Abstract
Mål
For å undersøke sammenhengen mellom uttrykket av nestin en klasse VI mellomfilament protein, og patologiske funksjoner eller overlevelse hos pasienter med urothelial carcinoma av blæren (UCB).
Metoder
nestin uttrykk i tumorceller ble immunohistochemically undersøkt hos 93 pasienter med UCB som gjennomgikk radikal cystektomi med bekkenglandeltoalett. Assosiasjonene med clinicopathologic parametre ble evaluert. Kaplan-Meier overlevelsesanalyse og Cox-modeller ble brukt til å beregne effekten av nestin uttrykk på overlevelse.
Resultater
nestin uttrykk i cystektomi prøvene ble observert hos 13 av 93 pasienter (14,0% ). Nestin ekspresjon var assosiert med patologisk tumorstadium (p = 0,006). Nestin-negative pasienter hadde bedre total overlevelse sammenlignet med nestin-positive pasienter (log-rank p = 0,0148). Univariable analyse indikerte at nestin uttrykk, lymphovascular invasjon, og lymfeknute status var signifikant assosiert med kreft-spesifikke overlevelse (hazard ratio, 2,78, 2,15 og 2,80, henholdsvis). På multivariabel analyse, nestin uttrykk og lymfeknute status var uavhengige prognostiske faktorer i kreftspesifikk overlevelse (hazard ratio, 2,45 og 2,65, henholdsvis).
Konklusjoner
Resultatene tyder på at nestin uttrykk er en roman uavhengig prognostisk indikator for pasienter med UCB og et potensielt nyttig markør for å velge pasienter som kan være kandidater for adjuvant kjemoterapi
Citation. Tabata Ki, Matsumoto K, Minami S, Ishii D, Nishi M, Fujita T , et al. (2014) nestin Er en uavhengig prediktor for kreftspesifikk overlevelse etter radikal Cystektomi hos pasienter med urothelial Carcinoma av blæren. PLoS ONE 9 (5): e91548. doi: 10,1371 /journal.pone.0091548
Redaktør: Gayle E. Woloschak, Northwestern University Feinberg School of Medicine, USA
mottatt: 15 juni 2013; Godkjent: 12 februar 2014; Publisert: 02.05.2014
Copyright: © 2014 Tabata et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis av Grant-i-Aid for tredje periode omfattende kontroll Forskning for Cancer utført av Helsedepartementet, Arbeids- og velferds av Japan og All Kitasato Prosjekt Study (21-1) fra Kitasato University. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
urothelial carcinoma av blæren (UCB) er den nest vanligste kreftformen og er en av de viktigste årsakene til dødsfall hos pasienter med urogenitalsystem maligniteter [1]. Selv om de fleste pasienter til stede med overfladisk UCB, ca 50% til 70% av disse tilfellene er tilbakevendende; 10% til 15% av disse tilbakevendende tumorer videre til både muskel invasjon og lokal utvidelse, som vanligvis behandles med radikal cystectomy [2]. For pasienter med muskel-invasiv og ildfaste ikke-muskel-invasiv UCB, er standard behandling radikal cystektomi. Men til tross for fremskritt i kirurgiske teknikker og perioperativ kjemoterapi, har den generelle 10-års sykdomsspesifikk overlevelse etter radikal cystektomi forble uendret de siste tiårene [3], [4]. Selv om dagens kliniske og patologiske variabler gir viktig prognostisk informasjon i blærekreft, de har begrenset evne til å forutsi tumorresidiv eller progresjon og pasient overlevelse.
nestin er en klasse VI cytoskeletal mellomfilament protein som er uttrykt i voksende celler under utviklingsstadier i en rekke embryonale og fostervev [5]. Som svar på skade, det sentrale nervesystemet, skjelettmuskulatur, lever og kan også uttrykke nestin [6], [7]. Nestin ekspresjon i tumorer ble opprinnelig rapportert i nervesystemet ondartede sykdommer, slik som astrocytom, glioblastom, og schwannomer [8], [9]. Nylig har flere studier har rapportert at nestin kommer også til uttrykk i andre faste karsinomer [10] – [12]. I kreft i bukspyttkjertelen, korrelerer nestin uttrykk med nerve og stromal invasjon [10]. Wolfman et al bestemt at nestin er en kritisk komponent i en roman metastase sti i prostata kreft [11]. I den senere tid Ryuge et al viste at nestin ekspresjon er assosiert med en dårligere prognose og er en uavhengig prognostisk faktor for overlevelse hos pasienter med ikke-småcellet lungekreft [12]. Sammenhengen mellom nestin uttrykk og kliniske utfall hos pasienter med kreft gradvis blir avklart.
