale DNA-prøver, og måle forskjeller i allel lengder i tumor-DNA.
Resultater
Forsterkning av 426 normale alleler tillatt optimalisering av QMVR på hver markør, og fjernet kravet om tilpasset henvisning DNA for å definere MSI i hver prøve. Bruke ≥2 /5 ustabile markører som kriterier for MSI resulterte i en sensitivitet på 95,6% (95% KI = 90,1 til 98,1%) og en positiv prediktiv verdi på 100% (95% KI = 96,6% -100%). Påvisning av MSH6-mangel ble begrenset ved hjelp av alle teknikker. Dataanalyse med en tre-markør panel (BAT26, NR21 og NR27) var sammenlignbar sensitivitet (97,4%) og positiv prediktiv verdi (96,5%) til fem markør panel. Begge tilnærmingene var overlegne i forhold til standard tilnærming til måling av MSI.
Konklusjoner
En optimalisert Pentaplex (eller triplex) PCR tilbyr en lettvinte, robust, veldig billig, svært følsom og spesifikk analyse for identifisering av MSI i CRC
Citation. Goel A, Nagasaka T, Hamelin R, Boland CR (2010) en optimalisert Pentaplex PCR for påvisning av DNA Mismatch Repair-Mangel kolorektal kreft. PLoS ONE 5 (2): e9393. doi: 10,1371 /journal.pone.0009393
Redaktør: Joseph Najbauer, City of Hope National Medical Center, USA
mottatt: 03.11.2009; Godkjent: 03.02.2010; Publisert: 24 februar 2010
Copyright: © 2010 Goel et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Den nåværende arbeidet ble støttet med tilskudd RO1 CA 72851 (til CRB) og RO1 CA 129286 (til AG og CRB) fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, og midler fra Baylor Research Institute. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
mikro ustabilitet (MSI), som er definert som akkumulering av innsetting-delesjonsmutasjoner med korte repetitive DNA-sekvenser (eller «mikro «) er et karakteristisk trekk ved kreft celler med DNA mismatch reparasjon (MMR) mangel [ ,,,0],1]. Inaktivering av noen av flere MMR gener, inkludert
MLH1
,
MSH2
,
MSH6 Hotell og
PMS2
, kan resultere i MSI. Opprinnelig MSI er vist å korrelere med germline defekter i MMR gener hos pasienter med Lynch syndrom (LS), hvor 90% av tykk- og endetarmskreft (CRC) pasienter utviser MSI [2], [3]. Det ble senere kjent at MSI også forekommer i ~12% av sporadiske CRC som oppstår hos pasienter som mangler germline MMR mutasjoner, og MSI hos disse pasientene skyldes arrangøren metylering-indusert stanse av
MLH1
genuttrykk [4 ]. Fastsettelse av MSI status på CRC har klinisk bruk for å identifisere pasienter med germline defekter som disponerer for MMR-mangel. I tillegg har MSI status prognostiske og terapeutiske implikasjoner, fordi MSI CRC vanligvis har en bedre prognose, og disse kreftformene er mindre mottakelig for 5-FU-basert adjuvant kjemoterapi [5].
Siden den første oppdagelsen mer enn et tiår siden , metoder og kriterier for å avgjøre MSI i CRC har hele tiden utviklet seg. Det er imidlertid fortsatt en mangel på enighet om bruk av ulike MSI analyser som er mer robust, billig og resulterer I MSI analyser som best representerer MMR-mangel i laboratorier over hele verden [6]. I et forsøk på å forene MSI analyse i CRC, i 1997 en National Cancer Institute (NCI) verksted anbefales å bruke en referanse panel på fem MSI markører som besto av 2 mononukleotid gjenta markører (BAT26 og BAT25) og 3 dinucleotide gjenta markører (D2S123, D5S346 og D17S250) [7]. I en oppfølgings NCI verksted, panel anerkjent noen av begrensningene i de opprinnelige markører, først og fremst på grunn av inkludering av de 3 dinukleotidpolyfosfater markører [8]. For det første ble det erkjent at de dinukleotid vendende markørene var mer egnet for identifisering av MSI-L-tumorer, mens mononukleotid vendende markører var mer spesifikk og følsom for bestemmelse av MSI (eller MSI-H) CRC [9]. For det andre, på grunn av den polymorfe natur dinukleotidpolyfosfater markører, disse kreves tilgjengeligheten av ikke bare tumor men søker normalt DNA fra hver enkelt å tolke MSI resultater. Det har vist seg at et panel på fem kvasi-monomorfe mononukleotid gjenta markører i en Pentaplex PCR unngå behovet for normal DNA fra hver CRC pasient, og kan tilby bedre spesifisitet og sensitivitet enn NCI-panel markører [10].
Dessverre, til tross for sine åpenbare styrker, den Pentaplex MSI tilnærmingen har fått begrenset aksept for MSI-basert screening av CRC. Det kan være flere grunner til dette, blant annet mangel på klar forståelse på de tekniske aspektene og uavhengig validering av denne analysen. Denne studien tar for seg denne bekymringen ved å validere nøyaktigheten av Pentaplex-panel markører i en stor serie med MMR-dyktige og mangel CRC ved å analysere PCR-forsterkede profiler av hver markør i både svulsten og matchende normal DNA. Heri, viser vi en svært følsom og spesifikk Pentaplex PCR-analyse som krever engangsavgift optimalisering av kvasi-monomorfe variasjonsområde (QMVR) for hver markør i normal DNA. Vi gir bevis for at et optimalt Pentaplex PCR-analysen, skal være den foretrukne metode for MSI evaluering i kliniske og forskningslaboratorier, som den er hurtig, rimelig og svært sensitiv og spesifikk for påvisning av MMR-manglende CRC og unngår behovet for referanse normal DNA.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle pasienter gitt skriftlig informert samtykke og studien ble godkjent av institusjonelle gjennomgang styrene i Baylor University Medical Center, Dallas, USA; Universitetet i Heidelberg, Heidelberg, Tyskland; og Okayama universitetssykehus, Okayama, Japan
vevsprøver
Tumor og matchende germline DNA ble samlet inn fra 213 pasienter diagnostisert med CRC på tre ulike institusjoner:. 1) Baylor University Medical Center, Dallas , TX, USA 2) Universitetet i Heidelberg, Heidelberg, Tyskland og 3) Okayama universitetssykehus, Okayama, Japan. Blant denne gruppen, 114 svulster var MMR-mangelfull, og inkluderte 50 CRC med tap av MLH1, 48 med tap av MSH2 og 8 tilfeller hver med den eksklusive tap av PMS2 eller MSH6 proteiner. De resterende 99 tilfellene var MMR-dyktig.
MMR Protein Immunohistochemistry
Vi undersøkte protein uttrykk for MLH1, MSH2, PMS2, og MSH6 i 213 tumorvev ved immunhistokjemisk (IHC) farging hjelp DAKO EnVision system-HRP polymersystem kit (Dako Cytomation Inc., Carpinteria, CA). Vevssnitt ble undersøkt med passende fortynninger av mus monoklonale antistoffer mot MLH1 (klone 13271A, BD Pharmingen, San Diego, CA), MSH2 (klone FE11, onkogen Forskning Produkter, Boston, MA), PMS2 (klon A37, BD Pharmingen San Diego, CA), og MSH6 protein (klon 44, BD Transduction Laboratories, Lexington, KY). Tumorceller ble scoret negativ for MMR protein uttrykk bare hvis epitelceller i svulstvev manglet atom flekker, mens de omkringliggende stromale celler likevel viste positiv farging.
mikrodisseksjon og DNA Amplification
Serial seksjoner (5 mikrometer) fra formalinfiksert parafin-embedded matchet normale og tumorvev ble rutinemessig farget, og representative normale og svulst regionene ble identifisert ved mikroskopisk undersøkelse. Genomisk DNA ble isolert fra de parafininnstøpte vev ved hjelp av QIAamp DNA mini kit (Qiagen, Valencia, CA) Følgende separasjon av tumor og normalt vev ved manuell mikrodisseksjon.