I denne studien har vi fokusert på forholdet mellom nestin uttrykk nivåer og clinicopathologic funksjoner og overlevelse hos pasienter med UCB etter radikal cystektomi.
Materialer og metoder
Pasient befolkningen
Fra mars 1990 til november 2006 133 påfølgende pasienter med UCB som gjennomgikk radikal cystektomi med bekken- og hofte lymphadenectomy på Kitasato universitetssykehus ble inkludert i denne studien. Nitten pasienter som fikk preoperativ neoadjuvant behandling, inkludert enten stråling eller cellegift, 14 pasienter som ble tapt for oppfølging, og 7 pasienter med en annen type histologi, inkludert adenokarsinom, plateepitelkarsinom, småcellet karsinom, og sarkom, ble ekskludert fra videre analyse. Ingen av pasientene hadde fjernmetastaser ved cystektomi. Av de resterende 93 pasienter, de 71 (76,3%) menn og 22 (23,7%) kvinner hadde en median alder på 64 år (fra 40-81, mener, 62,5).
Indikasjonene for cystektomi i pasienter med initial Ta, T1, eller Tis UCB inkludert intravesikal terapi svikt (
n
= 14), aggressive histopatologiske funksjoner (høyverdig svulster, carcinoma in situ [CIS], multifokal omfattende sykdom;
n
= 5), eller progresjon til muskel-invasiv kreft (
n
= 13). Seksti pasienter gjennomgikk cystektomi for en innledende presentasjon av muskel-invasiv sykdom.
2002 svulst /node /metastaser klassifiseringen ble brukt for patologisk staging, og Verdens helseorganisasjon klassifiseringen ble brukt for patologiske gradering. Lymphovascular invasjon bestemmes tilstedeværelsen av kreftceller i det endoteliale plass. Kreftceller som bare invaderte en vaskulær lumen ble vurdert negativt. Formalinfikserte, parafininnstøpte blokker som representerer de mest invasive områdene av hver tumor ble samlet inn for videre undersøkelser. Median oppfølgingstid på 38,4 måneder (range, 1,1 til 253,7, mener, 64,6) for pasienter som var i live i siste oppfølging. Når pasienter døde, ble dødsårsaken bestemmes av behandlende leger, diagram gjennomgang bekreftet av dødsattester eller dødsattester alene. Obduksjons eksemplarer av blæren urothelium fra 38 pasienter uten noen patologiske funn på malignitet fungerte som kontroller
Etiske uttalelser
Studien protokollen ble godkjent av etisk komité Kitasato universitetssykehus (Godkjent nummer.; C-09-504). Vi har fått skriftlig informert samtykke fra alle deltagerne.
Immunohistochemistry og scoret
Profiler (3 mikrometer tykk) ble deparaffinized i xylen, rehydrert i en synkende etanol-serien, og deretter behandlet med 3% hydrogenperoksyd i 10 min. Etter blokkering med 0,5% kasein i 10 minutter, ble seksjonene omsatt med 100-ganger fortynnede anti nestin polyklonalt antistoff (IBL, Takasaki, Japan) i 2 timer ved romtemperatur. Spesifisiteten av dette antistoff ble tidligere beskrevet [12]. Etter skylling i Tris-bufret saltvann (TBS; 0,01 M Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl) 3 ganger i 5 minutter hver, ble seksjonene omsatt med Histofine Simple Stain MAX-PO (MULTI, Nichirei, Tokyo, Japan) i 30 min ved romtemperatur. Seksjonene ble visualisert deretter med stabil DAB-løsning (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og kontra med Mayer hematoksylin. Batch negative kontroller brukes TBS. Alle lysbildene ble gjennomgått av to etterforskere (K.M. og Y.S.) som ble blindet av de kliniske og patologiske data. Cytoplasmatiske farging i tumorceller indikert positivitet for nestin. Den stainability av peritumoral vaskulære endotelceller ble anvendt som en intern positiv kontroll. Nestin ble bedømt ved tilsetning av prosentandelen av positive tumorceller og fargeintensitet. Prosentandelen av tumorceller ble scoret som 0 (0%), 1+ (1-25%), 2 + (26-50%), 3+ (51-75%), og 4+ (75-100%) . Fargeintensitet ble også scoret som 1+ (svak) = svakere enn endotelceller; 2+ (moderat) = det samme som endotelceller; 3+ (sterk) = sterkere enn endotelceller. Gjennomsnittet av de prosentverdier som oppnås ved triplikate målinger ble ansett for analyse. I en innledende studie, vurderte vi den diskriminerende verdien av hvert cutoff summen indeksen, som strekker seg fra 0 til 7, med hensyn til UCB egenskaper og prognose. Kaplan-Meier-analyser av serielle trinn på summen indeksen som en grenseverdi for positiv og negativ avslørte at cutoff fra 0 til positiv og negativ var den beste diskriminatoren for UCB progresjon og overlevelse (data ikke vist). Likeledes, evaluering av foreningen av denne cutoff for nestin med kliniske og patologiske egenskaper viste at 0 var den eneste cutoff for å gi statistisk signifikante funn (data ikke vist). Expression score til nestin ble stratifisert videre inn positive (poengsum ≥1) og negative (0 poeng) for presentasjon.