Pentaplex PCR og kvasi-monomorfe Variasjon Range (QMVR ) Definisjon av
MSI analyse ble utført ved hjelp av fem mononukleotid gjenta mikro mål (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 og NR-27) i et Pentaplex PCR system [10]. Primersekvenser er blitt beskrevet tidligere, og hver forstand primer ble endemerket med en av de fluoriserende markører: FAM, HEX eller NED [11]. Pentaplex PCR ble utført i en MJ Forskning DNA 200 multicycler (Biorad, Hercules, CA). PCR-betingelsene bestod av en initiell 15 min denatureringstrinn ved 95 ° C, etterfulgt av 35 sykluser ved 95 ° C i 30 s, 55 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 s, med en endelig forlengelse ved 72 ° C i 10 min. Forsterkede PCR produktene ble fortynnet med formamid, og kjøre på en Applied Biosystems 3100 Avant automatisert kapillær elektroforese DNA sequencer. Allele størrelser for hver av markørene ble estimert ved hjelp GeneMapper 3.1 programvare (Applied Biosystems, Foster City, California).
For fastsettelse og validering av kvasi-monomorfe variasjonsområde (QMVR) for hver av de fem MSI markører, PCR-amplifikasjon profiler ble bedømt hver for seg, og størrelsen på begge allelene ble bestemt for hver markør og for hver tumor individuelt som tidligere beskrevet [11]. For beregning formål, på grunn av monomorfe natur disse markørene beregnet vi hvert allel størrelse to ganger i homozygote prøver.
Fastsettelse av Alleliske Variasjoner i Tumor DNA i forhold til normal DNA
Deretter undersøkte vi om tilgjengeligheten av matchende normal DNA fra en CRC pasienten ville forbedre screening ytelsen til Pentaplex PCR i MMR mangel CRC. Vi beregnet forskjellene i allele lengder mellom tumor og normal DNA for hver pasient og hver MSI markør. I hvert fall betraktet vi den korteste allelet stede i tumor eller normal DNA for beregningsformål ved hjelp av følgende formel:
(Forskjeller i allel lengde) = | (Normal DNA allel) – (Tumor DNA allelet) | (Bp)
Hvis PCR fragment fra svulst DNA avslørte to topper, vi vurderte kortere toppen representant for svulst DNA.
MSI Analyse av NCI-Panel Markers
å sammenligne sensitivitet og spesifisitet Pentaplex PCR med den opprinnelige NCI-panel av markører (BAT25, BAT26, D2S123, D5S346 og D17S250), utførte vi MSI analyser på et delsett av 86 MMR-mangel CRC og 37 MMR dyktige CRC hjelp begge metodene [7]. Primere for hver av de 5 markørene ble tidligere beskrevet [12], [13].
Statistiske analyser
Vi brukte logistisk regresjonsanalyse for å undersøke diagnostisk ytelse for MMR mangel CRC benytter ulike strategier for å definere MSI. For å undersøke sammenhengen mellom individuelle MSI markører, ble en multivariat sammenheng og hierarkisk clustering analyse utført ved hjelp av standardiserte absolutt forskjell lengde mellom svulst allel og kimcellelinje /normal allel. Analysene ble utført ved hjelp av JMP (versjon 6.0, SAS Institute). Alle rapporterte P-verdier er tosidig og P . 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
MMR-Mangelfull og MMR-Dyktige CRC
For å bestemme nøyaktigheten av en Pentaplex PCR system for å detektere MMR mangel CRC undersøkte vi en kohort av 213 CRC som består av 114 MMR-mangel og 99 MMR-dyktige svulster. Tabell 1 viser kliniske kjennetegn MMR-dyktige og -deficient CRC.
Fastsettelse og optimalisering av QMVR for hver markør ved Normal DNA
Selv om de fem enkelt-repeat markører i Pentaplex PCR har blitt foreslått å være svært monomorfe i germline DNA fra et bredt spekter av populasjoner over hele verden, suksessen av denne MSI analysen tungt avhengig av nøyaktig bestemmelse av QMVR for hver markør i normal DNA [11]. Teoretisk den QMVR for hver markør skal være konstant i hvert eksperimentelle omgivelser, men dataene indikerer at spesifikk instrumentering eller reagenser kan delvis påvirke allel størrelsesmålinger for hver markør [11]. Dette mandater engangs forsiktig fastsettelse av QMVR i germline DNA før svulsten MSI analyse. Vi PCR forsterket 426 alleler fra 213 normale DNA-prøver for å fastslå QMVR for hver MSI markør. Som vist i figur 1, er det polymorfe området for hver MSI markør i normal DNA som følger: NR 27 (82-87 bp), NR21 (102-106 bp), NR24 (120-125 bp), BAT25 (142-148 bp), og BAT26 (174-179 bp). Den vanligste allelet for hver av markørene var som følger: NR27 (85 bp), NR21 (105 bp), NR24 (123 bp), BAT25 (145 bp) og BAT26 (178 bp). I motsetning til tidligere studier som brukte friske personer for å generere QMVR for hver markør [11], ble QMVR verdier i vår studie basert på en stor serie med matchende normale DNA-prøver hentet fra CRC pasienter. Vi la merke til at våre mest vanlige alleler var kortere for hver markør (BAT26 av en bp, NR21 NR27 av 2 bp og BAT25 NR24 av 3 bp) og derfor optimalisert QMVR ble flyttet litt mot venstre som indikert av grå skraverte områdene i Figur 1A. Deretter vurderte vi en svulst å være positiv for allel variant (eller ustabil) ved en gitt markør når svulst allel størrelser ikke faller innenfor optimalisert QMVR. Støtte til spesifisitet av vår nylig optimalisert QMVR, bemerket vi at nesten alle forsterkning profiler fra alle MMR-dyktig svulster falt innenfor dette området, mens nesten alle MMR-mangel svulster viste store allele variasjoner på flere markører og var utenfor dette området (Figur 1B ).
A) Allele størrelsesfordeling (i basepar) fra 213 normale DNA-prøver. For hver markør, indikerer blå skyggelegging den justerte QMVR, mens den grå skyggelegging indikerer hele spekteret av allel størrelse hentet fra 426 germline alleler. B) Fordeling av allel størrelser i MMR-mangel (oransje) og MMR-dyktige (grønn) CRC.
Fastsettelse av Alleliske Variasjoner i Tumor DNA for hver markør og dens forhold til MMR Status i CRC
Vi har merket oss at på grunn av betydelig samsvar mellom MMR IHC og MSI resultater på hver markør, bruker vi IHC informasjon for beregning av cut-off-terskler som tilsvarte med tap av DNA MMR protein uttrykk og MMR-mangel. Vi definerte avskjær for hver av de fem markører ved å bestemme spesifikke allel lengdevariasjoner i hvilken minst 95% av tumorer var innenfor QMVR (ikke viste noen instabilitet) og ble samtidig MMR-dyktig ifølge IHC resultater. På denne måte lykkes fant vi ut at en allelisk forskjell fra 3 bp mellom tumor og normal tilsvarende DNA for både BAT25 og BAT26 var diagnostisk for en MSI-positiv tumor. Tilsvarende er en forskjell på 2 bp i tumor mot germline DNA for NR21, NR24 og NR27 ble ansett positiv for å definere MSI-positivitet (grå skygge firkantet boks i Figur S1)
egenskapene til
Individuell
Pentaplex markører for identifikasjon av MMR-mangel CRC
Vi neste undersøkt egenskapene til enkelt Pentaplex markører, særlig de relativt studerte NR-markører for å identifisere MMR-mangel CRC (tabell 2). Våre analyser ved hjelp av «QMVR verdier alene» tydelig fremhevet robustheten til ulike mono-markører for å oppdage MMR-mangel CRC med en
følsomhet Hotell som varierte fra 86,8% til 94,7%, og en
spesifisitet
fra 96,0% til 100%, for å identifisere MMR dyktige CRC. Av interesse, da resultatene ble gjen analysert ved hjelp av «data fra matchende normal DNA», resultatene var påfallende like, hvor hver markør vises en
følsomhet
spekter av 85,1% til 95,6% for å identifisere MMR-mangel CRC og
spesifisitet
av 95,0% til 100% for påvisning av MMR-dyktig CRC.