Postoperativ oppfølging
Hver pasient var planlagt å ha en postoperativ oppfølging hver 4 måneder for det første året, halvårlig i det andre året, og deretter årlig; hyppigere undersøkelser ble planlagt dersom det er klinisk indisert. Tjueen pasienter (22,6%) fikk adjuvant kjemoterapi (metotreksat, vinblastin, Adriamycin og cisplatin [MVAC] eller gemcitabin og cisplatin [GC]) etter kirurgi for uønskede patologiske egenskaper, herunder regionale eller fjerne lymfeknutemetastaser eller extravesical engasjement. Førti-tre pasienter (46,2%) fikk MVAC eller GC for tilbakefall av sykdommen.
Statistiske analyser
For denne analysen, svulst patologisk stadium (≤pT2 vs. ≥pT3), klasse (grad 1 og 2 vs. grad 3), og lymfeknute status (N0 vs. N1 og N2) ble evaluert som variabler dikotomert. Fisher eksakte test ble anvendt for å evaluere forbindelsen mellom kjønn, patologisk stadium, patologisk karakter, CIS, lymfeknute status, og lymphovascular invasjon. Forskjellen i alder mellom nestin uttrykk og tap grupper ble testet med Mann-Whitney
U
test. Kaplan-Meier metoden ble brukt til å beregne overlevelsesfunksjoner, og forskjellene ble vurdert med log-rank test. Multivariable overlevelse analyser ble utført med Cox regresjonsmodell, kontrollerende for nestin uttrykk, patologisk stadium og grad, samtidig CIS, og lymfeknutemetastaser. Statistisk signifikans i denne studien ble satt til p 0,05. Alle rapporterte p-verdiene er tosidig. Alle analyser ble utført med Stata versjon 11 for Windows (Stata, Chicago, IL, USA).
Resultater
Association of nestin uttrykk med clinicopathologic egenskaper
Tabell 1 oppsummerer kliniske og patologiske kjennetegn ved 93 pasienter som gjennomgikk radikal cystektomi for UCB. Staging indikerte at en pasient hadde pTis, 2 hadde PTA, 16 hadde PT1, 21 hadde pT2, 17 hadde pT3a, 19 hadde pT3b, og 17 hadde pT4 sykdom. Korrelasjonene mellom nestin ekspresjon og clinicopathologic egenskaper er også angitt i tabell 1. Cytoplasmatisk nestin-ekspresjon i tumorceller ble observert i 13 av 93 pasienter (14,0%). Den positive frekvensen av nestin var signifikant høyere hos pasienter med ≥pT3 enn i ≤pT2 sykdom (p = 0,006). Figur 1A demonstrerte representant fotografi som nestin uttrykk ikke ble observert i tumorceller. Nestin hadde cytoplasmisk ekspresjon i tumorceller (figur 1B). Nestin ekspresjon ble også observert i cytoplasma av vaskulære endotelceller og fibroblaster i tumor stroma i hvert tilfelle (figur 1 A, B).
Fotografiene er representative tumorceller som var negative (A) og positiv (B) for nestin. Nestin uttrykk ble også observert i cytoplasma av vaskulære endotelceller og fibroblaster i tumor stroma i hvert enkelt tilfelle (figur 1A, B).