en optimalisert Pentaplex PCR krever ikke matchende Normal DNA til Detect MMR-Mangel CRC
Vi neste analysert resultatene av alle mono-markører i Pentaplex PCR-analyse i både MMR mangelfulle og -proficient CRC ved hjelp av to tilnærminger: første, ved å bruke «QMVR resultater alene» (figur 2A venstre paneler og tabell 3), og sekund, når data var tilgjengelig fra «søker normal DNA fra CRC-pasienter «(figur 2A, høyre panel og tabell 4). Når allele varianter på ≥3 av 5 markører ble definert som diagnose av MSI, vises begge strategiene 93,9% (CI, 87,9% -97,0%) følsomhet for identifisering av MMR-mangel CRC og 100% (CI, 96,3% -100%) spesifisitet for MMR-dyktige CRC. Med hensyn til korrelasjon av MSI data med MMR proteinekspresjon status, begge strategier, viste lignende følsomhet for tumorer med MLH1 (96,0%), MSH2 (100%), og PMS2 (100%) mangel. Men verken tilnærming var robust nok til å oppdage MSH6-mangel og identifisert bare 37,5% (3/8) av MSH6-mangel CRC (figur 2B). Derimot har når MSI-H ble definert av ustabilitet på ≥2 av 5 markører, begge strategiene viste litt bedre følsomhet for MMR-mangel CRC (95,6%; CI, 90,1% -98,1%) og samme spesifisitet for MMR-dyktigere CRC (100 %; CI, 96,3% -100%). Men denne forbedringen var bare som følge av økt sensitivitet for påvisning av MSH6-mangel tumorer (62,5%, 5 av 8 CRC), uten noen tilhørende forandring i følsomheten for identifikasjon av MLH1 (96,0%), MSH2 (100%), og PMS2 (100 %) mangelfull (figur 2B). Derfor er optimalisert Pentaplex analysen svært spesifikk og sensitiv for påvisning av MMR-mangel CRC, og at tilgjengeligheten av normal DNA fra en CRC pasient ikke nødvendigvis forbedre ytelsen. I tillegg, ved bruk av en cut-off for ustabilitet ved ≥2 /5 markører for å definere MSI resulterer i maksimal sensitivitet og spesifisitet for denne analysen, spesielt for prøver mutant for MSH6.
A) Figuren illustrerer resultatene av Pentaplex mononukleotid-repeat maker panel når definerer MSI status av tumor-DNA ved «QMVR only» (når matchet normal DNA var ikke tilgjengelig) og med «normal DNA» ved å trekke kimlinje allel lengder fra tumor for hver tumor. Data i de to panelene til venstre er fra MMR-mangel svulster, mens de to andre panelene på høyre representerer MMR-dyktige CRC. (* Indikerer ett tilfelle med tap av både MLH1 og MSH2). Sorte firkanter indikerer en positiv tumor for allelisk variasjon (dvs. ustabile) og hvite firkanter angir en svulst negativ for eventuelle variasjoner allel (dvs. stabil). B) viser hyppigheten av MMR-mangel svulster med antall markører som viser allele variasjoner når data ble analysert fra alle
fem
Pentaplex markører. C) viser frekvensen av MMR-mangel svulster med antall markører som viser allele variasjoner når data ble analysert fra bare
tre
Pentaplex markører (BAT26, NR21 og NR27).
Association mellom Pentaplex mononukleotid gjenta Markers
Vi spurte om en forening eksisterer blant enkelte mononukleotid gjenta markører, eller om ustabilitet i hver markør var en uavhengig hendelse. For dette, utførte vi multivariate korrelasjons samt hierarkisk klyngeanalyse ved å sammenligne forskjellene i alleliske størrelser oppnådd fra tumor og normal-DNA (figur 3A grønn (ingen forskjeller i allele størrelse mellom tumor og normal DNA) til rød (signifikante forskjeller i allele lengder mellom tumor og normal DNA).
Redusert Marker kombinasjonen er like effektive som alle fem Markører i Pentaplex analyse~~POS=TRUNC
Vi spurte om en redusert panel av markører kan være like effektive som alle fem markører i Pentaplex panel. For dette, vi re-analysert screening ytelsen Pentaplex PCR for å påvise MMR-mangel CRC basert på alle
fem
, eller en utvalgt panel av
tre plakater (BAT26, NR21 og NR27) markører for MSI klassifisering analyse (tabell 3 4)
Når MSI ble definert som ustabilitet på ≥1 eller ≥2 av 3 markører, nok en gang, sammenlignbare grader av sensitivitet (93,9% -97,4%) og spesifisitet. (92,9% -100%) ble erholdt. Med hensyn til MMR proteinekspresjon status, begge strategiene som vises lik følsomhet for tumorer med MLH1 (96,0%), MSH2 (100%), og PMS2 (100%) mangel. Imidlertid, som bemerket tidligere med en
fem
markør panel, en cut-off-terskel av ustabilt ved ≥2 av tre markører resulterte i økt sensitivitet for påvisning av MSH6 mangelfulle CRC (62,5%, 5 av 8 tumorer; Figur 2C). Selv om sensitiviteten til en MSI analyse ved bruk av disse kriteriene er marginalt lavere 93,9% (CI 87,9% -97,0%) sammenlignet med å bruke alle fem markører 95,6% (CI 90,1% -98,1%), spesifisiteten av denne analysen var uendret (100% med begge markør paneler)
Screening Utførelse av Pentaplex analysen er bedre enn med NCI-Panel Markers
NCI-panel av MSI markører (2 mono markører,. BAT25 BAT26 og 3 dinukleotidpolyfosfater markører, D3S1023, D5S346 D17S250) er i dag standard for MSI-bestemmelse i CRC [7]. De dinukleotidpolyfosfater markører i dette panelet krever samtidig forsterkning av matchet normal DNA for samme pasient med CRC, og er bedre egnet for å påvise MSI-L enn MSI svulster. Siden Pentaplex markører er kvasi-monomorfe, sammenlignet vi screening resultatene av disse to MSI-analyser for identifisering av de to mest defekte MMR proteiner, MLH1 og MSH2 i vår samling av CRC. Som vist i figurene 4A B, Pentaplex markører viste bedre eller sammenlignbar sensitivitet og spesifisitet til NCI panel markører for identifisering av MMR-manglende CRC. den Pentaplex PCR Gitt denne situasjon, og har enorm generell fordel i forhold til NCI-markører, som det er mer hurtig, benytter en enkelt PCR-reaksjon, unngår behovet for normal DNA, er mindre kostbart og er svært nøyaktige.