Forholdet mellom nestin uttrykk og overlevelse i UCB
i løpet av en median oppfølgingstid på 38,4 måneder, 45 pasienter (48,4%) hadde tilbakefall av sykdommen, 41 (44,1%) døde av UCB, og 7 (7,5%) døde av andre årsaker. Foreningen av nestin uttrykk med frekvensen av progresjonsfri overlevelse og kreftspesifikk overlevelse og total overlevelse ble analysert ved hjelp av Kaplan-Meier analyse (Figur 2A-C). Satsen for progresjonsfri overlevelse i nestin-positive gruppen var vesentlig dårligere enn i nestin-negative gruppen (p = 0,0195, figur 2A). Vesentlig dårligere forekomst av cancer-spesifikk overlevelse og total overlevelse ble sett i nestin-positive gruppen sammenlignet med den nestin-negative gruppe (p = 0,0051 og 0,0148, henholdsvis figur 2B og C, respektivt).
( A) progresjonsfri overlevelse; (B) kreftspesifikk overlevelse; og (C) total overlevelse.
Prognostiske implikasjonene av nestin uttrykk i UCB
For å undersøke om nestin uttrykk var en uavhengig prognostisk faktor for overlevelse av pasienter med UCB, univariable og multivariat Cox regresjonsanalyser ble brukt. På univariable Cox regresjonsanalyse, nestin uttrykk, PT stadium, lymphovascular invasjon, og lymfeknute status var signifikant assosiert med tilbakefall av sykdommen, og nestin uttrykk, lymphovascular invasjon, og lymfeknute status var signifikant assosiert med cancer-spesifikk overlevelse (tabell 2). Motta cellegift etter cystektomi ikke positivt påvirke kreftspesifikk overlevelse og progresjonsfri overlevelse (data ikke vist). Ved hjelp av multivariabel Cox regresjonsanalyse ble nestin uttrykk funnet å være uavhengig prognostisk faktor for cancer-spesifikk overlevelse men marginal for tilbakefall av sykdommen (fareforhold [hr] = 2,45 og p = 0,04; HR = 2,27; p = 0,06, henholdsvis; tabell 2). I denne multivariabel analyse ble lymphovascular invasjon ekskludert som i en tidligere rapport [12] fordi i å bestemme effekten av nestin på tilbakefall eller overlevelse, kan lymphovascular invasjon være en mellomliggende faktor i veien for nestin-gjentakelse /overlevelse forholdet.
Diskusjoner
prognosen for de fleste pasienter med avansert UCB er dårlig selv etter tilstrekkelig utført radikal cystektomi og bekkenglandeltoalett [13]. Med kirurgi alene, vil 40% til 90% av pasienter med ≥pT3 sykdom har fjernmetastaser eller lokalt tilbakefall eller begge deler, og vil til slutt dø av sykdommen [4], [13]. Derfor bør perioperative ytterligere behandling inkludert systemisk kjemoterapi vurderes for pasienter med høy risiko for tilbakefall av sykdommen hvis kvalifisert basert på den enkeltes tilstand. Men for å avgrense kliniske beslutninger i valg av ytterligere perioperativ behandling for avansert UCB, klinikere trenger molekylære markører knyttet til biologisk og klinisk oppførsel av disse svulstene. For eksempel kan pasienter med en lav sannsynlighet for sykdomsprogresjon lagres bivirkninger av unødvendig systemisk kjemoterapi, mens de med høy risiko for sykdomsprogresjon kan bli oppmuntret til å motta systemisk kjemoterapi. Dermed kunne molekylære markører i tillegg til clinicopathologic funksjoner være hjelp i individuell beslutningsprosesser med hensyn til adjuvant kjemoterapi.