A ) figuren viser utviklingen sammenligning mellom NCI panel markører og QMVR optimalisert Pentaplex PCR. Svarte firkantene indikerer en svulst positivt for allel variant (eller ustabil) og hvite firkantene angir en svulst negativ for noen allel variasjoner (eller stabil). De dinucleotide gjenta markører (D2S123, D5S346 og D17S250) er mindre robust enn mononukleotid gjentas for å avdekke MSI. B) Figuren illustrerer frekvensen av svulster med antall markører som viser allele variasjoner i MMR-mangelfulle og dyktige CRC. Som antydet, viser Pentaplex PCR en høyere sensitivitet og spesifisitet i forhold til NCI panel av markører, og fordelingen av endrede markører er entydig bimodal.
Diskusjoner
Målet med denne studien var for å utvikle en hurtig og meget nøyaktig MSI assay som kan tilpasses på en hvilken som helst laboratorium utstyrt med en automatisert DNA-sekvensator. Heri vi optimalisert og validert nytten av fem mononukleotid mikro markører som kan forsterkes i en enkelt Pentaplex PCR reaksjon for MSI bestemmelse i en stor serie med MMR-dyktige og mangel CRC.
MSI analyse med NCI- panel på fem mikrosatellittmarkører (2 mono- og 3 di-nukleotid-repetisjoner) fremdeles synes å være en foretrukket fremgangsmåte i de fleste kliniske og forskningslaboratorier. Dessverre, selv om flere studier har gjentatte ganger vist at mononukleotid MSI markører tilby høyere nøyaktighet for påvisning av MSI-H eller MMR-mangel svulster [10], har denne tilnærmingen ikke fått tilstrekkelig anerkjennelse eller aksept. En av de viktigste tekniske utfordringene i denne assayis behovet for forsiktig engangs optimalisering av QMVR for hvert mono-markør. Dette er fordi allelisk størrelse estimering av disse kvasi-monomorfe markører kan påvirkes ved anvendelse av spesifikke reagenser eller sekvenseringsmaskin [14]. Støtte dette konseptet, QMVR for alle merkene i vår pasientpopulasjon skilte med noen få basepar enn det som hadde blitt rapportert tidligere [11], [14]. Vi tror at QMVRs i vår undersøkelse er mer robust, da disse ble oppnådd fra det tilsvarende normale /kimlinje DNA fra en stor serie av CRC pasienter, i stedet fra friske individer som rapportert tidligere [11], [14]. Tidligere studier har fremhevet nytten av BAT25 og BAT26 markører for å identifisere MSI-positive CRC [9], men det er begrenset forståelse på følsomhet og positive prediktive verdier av NR-markører. En fersk rapport indikerte at en skjerm basert på en vurdering av bare BAT26 og NR24 kan være effektive for deteksjon av MMR-mangel CRC [15]. Faktisk BAT26 hadde høyest sensitivitet og positiv prediktiv verdi i vår kohort av MMR-mangel CRC. Tvert imot, parvis korrelasjon og hierarkisk clustering analyse i vår studie viste tydelig svakeste prediktive verdier for NR24 (og BAT25), sammenlignet med de resterende
tre
markører (BAT26, NR21 og NR27). BAT26 er en kvasi-monomorfe markør som ligger umiddelbart 3 «til
MSH2
ekson 5, og regnes for å være svært sensitiv og spesifikk for MSI testing. Men store strykninger i
MSH2 Hotell som inkluderer BAT26 locus er ikke uvanlig i CRC, og i slike tilfeller, selv om svulsten er MMR-mangelfull, PCR på BAT26 locus vil resultere i falsk negativ forsterkning av villtype-allel fra de normale cellene i tumormassen [16]. Disse data advarer mot konvensjonell visdom at selv BAT26 brukes ofte til MSI-bestemmelse, ved hjelp BAT26 alene, eller sammen med en mindre nøyaktig markør som NR24 kan undervurdere MSI, og vil være til hinder for påvisning av potensielle MMR-mangel CRC. I tillegg vår observasjon av høy følsomhet og positiv prediktiv verdi for en redusert panel av
tre
markører (BAT26, NR21 og NR27) versus alle
fem
stakere har økonomiske konsekvenser for fremtidig MSI- baserte analyser.
en annen kritisk problem med bruk av Pentaplex analysen er mangel på enighet om minimum antall ustabile markører som kreves for å klassifisere en svulst som MSI. I denne sammenheng er det rapport opprinnelige foreslåtte ≥3 /5 ustabile markører i tumor-DNA ville definere en MSI-positiv CRC [10], mens en senere studie antydet at ustabilitet bare ≥2 /5 markører var tilstrekkelig til å påvise en MMR-mangel CRC [15]. Vi revisited dette problemet ved å analysere data gjennom flere tilnærminger og våre resultater viser at sensitiviteten og spesifisiteten til Pentaplex PCR var upåvirket uavhengig av om vi betraktet som en cut-off på ≥2 eller ≥3 av 5 markører for påvisning av MLH1, MSH2 og PMS2-mangel CRC. Men foreslår at et kriterium for ≥2 av 5 ustabile markører er mer nøyaktig, så det forbedret screening resultatene av analysen ved å identifisere ytterligere MSH6-mangel svulster uten å legge noen falske positiver.
En av begrensningene av NCI-panel av markører er dens manglende evne til å identifisere MSH6-mangelfull CRC. Våre data tyder på at bruk av mono-markører i Pentaplex panelet kan identifisere de fleste MSH6 mangelfulle CRC. Dette er av betydning fordi den MutSα kompleks, en heterodimer av MSH2 og MSH6, fortrinnsvis gjenkjenner base /basis mistilpasninger så vel som små innsetting /sletting løkker som inneholder 1 eller 2 uparede nukleotider i DNA-sekvensen og dirigerer reparasjon av disse lesjonene [17] . Derfor ville en forvente at den funksjonelle tap av MutSα grunn MSH6-mangel ville føre til preferensiell ustabilitet i loci som inneholder mononukleotid gjentar [18].
Som konklusjon, presenterer vi bevis for at begunstige anvendelse av en optimalisert Pentaplex PCR system for å screene for MMR-mangel CRC. Våre data indikerer at en engangs optimalisert QMVR unngår behovet for amplifikasjon av matchet normal DNA for å bestemme ustabilitet i tumorvevet, og den ustabilitet ved ≥2 av fem markører gir den mest robuste strategi for å identifisere MMR-manglende CRC. Våre data antyder at en markør panel bestående av BAT26, NR21 og NR27 markører var så nøyaktig som den fem- markør panel for MSI analyse. Viktigst, Pentaplex markører viste en høyere følsomhet for diagnostisering MSH6-mangel CRC. Vi foreslår at denne analysen vil erstatte eksisterende metoder og bidra til å forbedre MSI-baserte CRC screening i fremtiden.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Frekvens av allel størrelsesforskjeller (i bp) mellom normal og svulst DNA på hver markør, og MSI status fastsettelse av QMVR (horisontale barer i blått og rødt på venstre side) samt av status for MMR protein uttrykk ved IHC (horisontale barer i grønt og oransje på høyre side). Tallene på Y-aksen representerer allelet størrelser forskjellen (i bp) mellom normal og tumor-DNA. Tallene i rødt reflektere mikro ustabilitet cut-off serier bestemmes for hver av markørene basert på deres avvik fra QMVR rekkevidde og IHC data
doi:. 10.1371 /journal.pone.0009393.s001
(1,59 MB TIF)
takk
Vi vil gjerne takke Johannes Gebert, PhD og Matthias Kloor, MD (institutt for patologi, Universitetet i Heidleberg, Tyskland) for sjenerøst gi tykktarm kreft prøver, og for sine nyttige diskusjoner og kritisk gjennomgang av manuskriptet.