Denne studien avklart at nestin uttrykk i tumorceller var assosiert med progresjonsfri overlevelse, kreft-spesifikke overlevelse, og total overlevelse av pasienter med UCB (figur 2A-C). Videre er det i den multivariabel Cox regresjonsanalyse, nestin ekspresjon var et uavhengig prognostisk faktor for cancer-spesifikk overlevelse (HR, 2,45; p = 0,04, tabell 2). Selv lymfeknute status var også en uavhengig prognostisk faktor for kreftspesifikk overlevelse (HR 3,59; p 0,001) og tilbakefall av sykdommen og (HR 2,65; p = 0,006) i vår studie, lymfeknuteaffeksjon som en selvstendig risikofaktor etter cystektomi for tilbakefall og overlevelse etter cystektomi ble etablert allerede i flere studier [14], [15]. Nestin ekspresjon i stromaceller ble observert i alle tilfeller. Vi har spekulert i at stromale celler alene ikke påvirker overlevelsen eller tilbakefall uten nestin positive tumorceller, fordi stromal-celle spiller en avgjørende rolle i tumorigenese og invasjon ved å stimulere transformasjonen av normale celler til å produsere vekstfaktorer, cytokiner og kjemokiner som kan aktive tumorceller. I mellomtiden ble lymphovascular invasjon ekskludert fra multivariat Cox regresjonsanalyse i denne studien. Rollen lymphovascular invasjon som en prognostisk faktor for sykdomsutvikling og overlevelse er kontroversielt. Tidlige studier identifisert lymphovascular invasjon som en dårlig prognostisk funksjoner [16], [17]. I andre studier har imidlertid lymphovascular invasjonen var ikke en prediktor for tilbakefall eller overlevelse [14], [18], [19]. Tidligere rapporter om bukspyttkjertelen, prostatakreft, lungekreft og avslørte at nestin ekspresjon var viktig for migrering og invasjon egenskapene til tumorceller, som senere resulterte i dårlige prognoser [10] – [12]. Derfor lymphovascular invasjonen ble også ansett som en mellomliggende faktor i veien for nestin-overlevelse /gjentakelse forhold i UCB. Forrige studien også ekskludert vaskulær invasjon, lymfatisk invasjon, pleural invasjon fra multivariat analyse, og dermed justere for dem kan undervurdere effekten av nestin. I tillegg pasienter uten spredning til lymfeknuter og uten nestin uttrykk viste forlenget progresjonsfri overlevelse og kreftspesifikk overlevelse (data ikke vist). Derfor nestin uttrykk muligens hjelper kliniske beslutninger i valg av ytterligere behandling selv hos pasienter uten spredning til lymfeknuter på cystektomi.
På den annen side, epiteltumorer er heterogene populasjoner av celler med svært varierende evner til å overleve , vokse og spre [20], [21]. Tidligere rapporter antydet at en slik intratumoral heterogenitet oppstår fra genetiske og epigenetiske forskjeller i kreftceller gjennom seleksjonspress i løpet av svulst evolusjon. Nylig nye bevis støtter eksistensen av en mobil hierarki innenfor epiteltumorer. På toppen av dette hierarkiet er en kreft stamcelle (CSC) populasjonen som kan fornye seg selv og differensiere til avkom-celler, noe som resulterer i den observerte celle og funksjonell heterogenitet av epiteliale tumorer [22], [23]. Cscs har blitt isolert fra leukemi og mange faste tumorer [24], [25]. Disse cellene kan ekspanderes in vitro som tumor kuler og er i stand til å reprodusere den opprinnelige tumor når transplantert inn i mus med immunsvikt. Eksistensen av cscs har også nylig blitt rapportert i humane UCB [26]. Nylig, nestin ble rapportert som en av mulige markører for cscs i en rekke tumorer inkludert UCB [27], [28]. Tidligere rapporter antydet at svikt i kreftbehandling kan være på grunn av deres lavere effekt på cscs som beholder sin fulle kapasitet til å gjennomgå og gjenopprette tumorcellemassen. Mer nylig fra dette konseptet, CSC-målrettet terapi har blitt undersøkt i flere svulster [29], [30]. Men mangelen på pålitelig markører for identifikasjon av cscs hindrer utvikling av denne behandlingen. I denne forbindelse er nestin ikke bare en prognostisk faktor, men også kan utvide muligheten for CSC-target-behandling i UCB.
Denne undersøkelsen har iboende begrensninger i en hvilken som helst retrospektiv datainnsamling. Utvalgsstørrelsen og variasjoner i oppfølgingen kan ha begrenset vår evne til å oppdage små forskjeller. Men denne studien viser at positiv nestin uttrykket er assosiert med dårlig prognose og er en uavhengig prognostisk faktor for kreftspesifikk overlevelse hos pasienter med UCB etter radikal cystektomi. I fremtiden trenger vi en validering av denne romanen prognostisk markør ved hjelp av større kohort med langsiktig prospektiv studie.
Konklusjoner
I konklusjonen, vi har vist at nestin uttrykkes i en undergruppe av UCB, og dets ekspresjon er assosiert med clinicopathologic faktorer. Vi fant at nestin uttrykk er en roman prognostisk indikator på dårlig overlevelse for pasienter med UCB etter cystektomi; krever imidlertid sin prognostisk betydning fortsatt bekreftelse med større pasientpopulasjoner.
